五指毛桃對小鼠酒精性肝損傷的保護作用

張 茹，杜 娟

(哈爾濱商業(yè)大學 藥學院，哈爾濱 150076)

五指毛桃為桑科(Moraceae)榕屬(Ficus)植物粗葉榕(FicushirtaVahl)的干燥根[1]，主要分布于我國南部及西南部地區(qū)，其根、果均可入藥.傳統(tǒng)中醫(yī)認為，五指毛桃具有健脾補氣、化濕行氣、舒筋活絡(luò)等功效.近年來研究發(fā)現(xiàn)，五指毛桃中含有苯丙素類、黃酮類、萜類、甾醇類及揮發(fā)油類等多種類型的化合物[2].有研究表明，五指毛桃對毒品可卡因所致的肝毒性、二甲基甲酰胺所致的急性肝損傷及拘束應(yīng)激性肝損傷等均具有優(yōu)良的肝保護作用[3-5].有關(guān)五指毛桃對酒精性肝損傷保護作用的研究還相對較少，本文旨在通過復制小鼠醉酒模型，以五指毛桃提取液為實驗藥物，以葛花為陽性對照，考察五指毛桃對酒精性肝損傷實驗中小鼠的干預保護作用.

1 材料與方法

1.1 實驗動物

ICR雄性小鼠，體重18～22 g，長春市億斯實驗動物有限公司提供，動物許可證號：STK(吉2018-0007).

1.2 材料與試劑

五指毛桃購自廣東省河源市、葛花購自黑龍江省哈爾濱市中藥市場，經(jīng)中藥教研室張翠教授鑒定為正品.56度牛欄山二鍋頭，北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠.超氧化物歧化酶(SOD)、還原谷胱甘肽(GSH)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)和考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所.

1.3 儀器與設(shè)備

XZC-1型小鼠自主活動測定儀、722型紫外-可見光分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)、多功能酶標儀(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司).

1.4 實驗方法

1.4.1 藥物的制備

1)葛花提取液的制備

稱取葛花，料液比1∶10，水中浸泡1 h后煎煮.煮沸后改文火煮1 h，傾出煎液加10倍量水繼續(xù)煎煮1 h.合并兩次濾液，將濾液濃縮為2 g/mL濃縮液，密封，放入冰箱4 ℃冷藏備用.

2)五指毛桃提取液的制備

稱取五指毛桃，加入10倍量水，水中浸泡1 h后煎煮.煮沸后改文火煮1 h ，傾出煎液加10倍量水繼續(xù)煎煮1 h.合并兩次濾液，將濾液濃縮為2 g/mL 濃縮液，密封，放入冰箱 4 ℃冷藏備用.

1.4.2 分組及給藥

將小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為空白對照組、模型對照組、葛花組、五指毛桃低、中、高劑量組.葛花組按0.53 g/(kg·d)劑量灌胃葛花提取液；五指毛桃低、中、高劑量組按0.2 g/(kg·d)、0.4 g/(kg·d)、0.6 g/(kg·d)劑量灌胃五指毛桃提取液；空白對照組和模型對照組灌胃等量0.9 %生理鹽水.30 min后，除空白對照組外，劑量組和模型對照組分別按劑量10 mL/kg 灌胃牛欄山二鍋頭(56%乙醇)，連續(xù)灌胃10天，空白對照組灌胃等量蒸餾水.給藥劑量參考文獻[6-8]和預實驗確定.各組均常規(guī)飲水和喂食.每日灌胃前稱量記錄小鼠體質(zhì)量.末次給藥2 h后進行標本采集.

1.4.3 自主活動試驗

將灌酒后的小鼠放入自主活動儀內(nèi)，適應(yīng)5 min.然后開始記錄小鼠在自主活動箱5 min內(nèi)穿越格子的數(shù)量，作為小鼠自主活動次數(shù).

1.4.4 肝臟標本采集及檢測

處死小鼠，剖腹取小鼠肝臟組織，放入預冷的生理性鹽水中快速漂洗去除血跡，濾紙吸干肝組織的生理鹽水，擦拭后稱重，計算肝臟指數(shù)，肝臟指數(shù)=完整肝臟濕重/體質(zhì)量×100%.按照組織質(zhì)量:生理鹽水體積比為1∶9的比例加入生理鹽水，手動研磨制成10%肝組織勻漿.分別測定肝勻漿組織中GSH含量及SOD活性.采用ELISA法檢測肝組織中IL-6、IL-1β、TNF-α和 NF-κB水平.采用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì).

1.5 統(tǒng)計學處理

2 實驗結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量變化

與造模前相比，各組小鼠體質(zhì)量并無顯著性差異(P>0.05).結(jié)果見表1.

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化

2.2 各組小鼠自主活動變化

與空白對照組相比，模型對照組的自主活動次數(shù)明顯增加(P<0.05)；與模型對照組相比，五指毛桃各劑量組小鼠的自主活動次數(shù)有所減少，但差異無明顯統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與葛花組相比，五指毛桃高劑量組小鼠自主活動次數(shù)減少，但差異無明顯統(tǒng)計學意義(P>0.05).結(jié)果見表2.

表2 各組小鼠自主活動變化

2.3 各組小鼠肝臟指數(shù)變化

與空白對照組相比，模型組的肝臟指數(shù)升高(P<0.05)，說明造模成功，五指毛桃低、中劑量組肝臟指數(shù)與空白對照組相接近，兩者差異無明顯統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與模型對照組相比，各組動物肝臟指數(shù)均有所下降，其中，五指毛桃低劑量組的肝臟指數(shù)明顯低于模型組(P<0.05)；與葛花組相比，五指毛桃低、中劑量組的肝臟指數(shù)低于葛花組，兩者差異無明顯統(tǒng)計學意義(P>0.05).結(jié)果見表3.

表3 各組小鼠肝臟指數(shù)變化

2.4 各組小鼠肝組織中GSH含量及SOD活性變化

2.4.1 各組小鼠肝組織中GSH含量變化

與空白對照組相比，模型組GSH含量顯著降低(P<0.05)，說明造模成功；與模型對照組相比，五指毛桃各劑量組GSH含量雖有所升高，但沒有顯著性差異(P>0.05)；與葛花組相比，五指毛桃各劑量組GSH含量有所降低，但沒有顯著性差異(P>0.05).結(jié)果見表4.

2.4.2 各組小鼠肝組織中SOD活性變化

與空白對照組相比，模型對照組SOD活性顯著降低(P<0.05)，說明造模成功；與模型對照組相比，五指毛桃中、高劑量組SOD活性顯著升高(P<0.05)，五指毛桃低劑量組SOD活性雖有所升高，但沒有顯著性差異(P>0.05).與葛花組相比，五指毛桃中、高劑量組SOD活性顯著升高(P<0.05).SOD活性隨五指毛桃劑量的增加而升高.結(jié)果見表4.

表4 各組小鼠肝組織中GSH含量及SOD活性變化

2.5 各組小鼠肝組織中IL-6、IL-1β、TNF-α及NF-κB水平變化

2.5.1 各組小鼠肝組織中IL-6水平變化

與空白對照組相比，模型對照組IL-6水平顯著升高(P<0.05)，說明造模成功；與模型對照組相比，五指毛桃中劑量組IL-6水平顯著降低(P<0.05)，五指毛桃高、低劑量組IL-6水平雖有所降低但無顯著性差異(P>0.05)；與葛花組相比，五指毛桃各劑量組IL-6水平有所升高，但無顯著性差異(P>0.05).結(jié)果見表5.

2.5.2 各組小鼠肝組織中IL-1β水平變化

與空白對照組相比，模型對照組IL-1β水平顯著升高(P<0.05)，說明造模成功；與模型對照組相比，五指毛桃高、中劑量組IL-1β水平顯著降低(P<0.05)，五指毛桃低劑量組IL-1β水平雖有所降低但無顯著性差異(P>0.05)；與葛花組相比，五指毛桃高劑量組IL-1β水平有所降低但無顯著性差異(P>0.05).IL-1β水平隨五指毛桃劑量的增加而降低.結(jié)果見表5.

2.5.3 各組小鼠肝組織中TNF-α水平變化

與空白對照組相比，模型對照組TNF-α水平顯著升高(P<0.05)，說明造模成功；與模型對照組相比，五指毛桃高、中劑量組TNF-α水平顯著降低(P<0.05)，五指毛桃低劑量組TNF-α水平雖有所降低但無顯著性差異(P>0.05)；與葛花組相比，五指毛桃高、中劑量組TNF-α水平有所升高但無顯著性差異(P>0.05).結(jié)果見表5.

2.5.4 各組小鼠肝組織中NF-κB水平變化

與空白對照組相比，模型對照組NF-κB水平顯著升高(P<0.05)，說明造模成功；與模型對照組相比，五指毛桃高劑量組NF-κB水平顯著降低(P<0.05).與葛花組相比，五指毛桃組NF-κB水平有所升高但無顯著性差異(P>0.05).結(jié)果見表5.

表5 各組小鼠肝組織中IL-6、IL-1β、TNF-α、NF-κB水平變化

3 討 論

中醫(yī)學中對飲酒傷肝的認識和論述已有悠久的歷史，如文獻記載為“脅痛”“酒疸”“傷酒”“酒癖”“酒臌”等證候名[9].中醫(yī)學認為，酒為水谷之精，乃大熱之品.《本草綱目》記載: “酒…苦、甘、辛、大熱、有毒；行藥勢，通血脈，潤皮膚，散濕氣，除風下氣；少飲則和血行氣，多飲則殺人頃刻”[10].過量飲酒可導致臟腑功能失調(diào)，出現(xiàn)肝臟的損傷，其基本病因、病機為脾虛血瘀[11]，酒乃濕熱之邪，酒熱藏匿于血分，氣血津液被擾，從而出現(xiàn)氣滯、血瘀、痰凝等病理因素的蘊積；濕氣屬陰，易傷脾氣，脾的運化功能失常，使氣血生化不足，出現(xiàn)脾腎虧虛；熱邪屬陽，傷及肝陰，肝虛及腎，從而出現(xiàn)肝脾腎三臟及氣血陰陽的虛損[12-13].現(xiàn)代研究表明，酒精在肝臟氧化，其代謝過程會利用氧化應(yīng)激誘發(fā)大量自由基生成，從而引起機體功能紊亂，造成多系統(tǒng)損傷.正常肝組織內(nèi)存在多種抗氧化物質(zhì)，其中GSH、SOD的水平是反映酒精性肝損傷時肝臟清除自由基能力和抗氧化能力的重要指標，在抵抗酒精所致的肝損傷中起到關(guān)鍵作用[14]，提高SOD和GSH的活性，清除肝細胞中的自由基可以有效減輕酒精對機體的損傷.酒精引起的氧化損傷還可以繼發(fā)性激活肝臟炎癥反應(yīng)，導致釋放大量細胞因子和炎癥介質(zhì)[15].NF-κB是一種多功能核轉(zhuǎn)錄因子，氧化應(yīng)激和促炎性細胞因子能夠快速短暫激活NF-κB[16]，TNF-α、IL-6和IL-1β是NF-κB的經(jīng)典激活途徑中的靶點，與NF-κB結(jié)合使其被激活，介導肝組織變性、壞死，從而出現(xiàn)酒精性肝病[17-19].

現(xiàn)代研究提示，五指毛桃對化學性肝損傷，如急性CCl4肝損傷、二甲基甲酰胺所致肝損傷等具有保護作用[5,20].而葛花可有效減少由乙醇引起的肝細胞損傷[21-22].本實驗發(fā)現(xiàn)，五指毛桃提取物可明顯升高GSH含量及SOD活力，說明五指毛桃具有一定的抗氧化能力，可以通過增加GSH含量、提高SOD活性來減輕酒精對機體的損傷，對于酒精性肝損傷具有一定的保護作用.此外，五指毛桃提取物可使肝組織中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α、NF-κB水平下降，這可能與其主要活性成分香豆素類化合物、黃酮類化合物有關(guān).五指毛桃富含較多類黃酮類成分，黃酮類化合物具有豐富的藥理活性如抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗病毒及抗凝血等[23-24]；香豆素類化合物在五指毛桃中廣泛存在，是其主要活性成分，也是最早從中分離到的一類活性成分，其中補骨脂素及佛手柑內(nèi)酯已成為五指毛桃指標成分群中最有價值的質(zhì)量評價指標[2].因此，可以從五指毛桃保護肝損傷的有效成分及其作用機理進一步深入研究，為五指毛桃的開發(fā)和利用提供理論基礎(chǔ).