黑蜂王臺病毒基因檢測及其病害診斷防治方法

魏菁 肖芳 宋戰(zhàn)昀│文

1 黑龍江哈爾濱海關(guān)技術(shù)中心，150028；2 吉林長春海關(guān)技術(shù)中心，130062

蜜蜂病毒是威脅蜜蜂健康的最主要因素之一，通過對當(dāng)前蜜蜂患病調(diào)查，有超過25種病毒會對蜜蜂造成威脅，并進(jìn)一步感染到其他蜜蜂。其中，黑蜂王臺病毒是造成蜜蜂患病數(shù)量較多的病毒。黑蜂王臺病毒專門感染王臺內(nèi)幼蟲，當(dāng)幼蟲發(fā)病后，王臺會逐漸變黑，在蛹期死亡，形成一種與囊狀幼蟲病十分相似的堅硬的囊。當(dāng)前黑蜂王臺病毒只在西方蜜蜂中發(fā)現(xiàn)，我國尚未見類似相關(guān)報道，但針對黑蜂王臺病毒的預(yù)防研究是十分必要的[1]。

一、黑蜂王臺病毒基因檢測

1.基于核酸序列的黑蜂王臺病毒定性

在蜜蜂體內(nèi)含有一組由基因編碼構(gòu)成的唯一性核酸序列，根據(jù)這一序列的特異性，將其作為鑒定蜜蜂是否攜帶黑蜂王臺病毒的重要指標(biāo)，以此對黑蜂王臺病毒進(jìn)行定性操作[2]。本文采用化學(xué)方法，通過人工合成的方式，將采集到的一小段蜜蜂病毒基因互補(bǔ)引物序列進(jìn)行合成，并通過定量逆轉(zhuǎn)錄的方式實(shí)施擴(kuò)增處理，并對黑蜂王臺病毒樣本中的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性檢測。首先，在進(jìn)行黑蜂王臺病毒基因編碼特異性診斷過程中，通過采用定量逆轉(zhuǎn)錄的方式，結(jié)合核酸復(fù)制所需的特殊環(huán)境，按照相應(yīng)的比例加入到定量逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所需的試劑當(dāng)中，充分?jǐn)嚢韬蟮玫较鄳?yīng)的混合溶液。加之核糖核酸中DNA聚合酶作用，將黑蜂王臺病毒的核糖核酸分子作為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以此合成互補(bǔ)的脫氧核糖核酸。

其次，在脫氧核糖核酸當(dāng)中找出另外一條鏈，通過脫氧核苷酸引物，完成對DNA中聚合酶的形成。在后續(xù)的每個循環(huán)當(dāng)中，逐步提高倍數(shù)，并通過PCR完成循環(huán)操作。此時，原始的核糖核酸模板逐漸被核糖核酸酶降解，只保留剩余的互補(bǔ)DNA。

最后，在定量逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)完成后，將得到的產(chǎn)物置于瓊脂糖凝膠中，沿相反電極方向移動，分離得到純化的酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物。在紫外線光的照射下，利用顯微鏡對其進(jìn)行觀察，并將其與未感染黑蜂王臺病毒蜜蜂的DNA梯形條帶進(jìn)行比對，從而確定黑蜂王臺病毒基因的長度。

對特異性目的基因片段進(jìn)行回收，將其用于后續(xù)質(zhì)粒的克隆以及小量制備，以此獲取到足夠數(shù)量的目的DNA片段，用于對黑蜂王臺病毒基因測序。將測序得到的核算數(shù)據(jù)輸入到相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫當(dāng)中，完成對核算序列的比對，以此完成對黑蜂王臺病毒種類的鑒定。由于定量逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的每個循環(huán)均能夠使提取樣本中的病毒拷貝數(shù)量呈指數(shù)級放大，并有更高的靈敏度，從而保證對黑蜂王臺病毒基因檢測分辨率提升。

2.qRT-PCR定量檢測

根據(jù)黑蜂王臺病毒核酸序列特異性特征，通過合成定量逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所需的引物以及特異性探針，對黑蜂王臺病毒基因進(jìn)行qRT-PCR定量檢測。首先按照優(yōu)化體系，將其引入需要進(jìn)行充分反應(yīng)的實(shí)際和特異性引物當(dāng)中，再加入到黑蜂王臺病毒樣本檢測，并使用qRT-PCR儀器進(jìn)行定量。在選擇一一對應(yīng)的檢測樣本時，使用特異性探針，對其進(jìn)行同步擴(kuò)增反應(yīng)，將初始病毒含量較高的樣本剔除，保證其各個樣本之間的加樣量在同一范圍以內(nèi)[3]。通過qRT-PCR儀器對樣本進(jìn)行擴(kuò)增，得到拷貝量呈2倍速度增加的病毒，并在這一過程中通過qRTPCR儀器檢測信號功能，觀察病毒起始時的濃度值，以及達(dá)到最高峰時的檢測峰值。圖1為基于核酸序列的黑蜂王臺病毒定性結(jié)果。

圖1 黑蜂王臺病毒qRT-PCR定量檢測結(jié)果

3.蜜蜂特殊組織病毒感染程度分析

通過本文使用能與蜜蜂黑蜂王臺病毒基因序列互補(bǔ)的核算片段作為基因檢測探針，本文結(jié)合原位雜交技術(shù)可以更加清楚地通過顯微鏡觀測到蜜蜂在感染黑蜂王臺病毒后其組織中的病毒情況，對蜜蜂特殊組織病毒感染程度進(jìn)行分析。使用石蠟材料將感染黑蜂王臺病毒的蜜蜂組織器官包裹，并制成顯微鏡觀測用的玻片，并將其固定在顯微鏡的載玻片上[4]。再利用事先準(zhǔn)備的核算探針，將其與玻片上的樣本進(jìn)行反應(yīng)，將發(fā)生反應(yīng)的復(fù)合物用熒光法進(jìn)行染色。根據(jù)其熒光程度，對蜜蜂特殊組織病毒感染程度進(jìn)行推斷。當(dāng)熒光數(shù)值在0～500dB范圍以內(nèi)時，說明蜜蜂特殊組織病毒感染程度較低；當(dāng)熒光數(shù)值在500～1500dB時，說明蜜蜂特殊組織病毒感染程度中等；當(dāng)熒光數(shù)值在1500～2500dB時，說明蜜蜂特殊組織病毒感染程度較高。

二、病害診斷防治方法研究

1.病害診斷

黑蜂王臺病毒的直徑通常在25～35nm之間，整體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)為無囊膜正二十面體顆粒狀，通常情況下，利用簡單的觀測設(shè)備很難進(jìn)行觀測。因此，對于黑蜂王臺病毒的診斷，通常是基于蜜蜂患病癥狀、流行病學(xué)作為初步判斷依據(jù)，再通過顯微鏡觀察，得出黑蜂王臺病毒的具體病源特征。表1為黑蜂王臺病毒病原特征。

由表1可以看出，黑蜂王臺病毒主要危害蜂王的幼蟲和蛹，夏季和秋季為發(fā)病高峰期，其典型病狀為患病幼蟲無法及時脫皮并化蛹，蛻皮液逐漸累積在舊表皮當(dāng)中，使得表皮逐漸變硬，并形成囊袋狀結(jié)構(gòu)。在這一過程中，幼蟲的體色會逐漸由乳白色轉(zhuǎn)變?yōu)闇\黃色并進(jìn)一步加深，直到變成黑色，并干枯。通常情況下，黑蜂王臺病毒為無病癥隱性感染方式長期存在于被感染的幼蟲當(dāng)中。除此之外，當(dāng)蜜蜂感染黑蜂王臺病毒后，神經(jīng)系統(tǒng)會逐漸受到損傷，迷失方向，記憶功能與學(xué)習(xí)能力也會逐漸退化。具體表現(xiàn)為采蜜能力下降或喪失，全身抽搐，無法正常飛行。黑蜂王臺病毒的主要傳播方式為通過蜜蜂口器互飼的行為傳播，當(dāng)黑蜂王臺病毒與其他病毒共同存在時，會產(chǎn)生聯(lián)合危害，并表現(xiàn)出極強(qiáng)的致病能力。

表1 黑蜂王臺病毒病原特征

2.病害防治

通常情況下，受到黑蜂王臺病毒感染的蜜蜂當(dāng)發(fā)現(xiàn)感染時已經(jīng)說明蜜蜂體內(nèi)黑蜂王臺病毒已經(jīng)達(dá)到一定數(shù)量，各組織器官也已經(jīng)受到了嚴(yán)重的損傷。因此，根據(jù)黑蜂王臺病毒檢測結(jié)果、病原、傳播途徑等特征進(jìn)行分析，得出針對其病害防治措施主要包括兩種：一種為物理防治措施，另一種為藥物防治措施。其中物理防治措施主要針對蜂農(nóng)而言，在蜜蜂養(yǎng)殖過程中通過對蜂場、蜂具以及飼料的衛(wèi)生清潔和消毒，預(yù)防黑蜂王臺病毒的產(chǎn)生，還可以通過選育抗黑蜂王臺病毒蜂種進(jìn)行預(yù)防。藥物防治措施可通過使用抗病毒藥物或中草藥喂食蜜蜂的方式預(yù)防。在實(shí)際應(yīng)用過程中，藥物防治產(chǎn)生的藥物殘留會對蜜蜂健康及蜂產(chǎn)品造成不同程度污染。應(yīng)根據(jù)具體情況選擇對應(yīng)的防治措施，從而將損失降到最低。

除此之外，還可采用RNA干擾技術(shù)對黑蜂王臺病毒進(jìn)行防治，根據(jù)本文論述可知，通過檢測的方式可對該病毒的基因進(jìn)行定量和定性，通過RNA干擾技術(shù)對病毒進(jìn)行針對性的沉默或下調(diào)某個基因結(jié)構(gòu)的方式，降低病毒的表達(dá)水平，從分子結(jié)構(gòu)上，削弱或消除黑蜂王臺病毒的增殖能力。

三、結(jié)束語

當(dāng)前，生物技術(shù)正處于高速發(fā)展的時期，生物檢測技術(shù)與分析工具得到了不斷地完善和創(chuàng)新，這些技術(shù)涉及到對生物蛋白質(zhì)組、代謝產(chǎn)物、轉(zhuǎn)錄組等分析，同時也涉及到對海量生物數(shù)據(jù)的分析與處理。盡管當(dāng)前大部分的生物技術(shù)價格高昂，在一定程度上限制了新技術(shù)的應(yīng)用與推廣，但它是一種功能強(qiáng)大、效率極高的生物手段。本文通過對黑蜂王臺病毒基因檢測及其病害診斷防治方法，以威脅蜜蜂健康狀況常見的病毒為例，結(jié)合定量逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)可以有效實(shí)現(xiàn)對病毒的定性和定量，以此為蜜蜂養(yǎng)殖及蜂產(chǎn)品生產(chǎn)質(zhì)量和安全提供保障。