運用SNP芯片評估馬身豬保種群體的遺傳結(jié)構(gòu)

蔡春波，張雪蓮，張萬峰，楊 陽，高鵬飛，郭曉紅，李步高，曹果清

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，太谷 030801)

遺傳多樣性是指一個物種遺傳組成中遺傳特征的總數(shù)。遺傳多樣性在群體適應(yīng)環(huán)境變化的過程中起著十分重要的作用，群體的遺傳多樣性越豐富，其適應(yīng)環(huán)境變化的能力越強，生存能力也就越強[1-3]。SNP是最常見的一種遺傳多樣性，其數(shù)量多，而且分布密集。通過比較分析種群內(nèi)個體的SNP位點，可以鑒定種群的遺傳多樣性、親緣關(guān)系和家系結(jié)構(gòu)[4-5]。SNP芯片即單核苷酸多態(tài)性微陣列，是將數(shù)百萬個DNA標記序列排列并固定在特殊的硅片上，形成SNP探針微陣列[6]。SNP芯片的工作原理是通過固定在芯片上的DNA標記序列與目標基因組發(fā)生堿基互補配對反應(yīng)，從而精準地鑒定目標基因序列中的SNP位點。隨著SNP芯片價格的降低和篩選速度的加快，SNP芯片技術(shù)的使用越來越廣泛，已經(jīng)成為鑒定SNP位點最為高效的技術(shù)[7]。在豬種質(zhì)特性和群體遺傳多樣性的研究中，SNP芯片技術(shù)的應(yīng)用也非常廣泛[8-9]。Wang等[10]利用SNP芯片技術(shù)檢測了6個太湖豬群體的SNP位點，分析了6個太湖豬種群的遺傳多樣性，結(jié)果表明，梅山豬的遺傳多樣性最豐富，楓涇豬的遺傳多樣性最低。黃樹文等[11]利用SNP芯片技術(shù)分析了廣東地方豬種的遺傳多樣性，結(jié)果表明，兩廣小耳豬、大花白豬和藍塘豬的遺傳多樣性都比較低，需要引入新的血統(tǒng)，擴大其遺傳多樣性。

馬身豬是山西省地方豬種，屬于黃淮海黑豬類型，具有優(yōu)良的種質(zhì)特性。馬身豬長期生活在生態(tài)條件惡劣的高原地帶，造就了馬身豬獨特的遺傳特性和良好的適應(yīng)性。馬身豬耐粗飼，適應(yīng)性強，抗寒性能突出，在高寒低營養(yǎng)水平下仍能正常繁殖。馬身豬肉質(zhì)細嫩，肉味鮮美，屬于高肉質(zhì)豬種。馬身豬背最長肌中肌內(nèi)脂肪和鮮味氨基酸的含量都明顯高于大白豬[12]。但是馬身豬的缺點也非常明顯：生長速度慢、瘦肉率低和脂肪含量高。馬身豬的平均日增重、6月齡體重和瘦肉率都要明顯低于大白豬[12]。馬身豬的許多基因具有多態(tài)性，其剪切體和表達模式也與其他豬種存在顯著的差異，具有獨特的種質(zhì)特性[13-17]。馬身豬和大白豬的背最長肌中存在非常多的差異表達基因和lncRNA，主要富集在骨骼肌生長發(fā)育、脂肪酸合成、能量代謝和肌纖維類型發(fā)育等生物學(xué)過程中，這可能是馬身豬生長速度慢和肉品質(zhì)高的遺傳基礎(chǔ)[18-19]。馬身豬腸道中，纖維桿菌、普氏菌和乳酸桿菌的豐度較高，而這些菌種都可以促進纖維素的降解，這可能是馬身豬耐粗飼的遺傳基礎(chǔ)[20-22]。馬身豬腸道中，假丁酸弧菌和魏斯氏菌的豐度較高，而這些菌種都可以激活機體的免疫反應(yīng)，這可能是馬身豬抗病性強的遺傳基礎(chǔ)[20-22]。作為重要的遺傳種質(zhì)資源，馬身豬在我國豬育種工作中發(fā)揮了重大的作用。以馬身豬為雜交親本，先后培育出山西黑豬、山西白豬高產(chǎn)仔母系[23]和國家級新品種晉汾白豬[24]，豐富了中國豬種的多樣性。

雖然馬身豬具有肉品質(zhì)高和抗病性強的優(yōu)勢，但是其生長速度慢和瘦肉率低，無法滿足市場需求，導(dǎo)致馬身豬的數(shù)量越來越少，近親繁殖現(xiàn)象嚴重，遺傳多樣性逐漸降低，急需加強保種。SNP芯片技術(shù)可以通過鑒定群體中單獨個體的SNP位點，分析該群體的遺傳多樣性、親緣關(guān)系和家系結(jié)構(gòu)。因此，本研究利用SNP芯片技術(shù)鑒定馬身豬保種群體中單獨個體的SNP位點，分析保種群體的遺傳多樣性、親緣關(guān)系和家系結(jié)構(gòu)，評價馬身豬的保種效果，為馬身豬的保種提供科學(xué)的指導(dǎo)和建議。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

保種馬身豬均來自于山西北方四季牧場，共39頭 種豬，其中20頭公豬、19頭母豬，飼養(yǎng)標準和環(huán)境條件一致。仔豬全部在28 d斷奶。采集39頭種豬的耳組織樣品，放入凍存管中，迅速置于液氮中保存。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑：Biowest瓊脂糖、50×TAE緩沖液、核酸染料、DNA上樣緩沖液、Tris飽和酚、氯仿、異戊醇和蛋白酶K粉末均購自索萊寶公司；Trans 2000 plus Marker購自TaKaRa公司。主要儀器：高壓蒸汽滅菌鍋(MLS-3020，Sanyo)，制冰機(SIM-F124，Sanyo)，核酸蛋白濃度測定儀(ND-1000，NanoDrop)，高速冷凍離心機(Centrifuge 5415R，Eppendorf)，電泳槽(Mini Trans-Blot Cell Module，Bio-Rad)，電泳儀(DYY-3，六一儀器廠)，核酸蛋白凝膠成像系統(tǒng)(Universal HoodⅡ，Bio-Rad)。

1.3 馬身豬保種群體基因組DNA的提取和鑒定

采用酚/氯仿抽提法提取馬身豬耳組織的基因組DNA：剪碎耳組織樣品，加入蛋白酶K溶液裂解，再加入酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)的混合液萃取基因組DNA，然后加入無水乙醇沉淀基因組DNA，最后加入TE緩沖液溶解基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。通過核酸蛋白濃度測定儀測量基因組DNA的濃度和OD值，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性。

1.4 馬身豬保種群體基因組DNA的SNP分型

所有的基因組DNA樣品均委托康普森生物技術(shù)有限公司進行SNP芯片檢測，均采用Illumina CAUPorince 50 K SNP芯片進行基因型分型?；蛐头中驮囼灹鞒蹋篘aOH溶液對基因組DNA進行堿變性，恒溫過夜進行基因組全擴增，酶切進行DNA片段化，DNA沉淀和重懸，SNP芯片雜交，芯片清洗，單堿基延伸染色，芯片掃描，最后通過iScan掃描系統(tǒng)讀取數(shù)據(jù)。

1.5 SNP芯片數(shù)據(jù)質(zhì)控

按照以下質(zhì)量控制標準篩除不合格的樣本和SNP位點：只使用常染色體上的位點，最小等位基因頻率大于0.05，哈代溫伯格平衡檢驗的P值大于10-6，檢出率大于90%的SNP位點。

1.6 Plink軟件分析馬身豬保種群體的遺傳多樣性

采用Plink(V1.90)軟件對質(zhì)控后的數(shù)據(jù)進行分析，分別計算馬身豬保種群體的最小等位基因頻率、期望雜合度、觀察雜合度、多態(tài)信息含量和多態(tài)性標記比例，分析馬身豬保種群體的遺傳多樣性。最小等位基因頻率是指群體內(nèi)某個位點上不常見的等位基因發(fā)生的頻率，反映一個群體中基因的多樣性，范圍在0～0.5之間。期望雜合度是指群體中任一個體的任一位點雜合的概率，是反映群體遺傳變異的指標之一。觀察雜合度是指群體中某一位點是雜合子的個體數(shù)占總個體數(shù)的比例。多態(tài)信息含量表示一個后代所獲得的某個等位基因標記來自于其父親或母親的可能性，與群體中等位基因的數(shù)目和頻率有關(guān)，用來表示群體中某一位點多態(tài)性的程度，評估群體的遺傳多樣性。

1.7 Plink軟件分析馬身豬保種群體的親緣關(guān)系

采用Plink(V1.90)軟件分析連續(xù)性純合片段(runs of homozygosity，ROH)，統(tǒng)計每頭馬身豬ROH的分布、長度和數(shù)目，計算每個個體中ROH片段總長度與常染色體基因組總長度的比值，此比值即為基于ROH的近交系數(shù)。采用Plink(V1.90)和Gmatix(V2)軟件分別構(gòu)建狀態(tài)同源(identity by state，IBS)距離矩陣和G矩陣，并繪制熱圖，分析保種群體的親緣關(guān)系。IBS是指兩個個體中共有的等位基因序列相同，IBS的遺傳距離可以衡量樣本間的相似性，評價其親緣關(guān)系。G矩陣是利用SNP位點構(gòu)建的基因組關(guān)系矩陣，更能真實地反映個體間的親緣關(guān)系。

1.8 Mega X軟件分析馬身豬保種群體的家系結(jié)構(gòu)

采用Mega X (V10.0)軟件對質(zhì)控后的SNP位點進行分析并繪制群體進化樹，分析馬身豬保種群體中種公豬的家系結(jié)構(gòu)，統(tǒng)計不同家系種公豬的數(shù)量。進化樹分析是把關(guān)系密切的個體聚類到一個較小的分類單元，關(guān)系相對疏遠的個體聚類在一個較大的分類單元，最后把整個分類系統(tǒng)畫成一張系譜圖，展示所有樣品間的親疏關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1 基因組DNA檢測

采用酚/氯仿抽提法提取馬身豬保種群體的耳組織基因組DNA，檢測所有DNA樣品的濃度和OD值，結(jié)果顯示，每份DNA樣品的濃度均大于50 ng·μL-1， OD260 nm/OD280 nm為1.7～1.9，表明DNA樣品的濃度和純度均符合要求。對基因組DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳(圖1)，結(jié)果顯示，DNA條帶清晰，無拖尾現(xiàn)象，亮度均一，說明基因組DNA樣品質(zhì)量較好，無蛋白質(zhì)污染，也無降解，達到Illumina的分析要求，可以用于后續(xù)研究。

2.2 馬身豬保種群體基因組DNA的SNP分型及質(zhì)控

使用Illumina CAUPorcine SNP 50 K SNP芯片對基因組DNA樣本進行基因分型和質(zhì)控，結(jié)果見表1。39頭馬身豬保種群體中共檢測到43 832個SNPs位點，個體的基因型檢出率為0.977 5～0.981 6，平均值為0.980 1，表明該SNP芯片適合分析馬身豬基因組的SNP位點；通過質(zhì)量控制的SNPs數(shù)目為28 859個，在染色體上的分布情況如圖2所示，1號染色體的SNP數(shù)目最多，為4 529個；18號染色體的SNP數(shù)目最少，為970個。

表1 SNP質(zhì)量控制統(tǒng)計

2.3 馬身豬保種群體的遺傳多樣性分析

采用Plink(V1.90)軟件計算馬身豬保種群體的最小等位基因頻率、期望雜合度、觀察雜合度、多態(tài)信息含量、多態(tài)性標記比例。39頭保種馬身豬中共檢測到了60.97個有效等位基因，平均有效等位基因數(shù)為1.563 4。最小等位基因頻率為0.258，其分布比較均勻(圖3A)。SNP位點的多態(tài)信息含量為0.093～0.593，平均多態(tài)信息含量為0.412，分布情況如圖3B所示，其中，26 036個SNPs位點的多態(tài)信息含量大于0.25，為中度多態(tài)性SNP位點。SNP位點的多態(tài)性標記比例為0.724，表明72.4%的SNP位點具有多態(tài)性，說明馬身豬的遺傳多樣性比較豐富。平均觀察雜合度為0.354 1，平均期望雜合度為0.349 9，平均觀察雜合度略高于平均期望雜合度，但兩者之間相差不多，表明馬身豬保種群體出現(xiàn)了分化。

2.4 馬身豬保種群體的IBS距離矩陣分析

通過Plink(V1.90)軟件計算39頭保種馬身豬之間的IBS遺傳距離，結(jié)果顯示，馬身豬保種群體的IBS遺傳距離在0.126 3～0.407 7之間，平均為0.284 2；20頭保種公豬的IBS遺傳距離在0.150 1～0.387 1之間，平均為0.285 2。馬身豬保種群體IBS距離矩陣的結(jié)果如圖4所示，大部分馬身豬個體間的IBS遺傳距離較遠，呈中等程度的親緣關(guān)系(圖4中顏色較深的方格)；部分個體間的IBS遺傳距離較近(圖4中顏色較淺的方格)，存在較高的親緣關(guān)系，說明馬身豬保種群體存在較大的近交風險，必須強化選配措施。

2.5 馬身豬保種群體的G矩陣分析

利用SNP位點構(gòu)建的基因組關(guān)系G矩陣進一步分析馬身豬保種群體的親緣關(guān)系，結(jié)果如圖5所示。大部分馬身豬個體間呈中等程度的親緣關(guān)系(圖5中顏色較淺的方格)，而部分個體之間存在較近的親緣關(guān)系(圖5中顏色較深的方格)，與IBS距離矩陣結(jié)果一致，均表明馬身豬保種群體存在近交風險。

2.6 馬身豬保種群體的ROH分析

在39頭馬身豬保種群體中共檢測到8 131個ROHs片段，長度在10～20 Mb之間的ROH數(shù)量最多，占41.98%(圖6A)，其中，最短的ROH的長度為5.51 Mb，含有104個SNPs，位于9號染色體上；最長的ROH的長度為156.64 Mb，含有2 100個SNPs，位于13號染色體上。ROH的分布比較均勻，1號染色體上的ROH數(shù)量最多，為98個；18號染色體上的ROH數(shù)量最少，為26個(圖6B)。每頭馬身豬的ROH總長度在258.55～1 045.91 Mb 之間，平均ROH總長度為580.48 Mb，ROH總長度在400～600 Mb之間的個體數(shù)最多，共有18頭(圖6C)。馬身豬保種群體基于ROH的平均近交系數(shù)為0.237，表明馬身豬保種群體出現(xiàn)了近交現(xiàn)象。

2.7 馬身豬保種群體中公豬的家系結(jié)構(gòu)分析

公豬的家系建立在整個保種群體中具有極高的重要性，本研究采用Mega X (V10.0)軟件繪制20頭 種公豬的群體進化樹。結(jié)果如圖7所示，現(xiàn)有的20頭種公豬可以分為3個家系，分別命名為家系A(chǔ)、家系B和家系C，分別含有11、2和7頭種公豬。然后根據(jù)39頭保種馬身豬的親緣關(guān)系遠近程度，最終將整個保種群體分為3個家系(表2)，家系A(chǔ)含有11頭公豬和15頭母豬，家系B含有2頭公豬和2頭母豬，家系C含有7頭公豬和7頭母豬。部分母豬存在交叉現(xiàn)象，同時被歸到不同的家系中，例如母豬174F和541F同時被歸到A和C家系中，母豬218F同時被歸到B和C家系中，母豬402F同時被劃分到A、B和C家系中。

3 討 論

科學(xué)評估保種效果是保種工作的重要組成部分，目前多數(shù)研究采用微衛(wèi)星標記技術(shù)分析保種群體的遺傳多樣性，評估保種效果[25-27]。張跟喜等[28]選擇21個微衛(wèi)星標記分析邊雞的遺傳多樣性，經(jīng)過一個世代的選育，邊雞的多態(tài)信息含量和期望雜合度都維持在原有水平，說明采用的保種方法很好地保存了邊雞的遺傳多樣性。與微衛(wèi)星標記相比，全基因組SNP標記可以更加客觀地反映個體之間的遺傳差異，被越來越多地應(yīng)用于分析群體的遺傳多樣性[29-30]。Muoz等[31]使用高密度SNP芯片評估了20個歐洲馴化豬種和西班牙野生豬種的遺傳多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生豬種與馴化豬種之間的遺傳距離較近，野生豬種出現(xiàn)了明顯的分化，需制定措施保護野生豬種的遺傳多樣性。Diao等[32]采用SNP芯片技術(shù)分析了中國華南地區(qū)11個豬種的遺傳學(xué)多樣性和豬種間的親緣關(guān)系，為中國地方豬的科學(xué)保種提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。SNP芯片技術(shù)分析種群的遺傳多樣性，準確率高，而且價格較低，應(yīng)用非常廣泛。

期望雜合度是指群體中任一個體的任一位點發(fā)生雜合的概率，觀察雜合度是指群體中某一位點是雜合子的個體數(shù)占總個體數(shù)的比例。本研究中，馬身豬保種群體的平均觀察雜合度高于平均期望雜合度，表明所檢測馬身豬保種群體歷史上可能出現(xiàn)了分化，或者引進了小部分外來的血緣，需要繼續(xù)加以純化。IBS是指兩個個體中共有的等位基因序列相同，群體之間的IBS遺傳距離可以衡量樣本間的相似性，評價其親緣關(guān)系。劉彬等[33]報道,青峪豬保種群體的平均IBS遺傳距離為0.260 4±0.025 2，其中，公豬的平均IBS遺傳距離為0.263 3±0.023 7，公豬的平均IBS遺傳距離略高于整個群體。本研究發(fā)現(xiàn)，馬身豬保種群體的平均IBS遺傳距離為0.284 2±0.046 5，公豬的IBS平均遺傳距離為0.285 2±0.050 1，公豬的平均IBS遺傳距離也略高于整個馬身豬保種群體。1頭種公豬會與多頭母豬交配，因此種公豬的選擇標準比較嚴格。被挑選的種公豬一般都來自于不同的家系，親緣關(guān)系也較遠，盡量降低后代群體的近交系數(shù)，因此群體種公豬的平均IBS遺傳距離略高于整個馬身豬保種群體。

表2 馬身豬家系表

PIC是指某一標記在群體中出現(xiàn)多態(tài)性的頻率，可以用來評估群體的遺傳多樣性。2010年，曹果清等[34]利用FAO-ISAG推薦的21個微衛(wèi)星標記檢測馬身豬遺傳多樣性變化趨勢發(fā)現(xiàn)，馬身豬保種群體的PIC值在0.341～0.441之間，平均值為0.392。本研究基于SNP芯片分析了馬身豬保種群體的遺傳多樣性發(fā)現(xiàn)，72.4%的SNPs位點具有多態(tài)性，且各位點PIC值在0.093～0.593之間，平均PIC為0.412。本研究中的PIC值略高，表明馬身豬保種過程中遺傳多樣性沒有明顯丟失，說明近幾年的保種措施有效。但是基于ROH的近交程度[35-36]分析表明，馬身豬保種群平均近交系數(shù)為0.237，近交系數(shù)較高，容易出現(xiàn)近交衰退，應(yīng)引起高度重視。由于我國地方豬種群體規(guī)模的局限性和相對封閉的運行模式，隨著保種時間的延長和世代重疊的加劇，群體內(nèi)近交系數(shù)的上升和遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生變化是必然趨勢[37-38]。青峪豬經(jīng)過世代閉鎖繁育，平均近交系數(shù)達到了5.5%，各世代群體近交系數(shù)由F1世代的0.039上升到F3世代的0.075[33]。降低近交系數(shù)的有效辦法是擴大群體含量，并進行適當選配，同時加強管理，避免系譜記錄不完整或者錯誤而導(dǎo)致的近親繁殖。本研究還發(fā)現(xiàn)，馬身豬保種群體僅由3個家系構(gòu)成，且3個家系的公、母豬數(shù)量相差較大，家系結(jié)構(gòu)不平衡。因此，該馬身豬保種場需要從原種場引入新的血統(tǒng)，擴充核心群，并實施合理選配，避免近親繁殖，維持馬身豬保種群體的遺傳多樣性。

中國地方豬種的商品化程度較低，保種群體的數(shù)量也較少，容易出現(xiàn)近親繁殖，導(dǎo)致保種群體的遺傳多樣性降低。目前，大部分中國地方豬保種場仍然根據(jù)譜系進行配種和保種，方法較為單一和落后，需要更加科學(xué)和先進的方法指導(dǎo)保種工作。SNP芯片技術(shù)可以鑒定保種群體中每個個體的SNP位點，從而分析保種群體的遺傳多樣性、親緣關(guān)系和家系結(jié)構(gòu)，然后結(jié)合譜系合理地制定配種方案，維持保種群體的遺傳多樣性。通過SNP芯片技術(shù)鑒定的SNP位點，首先經(jīng)過質(zhì)量檢測，確定質(zhì)控后的SNP位點；然后根據(jù)質(zhì)控后SNP位點的個數(shù)和位置，分別計算有效等位基因數(shù)、最小等位基因頻率和多態(tài)信息含量，分析保種群體的遺傳多樣性；計算保種群體的平均觀察雜合度和期望雜合度，分析保種群體的變異程度；計算保種群體中各個體之間的IBS遺傳距離，同時構(gòu)建保種群體中各個體之間的基因組關(guān)系G矩陣，分析保種群體間的親緣關(guān)系；計算保種群體中每個個體的ROH，然后基于ROH計算保種群體的平均近交系數(shù)，同時繪制群體進化樹，把保種群體分為不同的家系；最后結(jié)合SNP芯片分析家系結(jié)構(gòu)和保種場記錄的譜系，制定合理的配種方案，科學(xué)地進行保種工作。本研究通過分析SNP芯片數(shù)據(jù)，建立了較為完整的保種群體遺傳多樣性、親緣關(guān)系和家系結(jié)構(gòu)的分析方法，為馬身豬的保種工作提供了科學(xué)的依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究基于Illumina CAUPorince 50 K SNP分析了馬身豬保種群體的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)馬身豬群體遺傳多樣性較豐富，平均PIC為0.412，呈中度多態(tài)；群體內(nèi)家系少，近交程度較高，各家系個體數(shù)差異明顯，需要從原種場引入新的血統(tǒng)，擴大群體含量，降低近交系數(shù)，并關(guān)注各家系數(shù)量，確保家系結(jié)構(gòu)維持平衡。