T-2毒素在馬鈴薯品種對鐮刀菌干腐病抗性評價中的應用

賀付蒙，單瑋玉，趙瀟璨，武佳文，朱元芳，周 磊，石奇海，劉 娣，李鳳蘭

(1.東北農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院，哈爾濱 150086)

馬鈴薯(Solanumtuberosum)為茄科茄屬，是世界第四大糧食作物，是中國重要的經(jīng)濟作物，因其塊莖淀粉含量高且營養(yǎng)全面，既可作為蔬菜也可用于餐桌主食，是重要的糧食作物[1]。大多數(shù)馬鈴薯在收獲后要進行半年之久的窖儲，而在貯藏期易發(fā)生馬鈴薯病害，主要包括馬鈴薯晚疫病、環(huán)腐病、干腐病和黑脛病等[2]。其中馬鈴薯干腐病是造成薯塊腐爛的主要原因之一，其主要致病菌是鐮刀菌，包括三線鐮刀菌(Fusariumtricinctum)、擬絲孢鐮刀菌(Fusariumtrichothecioides)、擬枝孢鐮刀菌(Fusariumsporotriodides)、梨孢鐮刀菌(Fusariumpoae)等，發(fā)病后會導致馬鈴薯腐爛，甚至爛窖，嚴重影響產(chǎn)量，造成的年損失量達6%以上[3]。T-2毒素則是鐮刀菌在特定條件下產(chǎn)生的有毒次生代謝產(chǎn)物，屬于單端孢霉烯族，一種倍半萜烯化合物，該毒素在谷物和飼料中污染嚴重，已在世界各地廣泛分布，其中在中國谷物中檢出率高達80%[4-5]。T-2毒素對于動植物及人類都具有一定的毒性，但有研究表明低濃度T-2毒素可通過誘導馬鈴薯的苯丙烷代謝而增強塊莖對干腐病的抗性[6]。

近年來，真菌毒素殘留于食物中的安全問題一直是人們關(guān)注的焦點，楊亞君等[7]對處理了腐霉枯萎病毒素的坪草進行抗病性鑒定，研究經(jīng)毒素處理后不同品種的抗病性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)‘草地早熟禾’抗病性最強，其次是‘高羊茅’和‘甸甸剪股穎’，‘黑麥草’感病性較強。何明霞等[8]利用粗毒素和菌絲體接種鑒定方法對云南地區(qū)9個不同橡膠品種抗棒孢霉落葉病進行評價，結(jié)果表明不同的橡膠品種對粗毒素鑒定表現(xiàn)的抗性程度不同，‘云研77-2’表現(xiàn)為抗病，‘云研77-4’表現(xiàn)為輕感病，‘RRIM600’表現(xiàn)為輕感病或易感病。左示敏等[9]研究水稻對毒素的抗性反應，進行水稻品種抗病性鑒定，發(fā)現(xiàn)經(jīng)一定濃度的毒素處理后水稻植株可引起超氧化物歧化酶、過氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶活性升高，抗病品種的酶活反應明顯高于感病品種。單瑋玉等[10]采用馬鈴薯干腐病 2 個致病性不同的菌株—強致病性的燕麥鐮刀菌和弱致病性的擬枝孢鐮刀菌，針對黑龍江省 21 個主栽馬鈴薯品種對其進行抗病性評價，采用病級分類方法和系統(tǒng)聚類分析方法將馬鈴薯品種抗病性分為抗病、中抗、感病3 類。

本試驗以此為基礎，采用 T-2毒素對不同抗性的馬鈴薯進行抗病性評價，對其抗病生理生化特性進行研究，確定T-2毒素是否能作為抗病篩選的一種指標，以期為馬鈴薯抗干腐病品種的推廣和選育提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

馬鈴薯3個不同抗性品種分別為：感病品種‘魯引1號’、中抗品種‘東農(nóng)310’和抗病品種‘東農(nóng)311’(東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院植物資源與分子生物學研究室提供)。

T-2毒素標樣為FERMENTEK公司產(chǎn)品。

1.2 方 法

1.2.1 T-2毒素作為馬鈴薯品種干腐病抗性篩選指標的質(zhì)量濃度確定 選擇外觀整齊、無損傷的馬鈴薯塊莖，清洗后用75%酒精浸泡30 s，然后用5%的次氯酸鈉溶液浸泡5 min，最后用無菌水反復沖洗3次，置于超凈工作臺中晾干，用直徑1 cm的打孔器在晾干后的馬鈴薯塊莖中央打出小孔(h=1 cm)，備用。

將T-2毒素標樣進行稀釋，稀釋成不同質(zhì)量濃度的T-2毒素(0 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、30 ng/mL、40 ng/mL、50 ng/mL、60 ng/mL和70 ng/mL)，將其分別用移液槍打進3種抗性馬鈴薯孔中，然后將組織塞回，再用浸濕的紙巾包裹，放入25 ℃恒溫恒濕的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 5 d。取出馬鈴薯塊莖，沿著穴窩中心垂直切，用十字交叉法測病斑大小，每組試驗重復3次。

1.2.2 T-2毒素處理馬鈴薯塊莖生理生化指標的測定 根據(jù)前期試驗，篩選出質(zhì)量濃度為50 ng/mL的T-2毒素作為篩選指標，將其分別侵染3種抗性馬鈴薯塊莖，處理方法同“1.2.1”。然后在0 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h時，在病斑交界處取樣，放入液氮中冷凍，于-80 ℃冰箱中保存，隨后進行生理生化指標測定。每組處理進行3次重復測定。

超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍四唑( NBT) 法，過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚顯色法，可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法，還原糖含量測定采用3，5-二硝基水楊酸法，丙二醛(MDA)測定采用硫代巴比妥酸法，試驗方法參照文獻[11]。4-香豆酰-輔酶A連接酶(4CL)活性、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性測定參照楊志敏等[12]的方法。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析 所有數(shù)據(jù)都是3次重復的平均值，以“平均值±標準誤”表示，采用 Microsoft Office Excel 2007 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理，用 SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行方差分析，采用新復極差法(Duncan’s)進行差異性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 T-2毒素作為馬鈴薯品種干腐病抗性篩選指標的質(zhì)量濃度

由圖1可知，不同品種的馬鈴薯塊莖在未處理T-2毒素時趨于平穩(wěn)狀態(tài)，T-2毒素處理后，3種抗性馬鈴薯塊莖病斑比例會隨T-2毒素質(zhì)量濃度的升高而呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當T-2毒素質(zhì)量濃度為50 ng/mL時，3種抗性馬鈴薯塊莖病斑比例都達到最高，在T-2毒素處理質(zhì)量濃度為50 ng/mL至70 ng/mL時，其病斑比例都呈下降趨勢，且3個品種間病斑比例具有明顯差異。因此，以50 ng/mL T-2毒素作為馬鈴薯抗干腐病抗病性的最佳篩選質(zhì)量濃度。

2.2 T-2毒素對不同抗性馬鈴薯品種生理指標的影響

2.2.1 經(jīng)T-2毒素處理后不同抗性馬鈴薯塊莖腐爛面積變化 由圖2可知，3種不同抗性馬鈴薯品種經(jīng)T-2毒素處理后，隨處理時間的延長腐爛面積都會變大，但抗病品種‘東農(nóng)311’腐爛面積變化最小，中抗品種‘東農(nóng)310’其次，感病品種‘魯引1號’腐爛面積變化最大。

2.2.2 T-2毒素處理后馬鈴薯塊莖生理生化指標 3種抗性馬鈴薯塊莖經(jīng)T-2毒素處理后，SOD、POD 和 MDA測定結(jié)果如圖3所示，SOD活性整體趨勢呈波浪式變化(圖3-a)，且抗病品種‘東農(nóng)311’和感病品種‘魯引1號’的SOD活性均高于對照組，中抗品種‘東農(nóng)311’在12 h處理時低于對照。處理組之間抗病品種‘東農(nóng)311’的SOD活性最高，其在12 h達到最高為44.8，且與其他兩個品種具有明顯差異，感病品種‘魯引1號’SOD活性最低。

POD活性隨時間的變化呈先上升后下降的趨勢(圖3-b)，且處理后3個品種的POD活性均比對照組高。處理組之間抗病品種‘東農(nóng)311’及中抗品種‘東農(nóng)310’的 POD活性比感病品種‘魯引1號’高，且具有明顯的差異；抗病品種及中抗品種POD活性在24 h時達到峰值，抗病品種為65，中抗品種為56，隨后POD活性開始降低。

MDA含量都呈先上升后下降趨勢(圖3-c)，抗病品種‘東農(nóng)311’在24 h達到峰值，中抗品種‘東農(nóng)310’是12 h最高，而感病品種‘魯引1號’則是在36 h時最高，分別為1.9、2.1和2.3，整體上感病品種‘魯引1號’的MDA含量較其他兩個品種更高。

3種抗性馬鈴薯塊莖經(jīng)T-2毒素處理后，PAL、4CL、可溶性糖和還原糖測定結(jié)果如圖4所示，PAL活性呈波動式上升，且PAL活性均高于照組(圖4-a)。整體上抗病品種‘東農(nóng)311’和中抗品種‘東農(nóng)310’均比感病品種‘魯引1號’PAL活性要高，但在處理36 h時‘魯引1號’PAL活性高于其他兩個品種且是達到峰值。

抗病品種‘東農(nóng)311’的4CL活性整體呈上升趨勢(圖4-b)，且4CL活性高于其他兩個品種，在24 h時到達峰值為0.3；中抗品種‘東農(nóng)310’和感病品種‘魯引1號’的4CL活性則是先升高后降低的趨勢，峰值分別為0.19和0.21。

可溶性糖含量變化都是先上升后下降的趨勢，且均比對照組高(圖4-c)?？共∑贩N‘東農(nóng)311’和中抗品種‘東農(nóng)310’比感病品種‘魯引1號’可溶性糖含量高，兩個品種都在24 h時達到最高峰，分別為0.98和1.17；感病品種‘魯引1號’則是在36 h到達峰值為0.7。

T-2毒素處理3種抗性馬鈴薯塊莖后還原糖含量變化趨勢不明顯，但處理組還原糖含量均比對照組高(圖4-d)；抗病品種‘東農(nóng)311’還原糖含量整體趨勢高于中抗品種‘東農(nóng)310’和感病品種‘魯引1號’，其中感病品種‘魯引1號’還原糖含量最低。

3 討 論

毒素是病原菌產(chǎn)生的有毒物質(zhì)，經(jīng)毒素處理后寄主會發(fā)生明顯的病害現(xiàn)象，利用毒素篩選抗病品種是國內(nèi)外研究的熱點。Matsumoto等[13]采用了不同濃度梯度的香蕉枯萎病菌毒素對香蕉進行處理，結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)香蕉的再生突變體植株的抗病性比野生型植株強。張笑宇等[14]用黑痣病菌毒素誘導不同品種馬鈴薯幼苗，對其體內(nèi)防御酶活性的變化，MDA含量、細胞膜透性及PAL活性的變化進行了研究，結(jié)果表明抗病品種馬鈴薯較感病品種有更強的抵御能力。

SOD和POD是生命體內(nèi)的活性物質(zhì)，能消除生物體在新陳代謝中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，李鳳蘭等[15]采用擬絲孢鐮刀菌對‘大西洋’和‘克山 1’的薯塊進行侵染，在不同時間對其內(nèi)部的SOD 活性和POD 活性進行測定，結(jié)果表明不同抗性的馬鈴薯被擬絲孢鐮刀菌侵染后，薯塊內(nèi)SOD呈上升趨勢，抗性品種內(nèi)的 POD 酶活性高于感病品種，表明 SOD、POD 酶活性同抗病性密切相關(guān)。本試驗中，處理組的SOD和POD活性均比對照組高，且處理組抗病品種的SOD和POD活性高，說明SOD和POD的活性變化與馬鈴薯品種抗病性有關(guān)，與前人的報道相一致。

MDA含量會體現(xiàn)出病原菌侵染馬鈴薯莖基后誘發(fā)莖基自身反應。拓寧[16]對侵染了立枯絲核菌而導致的馬鈴薯黑痣病的莖基組織進行生理生化測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，立枯絲核菌對馬鈴薯莖基組織的MDA含量產(chǎn)生顯著影響，接種莖基發(fā)病部分的MDA含量均高于健康部分。在本試驗中，馬鈴薯不同抗性品種經(jīng)T-2毒素處理后發(fā)現(xiàn)感病品種的MDA含量比中抗和抗病品種的數(shù)值較高，說明抗病品種較其他品種具有較強的MDA清除能力，對逆境更具有抗性。

PAL、4CL為控制木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶[17-18]，PAL 存在于大部分高等植物中，植物抗病性的強弱與其活性有重要聯(lián)系，其影響植物木質(zhì)化過程并在抗蟲、抗逆等過程中起到重要作用[19]。4CL 是植物調(diào)控木質(zhì)素代謝、參與類黃酮和其他次生代謝產(chǎn)物合成的關(guān)鍵酶，位于苯丙氨酸生物合成途徑的分支點上，控制碳流進入下游不同代謝支路，是植物體內(nèi)最主要的抗菌物質(zhì)，侵染組織周圍代謝產(chǎn)物的積累能有效抑制病原菌的擴展[20]。在本試驗中，T-2毒素可誘導不同抗性品種塊莖內(nèi)PAL和4CL活性增加，抗病、中抗和感病品種PAL和4CL活性均比對照組高，說明PAL和4CL活性的增高能提升馬鈴薯塊莖抵抗病害的能力。

劉喜平等[21]為了提高馬鈴薯品質(zhì)，對4個品種在4個不同生態(tài)條件下的還原糖含量分析顯著性，結(jié)果表明，還原糖數(shù)值的體現(xiàn)為不同地域間的不一致大于品種間的差別，還原糖數(shù)值受地域環(huán)境和品種的影響。本試驗測定了馬鈴薯不同抗性品種塊莖的可溶性糖和還原糖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗病、中抗和感病品種的糖含量均比未侵染T-2毒素的對照組高，且抗病品種最高，這說明抗病品種可以更好的維持滲透平衡，維持植物的正常代謝。

綜上所述，利用干腐病鐮刀菌產(chǎn)生的T-2毒素作為馬鈴薯抗病品種的篩選方法是可行的，但馬鈴薯在受病害時其他生理變化等還尚不明確，需進一步探究，以更好的揭示馬鈴薯干腐病抗病的機制。