硝酸咪康唑陰道軟膠囊中、美藥典計數(shù)方法對比研究

李林樾，李翠，賀聰瑩，楊曉莉

(陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，陜西 西安 710065)

硝酸咪康唑[1]，系一種廣譜、高效、毒副作用小的咪唑類抗真菌藥物，對大多數(shù)皮膚癬菌、酵母菌和放線菌等有良好的抗菌作用[2]，還對葡萄球菌、鏈球菌和炭疽桿菌等革蘭陽性菌有抑菌作用[3]。硝酸咪康唑陰道用軟膠囊的有效成分是硝酸咪康唑，為白色或微黃色軟膠囊，因針對皮膚真菌和酵母菌引起的瘙癢具有迅速的緩解作用而應(yīng)用普遍。各國藥典對外用制劑均要求進行微生物限度檢查，且明確在進行微生物限度檢查時，應(yīng)采取不同的前處理方式進行供試液的制備，以達到分散均勻的目的[4]。本品屬于油脂類供試品，樣品的前處理比較復(fù)雜，加之本品的強抑菌型，該品種的微生物計數(shù)方法成為試驗的難點[5]。本文根據(jù)《中國藥典》2020年版(四部)通則1105[6]和《美國藥典》41版<61>[7]微生物計數(shù)方法項下要求的方法適用性試驗進行方法驗證比較，以求能建立更為科學(xué)、實用、簡便、高效的硝酸咪康唑陰道軟膠囊微生物限度檢查方法。

1 設(shè)備與試劑、試藥

1.1 主要儀器與設(shè)備 SX-500蒸汽滅菌器；HFsafe-1200 LC生物安全柜；BS2202S型電子分析天平；LRH-250F生化培養(yǎng)箱；LRH-250F生化培養(yǎng)箱；LRH-250F生化培養(yǎng)箱；IPP260霉菌培養(yǎng)箱；VITEK2全自動微生物鑒定系統(tǒng)；Olympus CH型三目顯微鏡；PB-10 pH酸度計。

1.2 菌種 金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、黑曲霉(Aspergillusniger)，上述標準菌株均來自中國醫(yī)學(xué)細菌保藏管理中心，工作用菌株為第3代。

1.3 培養(yǎng)基及試劑 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB，批號：180820)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA，批號：181217)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA，批號：180108)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(SDB，批號：180731)、pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號：180820)均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。Modified Letheen-Broth Base(MLEB，EMD Millipore Corporation，有效期至20230910)；Fluid A(0.1%動物組織胃蛋白酶消化物，青島賓得生物技術(shù)有限公司，批號：20170704)，按說明書配置，滅菌。上述所用培養(yǎng)基的適用性檢查均符合藥典要求。

1.4 樣品 樣品編號1：硝酸咪康唑陰道軟膠囊，規(guī)格：0.4 g，批號：068772，西安楊森制藥有限公司生產(chǎn)；樣品編號2：硝酸咪康唑陰道軟膠囊，規(guī)格：0.4 g，批號：200303，南昌百濟制藥有限公司生產(chǎn)；樣品編號3：硝酸咪康唑陰道軟膠囊，規(guī)格：0.4 g，批號：200605，威海華新藥業(yè)集團有限公司。

2 實驗方法

2.1 菌液制備 將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌分別接種于TSB中，35 ℃培養(yǎng)24 h；將白色念珠菌接種于SDB中，25 ℃培養(yǎng)3 d。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液；將黑曲霉接種于SDA溶液，洗脫孢子，收集孢子懸液，用含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液。

2.2 《中國藥典》2020年版(四部)通則1105方法進行計數(shù)檢查適用性試驗(以下簡稱方法一) 根據(jù)以往的試驗結(jié)果，使用《中國藥典》2020年版(四部)中規(guī)定的中和劑與沖洗液試驗，先加入試驗菌后沖洗，試驗菌的回收率無法達到藥典要求，故選擇后加菌方式。

2.2.1 供試液制備 無菌取供試品4粒(約11.5 g)，加入pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，轉(zhuǎn)移至無菌均質(zhì)袋內(nèi)，用均質(zhì)器拍擊1 min，膠囊殼破裂，內(nèi)容物釋放，制成1∶10供試液。

2.2.2 試驗方法

2.2.2.1 試驗組 取1∶10供試液10 mL加入含200 mL 1%(mL/mL)聚山梨酯80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的輸液瓶中，混勻后薄膜過濾，用含1%(mL/mL)聚山梨酯80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗5次，100 mL/次，在最后一次沖洗液中分別加入不大于100 cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉試驗菌液。取出濾膜，菌面向上，貼于TSA平板或SDA平板上，按藥典規(guī)定培養(yǎng)，計數(shù)試驗組的菌落數(shù)。

2.2.2.2 菌液對照組 以pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨-緩沖液代替供試液，同“2.2.2.1”項下操作。

2.2.2.3 樣品對照組 不加金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉試驗菌液，同“2.2.2.1”項下操作。

2.3 《美國藥典》41版<61>方法進行計數(shù)檢查適用性試驗(以下簡稱方法二)

2.3.1 供試液制備 無菌取供試品4粒，加入120 mL已預(yù)熱的MLEB稀釋液中，均質(zhì)器拍擊1 min，膠囊殼破裂，內(nèi)容物釋放，制成1∶10供試液。

2.3.2 試驗方法

2.3.2.1 試驗組 取1∶10供試液9.9 mL，分別加入不大于1 000 cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉試驗菌液0.1 mL，混勻，全量加入已預(yù)熱的MLEB稀釋液490 mL，制成1∶500供試液。用10 mL Fluid A潤膜后，將1∶500供試液500 mL全部薄膜過濾，每張濾膜所過濾的供試液中含菌量不大于100 cfu。用990 mL Fluid A沖洗，100 mL/次。取出濾膜，菌面向上，貼于TSA平板或SDA平板上，按藥典規(guī)定培養(yǎng)，計數(shù)試驗組的菌落數(shù)。

2.3.2.2 菌液對照組 以MLEB稀釋液代替供試液，同“2.3.2.1”項下操作。

2.3.2.3 樣品對照組 不加金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉試驗菌液，同“2.3.2.1”項下操作。

2.4 回收計算 各試驗菌回收=(試驗組菌落數(shù)-供試液對照組菌落數(shù))/菌液組菌落數(shù)。分別計算方法一、方法二的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉試驗菌回收率，若回收率在0.5～2，方法適用性試驗通過。

3 結(jié)果

需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)測定各試驗菌回收試驗結(jié)果見表1。各試驗菌的回收率均在0.5～2，符合藥典要求。

表1 硝酸咪康唑陰道軟膠囊微生物計數(shù)薄膜過濾法回收試驗結(jié)果

4 討論

4.1 供試液制備方法 按照“取樣量10 g”的藥典要求，本品每粒約重2.90 g，取4粒約11.5 g，基本符合藥典取樣量要求。方法一中稀釋液為100 mL pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，這樣制得的供試液比例略大于1∶10。若調(diào)整稱樣量精確到10 g，因為軟膠囊劑的囊殼不好處理，用滅菌剪刀等處理有造成樣品污染的風(fēng)險；方法二中將4粒樣品加入120 mL稀釋液中，制得的供試液比例更接近1∶10，試驗結(jié)果更準確，操作更方便。

4.2 稀釋液預(yù)熱處理 方法一中稀釋液未預(yù)熱，拍擊后膠囊殼破碎但不溶解，供試液易沖洗過濾；方法二中稀釋液事先預(yù)熱，拍擊過程膠囊殼破碎且溶解，使得樣品中的微生物充分與稀釋液，沖洗后的濾膜上有少量膠囊殼的白色絮狀沉淀物。

4.3 加菌方式 兩種方法的加菌方式有所不同。方法一是將1∶10供試液10 mL稀釋、薄膜過濾、沖洗，在最后一次沖洗液中加入不大于100 cfu的試驗菌；方法二是先取1∶10供試液9.9 mL加入不大于1 000 cfu的菌液0.1 mL，混勻后稀釋，再進行薄膜過濾及沖洗，該方法更好地模擬了污染菌與樣品的混合，更加符合藥典的要求。

4.4 含中和劑的培養(yǎng)基/稀釋液的應(yīng)用 方法一中所用稀釋液為含1%(mL/mL)聚山梨酯80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，《中國藥典》中規(guī)定的稀釋液和中和劑。聚山梨酯80對抑菌成分具有一定的中和作用，該稀釋液需要試驗人員自己配制、滅菌；方法二中所用MLEB培養(yǎng)基有預(yù)售干粉培養(yǎng)基，未在《中國藥典》中載錄。該培養(yǎng)基含有卵磷脂0.7 g·mL-1，經(jīng)驗證該沖洗液對試驗菌株無抑菌性，同時有效降低藥品的抑菌成分，使試驗操作簡化。使用MELB培養(yǎng)基可應(yīng)用于具有抑菌性的藥物。

5 結(jié)語

藥品的微生物檢驗和控制是藥品安全性保障的一項重要措施[8]，而供試品的處理是微生物檢驗的重要環(huán)節(jié)，是獲得較高準確性和良好檢驗結(jié)果的基礎(chǔ)[9]。《中國藥典》《美國藥典》等根據(jù)供試品的理化特性與劑型特點，將供試品分為水溶性供試品、水不溶性非油脂類供試品、油脂類供試品和需用特殊方法制備的供試品等類型，并給出了相應(yīng)的處理方法。然而，微生物的檢驗結(jié)果經(jīng)常會受到藥物種類、劑型、檢驗技術(shù)等多種因素的影響[10]，尤其是在建立抑菌型強且為油脂類藥品的微生物限度檢查計數(shù)方法時，常因其復(fù)雜的基質(zhì)和強抑菌作用而導(dǎo)致試驗菌的回收失敗，在嚴格執(zhí)行藥典要求的基礎(chǔ)上，采用常規(guī)培養(yǎng)基、稀釋液均不能取得較好的回收結(jié)果時，可根據(jù)藥品特性，針對性地建立更方便適宜的個性化檢查方法是藥品微生物控制鼓勵的發(fā)展方向[11]。