SS18陽性滑膜肉瘤中ALK及C-met的表達(dá)及其臨床意義

陳少華，曾德華，曲利娟，鄭智勇，陳一峰，歐陽小娟，王旭洲，許存寶，吳春林

滑膜肉瘤是一種少見的惡性間葉源性腫瘤，患者總體預(yù)后不良，尤其是難以根治切除、晚期復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移者[1]。間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)及間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子(cellular-mesenchymal to epithelial transition factor, C-met)均屬于酪氨酸激酶受體家族成員，其過表達(dá)常與腫瘤晚期相關(guān)，提示患者預(yù)后不良[2-3]。目前，ALK及C-met的研究和臨床應(yīng)用更多局限于惡性上皮性腫瘤，如非小細(xì)胞肺癌等[4]，國(guó)內(nèi)外對(duì)惡性間葉源性腫瘤的研究少見[5-8]，尤其是滑膜肉瘤。本實(shí)驗(yàn)擬通過免疫組化、FISH、RT-PCR檢測(cè)ALK及C-met在滑膜肉瘤中的表達(dá)，探討其與臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性，以期為指導(dǎo)臨床治療和預(yù)后評(píng)估提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院、中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院及福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州市第一醫(yī)院病理科2006年6月～2019年6月經(jīng)病理確診的82例滑膜肉瘤，并制成組織微陣列，經(jīng)SS18 FISH檢測(cè)共篩選出陽性38例。收集38例SS18陽性滑膜肉瘤的臨床病理及隨訪資料，其中有5例為術(shù)后復(fù)發(fā)，其余術(shù)前均未進(jìn)行任何相關(guān)治療，治療方案均為腫瘤切除，部分輔以淋巴結(jié)清掃。38例患者中失訪2例，另36例患者隨訪時(shí)間5～143個(gè)月，中位隨訪時(shí)間44個(gè)月。本實(shí)驗(yàn)獲福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均知情同意。

1.2 組織微陣列復(fù)習(xí)82例滑膜肉瘤HE切片，選取代表性區(qū)域(圖1)，采用Quick-Ray組織微陣列系統(tǒng)，從供體蠟塊中抽取典型腫瘤組織2個(gè)點(diǎn)，移至預(yù)制受體蠟塊(2.0 mm直徑，6×10位點(diǎn))相應(yīng)孔內(nèi)，以正常肝組織為起始標(biāo)記點(diǎn)，制成組織微陣列蠟塊；行4 μm厚連續(xù)切片，制成可供FISH檢測(cè)及免疫組化染色使用的組織微陣列數(shù)張。手動(dòng)組織微陣列儀Quick-Ray(型號(hào)UATM-272)及預(yù)制受體蠟塊均購(gòu)自韓國(guó)UNITMA公司。

1.3 免疫組化免疫組化染色在Ventana全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)中完成，并設(shè)置陽性及陰性對(duì)照。一抗兔抗人ALK單克隆抗體(D5F3，工作液)購(gòu)自Ventana Medical Systems公司；鼠抗人ALK單克隆抗體(5A4，工作液)購(gòu)自福州邁新公司；兔抗人C-met單克隆抗體(SP44，工作液)購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.4 FISH將相應(yīng)組織切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水，熱水浴，蛋白酶K消化，10%中性福爾馬林固定，梯度乙醇脫水，加相應(yīng)探針混合液(SS18、ALK、C-met)，雜交儀85 ℃變形，42 ℃雜交過夜，NP-40/SSC洗滌，70%乙醇洗片，干燥，加DAPI復(fù)染劑，封固。SS18(SYT)基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京金菩嘉公司。ALK及C-met基因檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自Abbott Molecular公司。

1.5 RT-PCRALK(D5F3)蛋白高表達(dá)者組織5 μm厚切片10張，烤片后按HE切片劃定的腫瘤區(qū)域，用無菌刀將組織刮入1.5 mL EP管中。RNA提取試劑盒提取RNA后，用人類EML4-ALK融合基因試劑盒在AMx3000P測(cè)序儀上檢測(cè)。具體操作步驟參考試劑盒說明書。RNA提取試劑盒及人類EML4-ALK融合基因試劑盒，均購(gòu)自廈門艾德生物公司。

1.6 結(jié)果判讀

1.6.1FISH判讀 SS18及ALK易位：計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，>15%的細(xì)胞核顯示紅綠信號(hào)分離，且大于信號(hào)寬度2倍以上，判為基因易位，否則為陰性。C-met擴(kuò)增：計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞中Met和CEP7信號(hào)的數(shù)量，若Met/CEP7比值≥2.2，則為陽性；若Met/CEP7比值<2.2，但平均Met拷貝數(shù)≥5.0，亦為陽性；若Met/CEP7比值<2.2且平均Met拷貝數(shù)<5.0，則為陰性。

1.6.2免疫組化評(píng)分 ALK定位在細(xì)胞質(zhì)，C-met定位在細(xì)胞質(zhì)/膜。按染色細(xì)胞百分率計(jì)分：<1%為0分；1%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分；按細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：無陽性染色為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。將兩項(xiàng)評(píng)分相乘作為最終評(píng)分：0分為陰性，1～3分為弱陽性，4～7分為中度陽性，>7分為強(qiáng)陽性；中度陽性及強(qiáng)陽性定義為高表達(dá)。所有結(jié)果均經(jīng)2位病理醫(yī)師獨(dú)立評(píng)估，意見不一致病例在多頭顯微鏡下共同協(xié)商確定。

1.6.3RT-PCR判讀 EML4-ALK結(jié)果判讀具體參考人類EML4-ALK融合基因試劑盒說明書。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，利用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法分析ALK(D5F3)及C-met表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 滑膜肉瘤中SS18基因的表達(dá)82例滑膜肉瘤的組織微陣列經(jīng)SS18 FISH檢測(cè)，共篩出38例SS18信號(hào)分離病例(圖2)。

2.2 SS18陽性滑膜肉瘤的臨床病理特征38例SS18陽性滑膜肉瘤患者年齡8～72歲，平均41歲；發(fā)生于四肢23例(60.5%)；軀干15例(39.5%)，其中肺及腎臟各2例，腹膜后1例；原發(fā)33例(86.8%)，復(fù)發(fā)5例(13.2%)。根據(jù)FNCLCC分級(jí)系統(tǒng)及第8版AJCC分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)及TNM分期，其中5例復(fù)發(fā)腫瘤未進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)及TNM分期，肺及腎臟共4例無明確TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，故組織學(xué)分級(jí)Ⅰ級(jí)0例，Ⅱ級(jí)19例(57.6%)，Ⅲ級(jí)14例(42.4%)；TNM分期Ⅰ期0例，Ⅱ期14例(48.3%)，Ⅲ期15例(51.7%)。

2.3 SS18陽性滑膜肉瘤中ALK和C-met蛋白表達(dá)及與臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系38例SS18陽性滑膜肉瘤中，ALK(D5F3)陽性7例(18.4%)，其中6例弱陽性，1例強(qiáng)陽性(圖3)，高表達(dá)率為2.6%(1/38)。ALK(5A4)均為陰性(圖4)。C-met陽性7例(18.4%)，其中3例弱陽性，3例中度陽性，1例強(qiáng)陽性(圖5)，高表達(dá)率為10.5%(4/38)。ALK/C-met高表達(dá)者4例，其中ALK+/C-met+者1例，ALK-/C-met+者3例(表1)。C-met表達(dá)與組織學(xué)分型、組織學(xué)分級(jí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)，而在患者性別、年齡、部位、腫瘤直徑、核分裂數(shù)、臨床分期和預(yù)后，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但高表達(dá)者病死率或轉(zhuǎn)移率達(dá)75%(3/4)。ALK(D5F3)表達(dá)在各臨床病理特征上差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但唯一高表達(dá)者發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。ALK(D5F3)與C-met兩者表達(dá)無明顯相關(guān)性(r=0.124，χ2=0.588，P=0.383)。

2.4 ALK及C-met基因檢測(cè)唯一ALK(D5F3)蛋白高表達(dá)者ALK FISH檢測(cè)見ALK基因易位(腫瘤細(xì)胞約20%)(圖6)，但EML4-ALK RT-PCR為陰性。4例C-met蛋白高表達(dá)者C-met FISH均為陰性(圖7，表1)。

①②③④⑤⑥⑦

3 討論

近年來，針對(duì)ALK/C-met靶點(diǎn)的研究及其靶向藥物的臨床應(yīng)用已在眾多惡性上皮性腫瘤中取得重大進(jìn)展，在間變性大細(xì)胞淋巴瘤及神經(jīng)母細(xì)胞瘤中也證實(shí)有效果，但對(duì)惡性間葉源性腫瘤的研究及臨床試驗(yàn)仍少見，尤其是滑膜肉瘤。研究顯示，ALK及C-met蛋白在橫紋肌肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤及未分化肉瘤中均有一定陽性率，且均有少量ALK及C-met FISH陽性病例存在[5-8]。此外，炎性肌纖維母細(xì)胞性腫瘤、腺泡狀軟組織肉瘤，惡性外周神經(jīng)鞘膜瘤、尤因肉瘤等也存在ALK蛋白及ALK FISH陽性病例[7,9-12]；而透明細(xì)胞肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤等也存在C-met蛋白及C-met FISH陽性病例[6,13]。文獻(xiàn)有報(bào)道少量ALK/C-met蛋白陽性滑膜肉瘤，但進(jìn)一步行C-met FISH檢測(cè)較少，總之ALK易位或C-met擴(kuò)增滑膜肉瘤病例罕見[6-7]。本實(shí)驗(yàn)在較大宗基因確診滑膜肉瘤病例中對(duì)ALK及C-met表達(dá)情況進(jìn)行探討。

表2 SS18陽性滑膜肉瘤中ALK及C-met表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系[n(%)]

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C-met在滑膜肉瘤中陽性率為18.4%(7/38)，其表達(dá)在組織學(xué)分型、組織學(xué)分級(jí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示：(1)陽性組中雙相型明顯多于單相型，并觀察到5例雙相型陽性病例中上皮成分均有表達(dá)，僅1例同時(shí)表達(dá)少量梭形細(xì)胞成分；(2)陽性組中組織學(xué)分級(jí)Ⅲ級(jí)明顯居多，而在臨床分期及預(yù)后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但觀察到75%(3/4)高表達(dá)者出現(xiàn)死亡或轉(zhuǎn)移，提示C-met陽性患者預(yù)后欠佳。ALK(D5F3)在滑膜肉瘤中陽性率為18.4%(7/38)，其表達(dá)與各臨床病理特征差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且其與C-met表達(dá)無明顯相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)ALK(5A4)蛋白，但結(jié)果均為陰性，故對(duì)滑膜肉瘤ALK蛋白初篩，建議選用克隆號(hào)D5F3更為合適。

本組中ALK/C-met蛋白高表達(dá)者僅4例，其中ALK+/C-met+者1例，ALK-/C-met+者3例。ALK+/C-met+者免疫表型為ALK(D5F3)彌漫強(qiáng)陽性、C-met多灶中度陽性；ALK FISH陽性提示腫瘤細(xì)胞存在ALK基因易位，但EML4-ALK RT-PCR陰性提示ALK基因不與EML4基因發(fā)生融合；C-met FISH未見C-met擴(kuò)增；該患者于術(shù)后36個(gè)月發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。3例ALK-/C-met+者C-met FISH均未見C-met擴(kuò)增。Fleuren等[14]研究顯示ALK蛋白在14%(6/43)滑膜肉瘤中表達(dá)，6例陽性腫瘤僅1例顯示ALK易位，而C-met蛋白陽性率超過50%，但未進(jìn)一步行C-met FISH檢測(cè)，且未對(duì)該組病例進(jìn)行相關(guān)臨床病理分析。本實(shí)驗(yàn)ALK陽性率與Fleuren等[14]研究結(jié)果基本一致，但C-met蛋白陽性率明顯偏低。

文獻(xiàn)報(bào)道克唑替尼、TAS-115等作為ALK/C-met靶點(diǎn)的雙重酪氨酸激酶抑制劑，對(duì)體外和體內(nèi)ALK/C-met依賴的滑膜肉瘤細(xì)胞均具有抑制生長(zhǎng)作用[14-15]，且以往文獻(xiàn)及本實(shí)驗(yàn)均顯示ALK及C-met在滑膜肉瘤中有一定陽性率，提示ALK/C-met可能是該亞型的潛在治療靶點(diǎn)，但尚未見ALK/C-met抑制劑針對(duì)該亞型治療的相關(guān)臨床試驗(yàn)。克唑替尼在炎性肌纖維母細(xì)胞性腫瘤患者靶向治療中有明顯療效[11]，個(gè)別晚期上皮樣炎性肌纖維母細(xì)胞肉瘤患者可獲得明顯緩解[12]，但其腫瘤組織中均可檢測(cè)到ALK蛋白表達(dá)及基因易位；而對(duì)橫紋肌肉瘤及透明細(xì)胞肉瘤卻均未觀察到明顯臨床客觀反應(yīng)，文獻(xiàn)報(bào)道多數(shù)病例可檢出ALK/C-met蛋白表達(dá)，但未能檢測(cè)到ALK易位或C-met擴(kuò)增，或未闡述基因檢測(cè)情況[13]。因此，作者建議針對(duì)ALK/C-met靶點(diǎn)的滑膜肉瘤臨床試驗(yàn)適應(yīng)者篩選，不應(yīng)僅有ALK/C-met蛋白表達(dá)，更應(yīng)有分子基因檢測(cè)確認(rèn)；無蛋白及基因檢測(cè)結(jié)果者，不建議應(yīng)用該類靶向藥物治療。

綜上，對(duì)滑膜肉瘤ALK蛋白初篩，選用克隆號(hào)D5F3更為合適?；と饬鲋蠧-met蛋白更常表達(dá)于雙相型上皮細(xì)胞成分及組織學(xué)分級(jí)高者，ALK/C-met高表達(dá)者預(yù)后欠佳。ALK及C-met在滑膜肉瘤中有一定陽性率，提示ALK/C-met可能是該亞型的潛在治療靶點(diǎn)。