結(jié)直腸癌RAS、BRAF 基因狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系

黃莎 楊建偉 高煒 師怡 張和軍 林錦源 吳光峰 林鷺萍

李惠

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是我國(guó)常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前認(rèn)為與多條信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信號(hào)通路的異常激活在CRC 發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[2]。目前在中國(guó)人群，針對(duì)MAPK 信號(hào)傳導(dǎo)通路上KRAS、NRAS 及BRAF 基因狀態(tài)與CRC 臨床病理特征之間的關(guān)系認(rèn)識(shí)并不充分。本研究通過檢測(cè)分析370 例CRC 患者中KRAS、NRAS 及BRAF 基因常見位點(diǎn)突變情況，探索上述基因與臨床病理特征之間的關(guān)系，為CRC 患者的綜合治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2018 年1 月—2020 年11 月在福建省腫瘤醫(yī)院接受治療的370 例CRC 患者。所有患者組織標(biāo)本及臨床病理資料完整。本研究已獲得福建省腫瘤醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 KRAS、NRAS 及BRAF 基因突變檢測(cè)

用試劑盒DNA FFPE Tissue Kit 提取結(jié)直腸癌組織DNA，采用PCR 擴(kuò)增，用直接測(cè)序法檢測(cè)KRAS、NRAS 及BRAF 基因突變。

1.3 錯(cuò)配修復(fù)（MMR）蛋白表達(dá)檢測(cè)

使用BenchMark ULTRA 全自動(dòng)免疫組化儀進(jìn)行MMR 蛋白（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2）檢測(cè)，所用試劑均為福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)。MLH1、MSH2、MSH6、PMS2 均表達(dá)為（+）判為pMMR，而MLH1、MSH2、MSH6、PMS2 中任意一種表達(dá)為（-）則判為dMMR。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0 版軟件處理數(shù)據(jù)。采用χ2檢驗(yàn)或Fish 精確概率法分析基因狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系。P＜0.05 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病例資料

370 例CRC 患者中，男性236 例，女性134 例，年齡25 ～83 歲；右半結(jié)腸癌103 例，左半結(jié)腸癌及直腸癌267 例。

2.2 KRAS、NRAS 及BRAF 基因突變頻率及類型

370 例CRC 患者中，KRAS 基因突變率最高，突變患者155例（41.9%），其中第2、3、4 外顯子突變例數(shù)分別為138 例（89.0%）、8 例（5.2%）、9 例（5.8%）。其中KRAS 基因第2 外顯子第12 密碼子突變107 例，第13 密碼子突變31 例；第3 外顯子第59 密碼子突變2 例，第61 密碼子突變6 例；第4外顯子第117 密碼子突變0 例，第146 密碼子突變9 例。NRAS基因突變患者19 例（5.1%），其中第2、3、4 外顯子突變例數(shù)分別為10 例（52.6%）、9 例（47.4%）、0 例。其中NRAS基因第2 外顯子第12 密碼子突變6 例，第13 密碼子突變4 例；第3 外顯子第59 密碼子突變0 例，第61 密碼子突變9 例。BRAF 基因突變患者40 例（10.8%），其中1 例患者突變類型為G469V，其他39 例均為V600E 突變。

2.3 KRAS、NRAS 及BRAF 基因突變與CRC 臨床病理特征之間的關(guān)系

KRAS 基因在女性、高中分化患者中突變率高（P=0.009，P=0.007），但與患者年齡、腫瘤部位、大體類型、腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、MMR 蛋白表達(dá)無關(guān)。NRAS 基因在低分化、浸潤(rùn)型患者中突變率高（P=0.003），但與其他臨床病理因素?zé)o關(guān)。BRAF V600E 突變?cè)谟野虢Y(jié)腸癌、年齡小于50 歲患者中的突變率高（P=0.007、P=0.004），在低分化、浸潤(rùn)型患者中的突變率高（P=0.000），多發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P=0.047、P=0.001），但與性別、腫瘤浸潤(rùn)深度、MMR 蛋白表達(dá)無關(guān)。見表1。

表1 KRAS、NRAS 及BRAFV600E 突變與CRC 臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

3 討論

CRC 是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展，是由一系列復(fù)雜的遺傳和表觀遺傳事件逐漸累積所致。近年來，結(jié)直腸癌分型聯(lián)盟將CRC 的分子分型分為CMS 1-4 型，每種亞型具有各自的分子學(xué)及臨床特征[3]。但CMS 分型屬于群體分型，無法指導(dǎo)臨床治療。因此，我們需要對(duì)每一位患者進(jìn)行治療靶點(diǎn)的分型，通過檢測(cè)微衛(wèi)星狀態(tài)、MMR 蛋白、KRAS、NRAS、BRAF 等基因選擇治療策略。

臨床研究表明，全RAS 野生型患者在標(biāo)準(zhǔn)化療基礎(chǔ)上聯(lián)合表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）單抗可延長(zhǎng)生存期[4]。KRAS 或NRAS 基因突變是EGFR 單抗原發(fā)性耐藥的主要發(fā)生機(jī)制。在CRC 患者中，KRAS 突變率為40%，其中主要是第2 外顯子第12、13 密碼子突變[5]。本研究對(duì)KRAS 及NRAS 基因進(jìn)行檢測(cè)，KRAS 基因突變率為41.9%，第2 外顯子突變率為37.3%，與文獻(xiàn)報(bào)道相似。文獻(xiàn)報(bào)道在CRC 患者中KRAS 第3 外顯子突變率僅為2.1%[5]，本研究中第3 外顯子突變率為2.2%。國(guó)內(nèi)對(duì)于KRAS 第4 外顯子突變的報(bào)道很少，本研究檢測(cè)到第4 外顯子突變率為2.4%，均為第146 密碼子突變。有報(bào)道顯示，KRAS 基因突變與年齡、性別、原發(fā)腫瘤部位、TNM 分期等臨床病理特征無關(guān)[6]。本研究顯示，KRAS 基因在女性患者、高中分化患者中突變率高，但與患者年齡、腫瘤部位、大體類型、腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、MMR 蛋白表達(dá)無關(guān)。

研究結(jié)果顯示，NRAS 基因突變率為2.6%[7]。本研究檢測(cè)到NRAS 突變率為5.1%，其中第2、3 外顯子突變率分別為2.7%、2.4%，未檢測(cè)到第4 外顯子突變。本研究顯示，NRAS 基因在低分化、浸潤(rùn)型患者中突變率高，但NRAS 基因突變與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、MMR 蛋白表達(dá)無關(guān)。

BRAF 基因編碼的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶是MAPK 信號(hào)通路中重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子。在CRC 中，BRAF 基因突變率為5% ～10%[8-9]，最常見突變位點(diǎn)是V600E[10]。BRAF 基因V600E 突變患者有其獨(dú)特的臨床病理特征，常發(fā)生在右半結(jié)腸，分化差，與高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定和鋸齒狀腺瘤癌變途徑相關(guān)[11]。同時(shí)，BRAF 基因V600E 突變是晚期結(jié)直腸癌的獨(dú)立不良預(yù)后因素[12]。本研究檢測(cè)BRAF 基因突變率為10.8%，其中1 例為G469V 突變，其他均為V600E 突變。BRAF 基因V600E突變與KRAS、NRAS 基因突變不同時(shí)存在，但1 例BRAF 基因G469V 突變患者同時(shí)存在NRAS G12D 突變。本研究顯示，BRAF V600E 突變多發(fā)生于右半結(jié)腸癌、年齡小于50 歲、低分化、浸潤(rùn)型、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者中。文獻(xiàn)報(bào)道，dMMR CRC 中原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶分別有50%和25%的患者可檢測(cè)出BRAF 基因V600E 突變[1]。但本研究顯示BRAF 基因V600E突變與患者M(jìn)MR 蛋白表達(dá)無關(guān)，可能與樣本量較小有關(guān)。

本研究對(duì)370 例中國(guó)CRC 患者的KRAS、NRAS、BRAF 及MMR 蛋白進(jìn)行了檢測(cè)，收集整理了所有患者的臨床資料，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)基因突變狀態(tài)和臨床病理特征之間的關(guān)系進(jìn)行研究，為了解中國(guó)CRC 患者熱點(diǎn)基因突變分布情況和臨床精準(zhǔn)診療提供理論依據(jù)和重要參考。