細(xì)胞培養(yǎng)過程的氧氣含量測量

文/ Klaus-Peter Mang博士

本文作者就職于Mettler Toledo公司。

在沒有氧氣的情況下，無法進(jìn)行發(fā)酵和細(xì)胞培養(yǎng)——氧氣對于生命至關(guān)重要，只有在氧氣的消耗和供給之間達(dá)到良好的平衡時，才能確保細(xì)胞培養(yǎng)擁有最佳條件。那么操作者在選擇傳感器時應(yīng)該考慮什么？為何光學(xué)傳感器成為氧氣測量的趨勢呢？

氧含量和pH值是生物工程中最重要的化工過程參數(shù)，需要對其進(jìn)行監(jiān)測。兩者都會對細(xì)胞生長速度、產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量產(chǎn)生著重要的影響。因此要使各個批次的產(chǎn)品質(zhì)量保持一致，測量系統(tǒng)的選擇非常重要。其中，安裝、保養(yǎng)和系統(tǒng)安全性是用戶在使用傳感器時要特別考慮的因素。

近年來，光學(xué)傳感器（如圖1所示）主要用于氧氣的測量，與安培傳感器相比，它具有以下幾個優(yōu)勢：

●不需要極化；

●不含電解質(zhì)，因此無需加入腐蝕性化學(xué)物質(zhì)；

●初次使用前無需預(yù)處理；

●僅需極少的保養(yǎng)；

●無漂移。

圖1 光學(xué)傳感器

與使用電化學(xué)原理的電流傳感器不同，光學(xué)傳感器采用的是熒光猝滅原理，能精確快速地確定氧氣濃度（如表1所示）。幾年前，Mettler Toledo研發(fā)了Optocap元件，該元件將傳感器的光敏元件集成為一個部件，并且可以整體更換。該傳感器元件可防止傳感器聚集氣泡，從而避免了在測量信號的過程中產(chǎn)生噪聲，使氧氣測量穩(wěn)定且有效。

集成診斷簡潔明了

現(xiàn)代光學(xué)測量系統(tǒng)具有集成診斷功能，該功能會以純文本形式告知用戶何時需要更換Optocap元件，以及它在給定的過程條件下還可以使用多長時間。此外，該系統(tǒng)的計時器功能還會顯示下一次校準(zhǔn)和調(diào)整的時間。這些系統(tǒng)能夠自動檢測測量過程的穩(wěn)定性，利用校準(zhǔn)數(shù)據(jù)和當(dāng)前過程條件預(yù)先計算出可能出現(xiàn)的傳感器漂移，再通過預(yù)計的偏差校正測量值，以實現(xiàn)長期穩(wěn)定性。此外，它們還可以自動檢測清潔（CIP在線清潔）循環(huán)和滅菌或高壓滅菌（SIP在線滅菌）循環(huán)的次數(shù)，并設(shè)定CIP和SIP循環(huán)的最大連續(xù)次數(shù)。

表1 光學(xué)傳感器和安培傳感器測量方法的比較

光學(xué)傳感器測量的工作方式

物理學(xué)和化學(xué)原理的應(yīng)用

圖2 光學(xué)傳感器的信號表現(xiàn)

光學(xué)傳感器的工作原理為淬滅熒光。染料（生色團(tuán)）固定在有機(jī)硅層中，并在可更換組件（光罩）中形成光學(xué)測量系統(tǒng)的敏感部分。LED光源發(fā)出脈沖信號，刺激染料發(fā)出熒光，該熒光被引導(dǎo)至光敏檢測器。如果氧氣從測量介質(zhì)擴(kuò)散到硅層中，則熒光強(qiáng)度會降低。氧氣濃度低時的熒光信號強(qiáng)度會高于氧氣濃度高時的熒光信號強(qiáng)度。此外，反應(yīng)時間（熒光衰減時間）也不同。氧氣濃度低時染料發(fā)出的熒光比氧氣濃度高時發(fā)出的時間要長。衰減時間主要用于計算氧氣濃度。

斯特恩-沃爾默動力學(xué)關(guān)系式為光學(xué)傳感器奠定了基礎(chǔ)。在此方程式中，延時不以直接的時間單位進(jìn)行計算，而是以相位角phi進(jìn)行計算。作為參考點的參考光束直接被導(dǎo)向光檢測器，并與測量光束同時作為脈沖信號生成。在傳感器中，測量光束通過光導(dǎo)體從光源引導(dǎo)至Optocap元件，在那里產(chǎn)生的熒光也會通過光導(dǎo)體引導(dǎo)到檢測器。光學(xué)傳感器的基本信號表現(xiàn)如圖2所示。

通過PC或筆記本電腦進(jìn)行校準(zhǔn)和調(diào)整

只有精確校準(zhǔn)的測量系統(tǒng)才能提供準(zhǔn)確的測量值。光學(xué)傳感器采用的是兩點校準(zhǔn)：一是以空氣作為校準(zhǔn)介質(zhì)，空氣的組分非常恒定，包含20.95Vol-%的氧氣；二是在無氧介質(zhì)中進(jìn)行校準(zhǔn)，如純度至少為99.995Vol-%的氮氣。在空氣中進(jìn)行校準(zhǔn)時，必須同時考慮空氣濕度和當(dāng)前的大氣壓，在校準(zhǔn)過程中將其輸入到測量設(shè)備中，便可以計算出正確的氧分壓。

現(xiàn)在可以通過網(wǎng)絡(luò)或天氣App就能夠輕松地查詢到這些數(shù)據(jù)。光學(xué)傳感器也可以通過帶有氣壓和濕度傳感器的USB接口，直接在電腦上進(jìn)行校準(zhǔn)和調(diào)整。電腦的校準(zhǔn)軟件還可提供其他常用的功能，如數(shù)據(jù)庫中的傳感器管理、用戶管理和全面的傳感器診斷。

光敏傳感器元件的使用壽命取決于工作條件。應(yīng)用于生物技術(shù)時，每周使用該元件測量兩批次，其使用壽命最長可達(dá)半年。當(dāng)氧分壓大于60 hPa且單批使用時間持續(xù)3～5天時，通常每隔5～10個批次在空氣中進(jìn)行一點校準(zhǔn)就足夠了。當(dāng)生物技術(shù)工藝過程更長，如分批補(bǔ)料式培養(yǎng)和灌注培養(yǎng)，且氧分壓更大時，則應(yīng)該在每批培養(yǎng)前在空氣中進(jìn)行一點校準(zhǔn)。

更換Optocap元件后，必須再次進(jìn)行兩點校準(zhǔn)。在批次培養(yǎng)開始時，對其進(jìn)行通氣，然后使用特殊的過程校準(zhǔn)程序（縮放比例），將測量值設(shè)置為100%空氣飽和度所需的起點。

含氧量高會縮短使用壽命

傳感器的使用壽命是一個重要問題。傳感器的使用壽命通常取決于3個因素：在高溫、氧氣濃度高且發(fā)色團(tuán)同時被光照時，會降低傳感器的使用壽命。這就是為什么在CIP和SIP循環(huán)以及不使用傳感器時應(yīng)關(guān)閉光學(xué)傳感器中LED光源的原因。當(dāng)測量設(shè)備接收到過程控制的數(shù)字信號時，測量設(shè)備將會關(guān)閉。另一種可能性是設(shè)定關(guān)閉溫度（如設(shè)定為42℃），一旦達(dá)到這個溫度，傳感器中的L E D將自動關(guān)閉。

工藝集成的建議和技巧

光學(xué)傳感器可以輕松地集成到現(xiàn)有的工藝中，因為它們具有相同的工藝連接件和尺寸（直徑和安裝長度）以及衛(wèi)生性能（CIP/SIP、介質(zhì)材料和表面質(zhì)量）。與傳統(tǒng)的提供nA范圍內(nèi)的傳感器電流作為原始值的安培傳感器不同，光學(xué)傳感器提供的是數(shù)字信號（相位角 phi）。

最佳配置是將光學(xué)傳感器與兼容的變送器結(jié)合使用。這樣做不僅可以得到純度值，還可以處理大量的診斷數(shù)據(jù)。目前有用于模擬或數(shù)字連接的方式可供選擇，可以連接到現(xiàn)有的發(fā)酵控制器（生物控制器）或變送器。

降噪如何進(jìn)行？

在臺式發(fā)酵罐中，光學(xué)傳感器通常垂直安裝在蓋子上。如果在充氣過程中有氣泡留在傳感器尖端，則在有氧過程中會產(chǎn)生明顯的信號噪聲。通常這種情況會在常規(guī)的安培傳感器中出現(xiàn)，即使設(shè)計不同，但光學(xué)傳感器也會發(fā)生這種反應(yīng)。對此，傾斜的尖端和疏水表面可以應(yīng)對這一問題。它們使氣泡無法黏附在傳感器上并立即被排走，從而完全消除了信號噪聲。

同種類型的傳感器適用于不同大小的發(fā)酵罐

當(dāng)要對生物技術(shù)過程進(jìn)行最優(yōu)化的監(jiān)控時，光學(xué)傳感器具有諸多優(yōu)勢。無論在研發(fā)臺式小型發(fā)酵罐時，還是將中型發(fā)酵罐進(jìn)行規(guī)模升級時，或者是在工藝研發(fā)（PD）中生產(chǎn)大型發(fā)酵罐時，使用相同型號的傳感器，獲得的測量值均一致。如今，已經(jīng)有大量靈活的集成方案可用于將傳統(tǒng)的安培傳感器升級為現(xiàn)代光學(xué)傳感器。