沉默UHMK1對乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

武 艷，吳正升

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率均呈逐年上升趨勢，且發(fā)病年齡日趨年輕化[1]。目前，尚無有效的治療方法控制乳腺癌的復發(fā)和轉(zhuǎn)移，其復發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是導致患者死亡的主要原因[2]。因此，探索乳腺癌轉(zhuǎn)移和復發(fā)的新機制，改善患者的預后至關(guān)重要。U2AF同源基序激酶1(U2AF homologous kinase 1, UHMK1)被證明可以與一系列蛋白結(jié)合，如eEF1A、FAM64、CDKI、p27KIP1、SF3b155和CPEB1，表明UHMK1在不同的細胞過程中發(fā)揮不同作用[3-4]。更重要的是，相關(guān)研究表明UHMK1表達異常與胰腺癌、卵巢癌及胃癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[5-7]。目前，關(guān)于UHMK1對乳腺癌的影響在國內(nèi)外相關(guān)研究中尚未見報道。本實驗使用shRNA干擾乳腺癌細胞系MDA-MB-231中UHMK1的表達，分析UHMK1對乳腺癌增殖和轉(zhuǎn)移的影響，為進一步明確乳腺癌轉(zhuǎn)移和復發(fā)的機制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑人乳腺癌細胞株MDA-MB-231和人胚胎腎細胞系293T均由中國科學技術(shù)大學朱濤教授惠贈；Leibovitz’s-L15培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)(美國GIBCO公司)；0.25%胰蛋白酶(Trypsin-EDTA)和蛋白裂解液(碧云天生物公司)；Trizol(美國Invitrogen公司)；兔抗人UHMK1抗體、鼠抗人Actin抗體(武漢三鷹生物公司)，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑和實時熒光定量PCR試劑(全式金生物公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)人乳腺癌細胞株MCF-7采用含有10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的Leibovitz’s -L15培養(yǎng)基在37 ℃、無CO2條件下培養(yǎng)。人胚胎腎細胞系293T采用含有10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、含有5%CO2的條件下培養(yǎng)。

1.3 UHMK1-shRNA真核表達載體構(gòu)建根據(jù)shRNA設計原則，靶向設計UHMK1的shRNA，UHMK1-shRNA#1：5′-CCGGGAGTGCAGAGAATGAATG TTTCTCGAGAAACATTCATTCTCTGCACTCTTTTT-3′，UHMK1-shRNA#2：5′-CCGGCCCATTCTTTAGCATTC CTTTCTCGAGAAAGGAATGCTAAAGAATGGGTTTTT-3′。退火處理：99 ℃起，每分鐘下降1 ℃，直至4 ℃保存。用Solution Ⅰ連接酶將準備好的插入片段連接到已酶切且含有嘌呤霉素和氨芐抗性的載體Plko.1，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞。24 h后，觀察群落生長情況并挑取菌落，測序鑒定。

1.4 慢病毒包裝和穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的構(gòu)建將7.1 μg psPAX2、4.0 μg pMD2G、11.3 μg待包裝質(zhì)粒，混勻后加入330 μL的0.1×TE緩沖液，56.5 μL的2.5 mol/L氯化鈣溶液，加水至570 μL并混勻；緩慢加入570 μL的2×HBS緩沖液，邊加邊震動；室溫孵育15 min，緩慢加入到70%豐度的293T細胞中，輕輕搖勻。接著將使用上述方法收集并使用0.45 μm濾膜過濾的慢病毒加入MDA-MB-231細胞，48 h后加入嘌呤霉素維持培養(yǎng)，進而篩選含有嘌呤霉素抗性的細胞，從而構(gòu)建UHMK1穩(wěn)定敲低的細胞系。收集上述構(gòu)建的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系并在RNA和蛋白水平分別對敲低效率進行檢測，檢測成功后用于后續(xù)實驗。

1.5 RNA提取和qRT-PCR法使用Trizol試劑從上述構(gòu)建的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系中提取總RNA。按照42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min的程序進行逆轉(zhuǎn)錄。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，進行qRT-PCR反應。GAPDH為內(nèi)參，每組設定3個平行孔。qRT-PCR引物序列如下：GAPDH上游5′-AGCAAGAGCACAA GAGGAAG-3′，下游5′-GGTTGAGCACAGGGTACTT T-3′；UHMK1上游5′-AGAGAAACCATGGGCAGAA G-3′，下游5′-CAAGCCATGAAACAGCATCT-3′；引物均由上海生工生物公司合成。

1.6 蛋白提取和Western blot法收集上述構(gòu)建成功的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，使用蛋白裂解液裂解并提取總蛋白，以actin為內(nèi)參進行10%SDS-PAGE凝膠電泳，在300 mA條件下轉(zhuǎn)膜后置于5%脫脂牛奶中室溫搖床封閉1 h；接著一抗4 ℃孵育過夜，使用PBST洗膜3次后加入二抗，室溫孵育1 h，洗膜3次，漂洗后使用ECL避光顯影。

1.7 MTT實驗檢測MDA-MB-231細胞活力使用PBS洗滌并用胰酶消化待檢測的細胞，使用培養(yǎng)基將細胞濃度調(diào)整為2×104/mL，在96孔板中每孔接種100 μL，每組重復6個孔，設置5個相同的96孔板。于24 h后檢測細胞活力，棄培養(yǎng)液后每孔加入100 μL MTT液，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，將MTT液更換為等體積的DMSO并避光輕搖15 min。最后，使用酶標儀測定570 nm波長處吸光度值。

1.8 克隆形成實驗檢測MDA-MB-231細胞克隆形成能力使用PBS洗滌并用胰酶消化待檢測的細胞，使用培養(yǎng)基將細胞濃度調(diào)整為1×103/mL，在6孔板中每孔接種2 mL，每組重復3個孔。于14天后使用甲醛固定，結(jié)晶紫染色，并拍照留存。

1.9 Transwell實驗檢測MDA-MB-231細胞遷移和侵襲能力在Transwell小室的下室中加入600 μL含有10%FBS的培養(yǎng)基，常規(guī)消化處理細胞并使用無血清培養(yǎng)基將細胞濃度調(diào)整為5×105/mL。每組各取200 mL分別加入無或有Matrigel包被的上室中，分別培養(yǎng)8、16 h。培養(yǎng)結(jié)束后，置于甲醛中固定30 min，使用結(jié)晶紫染色，PBS清洗后拍照留存。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR和Western blot檢測感染UHMK1-shRNA的效率采用qRT-PCR和Western blot法分別檢測MDA-MB-231細胞中UHMK1-shRNA的干擾效率，結(jié)果顯示，與感染Plko.1的對照組相比，UHMK1-shRNA#1和UHMK1-shRNA#2組UHMK1的mRNA和蛋白水平均顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖1)。

圖1 A.qRT-PCR檢測在MDA-MB-231中UHMK1-shRNA對UHMK1 mRNA的干擾效率；B.Western blot法檢測在MDA-MB-231中UHMK1-shRNA對UHMK1蛋白的干擾效率

2.2 沉默UHMK1對MDA-MB-231細胞活力的影響使用上述構(gòu)建的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，應用MTT法檢測感染UHMK1-shRNA對MDA-MB-231細胞活力的影響。MTT實驗結(jié)果顯示，與感染Plko.1的對照組相比，感染UHMK1-shRNA#1和UHMK1-shRNA#2后，細胞活力顯著下降(P<0.01，圖2)。

圖2 MTT檢測干擾UHMK1表達對MDA-MB-231細胞活力的影響

2.3 沉默UHMK1對MDA-MB-231細胞克隆形成能力的影響應用克隆形成實驗檢測感染UHMK1-shRNA對MDA-MB-231細胞克隆形成能力的影響?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果顯示，與感染Plko.1的對照組相比，感染UHMK1-shRNA#1和UHMK1-shRNA#2后，細胞克隆形成能力顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖3)。

圖3 克隆形成實驗檢測干擾UHMK1的表達對MDA-MB-231細胞增殖能力的影響

2.4 沉默UHMK1對MDA-MB-231細胞遷移和侵襲能力的影響應用Transwell實驗檢測感染UHMK1-shRNA對MDA-MB-231細胞遷移和侵襲能力的影響。Transwell實驗結(jié)果顯示，與感染Plko.1的對照組相比，感染UHMK1-shRNA#1和UHMK1-shRNA#2后，細胞遷移及侵襲能力均顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖4)。

3 討論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，也是繼肺癌后女性惡性腫瘤相關(guān)死亡的第二大原因[8]。目前乳腺癌的治療方式是以手術(shù)治療為主，放、化療和分子靶向治療為輔，盡管各種治療方法有了一定進展，但治療效果依然無突破性改變[9-11]。近年，關(guān)于乳腺癌治療的相關(guān)生物學指標研究較多。張明珍等[12]采用免疫組化法檢測42例乳腺癌及其對應癌旁正常組織中STRING蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)STRING蛋白在乳腺癌中低表達，且STRING蛋白低表達是乳腺癌患者術(shù)后復發(fā)的危險因素之一。居紅格等[13]通過對76例乳腺癌及其配對的癌旁正常乳腺組織進行免疫熒光染色分析發(fā)現(xiàn)，RHBDD1在乳腺癌中高表達，且RHBDD1與EGFR的表達呈正相關(guān)，推測RHBDD1可能通過參與EGFR通路的激活，誘導乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。盡管如此，乳腺癌復發(fā)和轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制仍不明確。因此，尋找與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵基因及其分子機制，目前已成為該領(lǐng)域迫切需要解決的科學問題。

UHMK1是一種廣泛表達的核絲氨酸/蘇氨酸激酶[14]。Katchman等[15]利用一種可編程的ELISA平臺對153例血清樣本進行檢測，其中包括63例卵巢癌樣本、30例良性卵巢對照樣本以及60例健康對照樣本；檢測發(fā)現(xiàn)UHMK1在卵巢癌患者的血清樣本中表達上調(diào)。Wei等[16]通過轉(zhuǎn)錄組分析以及實驗發(fā)現(xiàn)UHMK1是YAP的直接轉(zhuǎn)錄靶點，可調(diào)控特定細胞周期調(diào)控基因的表達，如CCNB1和CCNB2，并影響肝癌細胞的增殖以及DNA修復。此外，F(xiàn)eng等[17]通過分析癌癥基因組圖譜(TCGA)中的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)UHMK1的DNA在胃癌中經(jīng)常出現(xiàn)擴增。通過分子生物學相關(guān)實驗檢測發(fā)現(xiàn)UHMK1在胃癌中顯著上調(diào)，進一步通過體、內(nèi)外實驗證實其可通過促進嘌呤合成途徑誘導胃癌的發(fā)生、發(fā)展。但是，關(guān)于UHMK1在乳腺癌中的具體功能尚未見相關(guān)報道。為探索UHMK1在乳腺癌進展中的作用，本實驗選取了乳腺癌細胞系MDA-MB-231，采用shRNA干擾其UHMK1表達，并進一步使用嘌呤霉素篩選構(gòu)建成穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，進行一系列的分子生物學實驗。實驗結(jié)果顯示：干擾UHMK1表達后，乳腺癌細胞的細胞活力、克隆形成能力、遷移及侵襲能力均顯著下降，與上述研究結(jié)果一致。

綜上所述，沉默UHMK1表達可抑制乳腺癌的增殖、遷移及侵襲能力。由此推測，UHMK1可能參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，但其具體作用機制還有待于進一步分析，可在一定程度上為乳腺癌的診斷和治療提供新思路。