棒狀β-FeOOH納米酶的制備及其類酶催化機(jī)理研究

楊 冬， 雷 蕾， 王麗霞， 高可奕， 賈彤彤， 王 雪， 薛朝華

(1.陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院 中國輕工業(yè)輕化工助劑重點(diǎn)實驗室, 陜西 西安 710021； 2.深圳君和生物科技有限公司, 廣東 深圳 518101； 3.陜西科技大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院, 陜西 西安 710021)

0 引言

天然過氧化物酶(HRP)作為一種精細(xì)的生物催化劑，以H2O2為電子受體催化底物發(fā)生氧化反應(yīng)，可使生物體內(nèi)的生化反應(yīng)速率提高1019倍[1].由于其較高的催化活性和底物特異性[2]，HRP在工業(yè)、醫(yī)療、生物等領(lǐng)域有著廣泛的前景.盡管如此，在實際操作中HRP仍存在著一些固有的缺陷，如制備和純化成本高、運(yùn)輸和儲存大、穩(wěn)定性差、催化活性對環(huán)境條件的敏感性等極大地限制了其在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用[3,4].為了克服上述弊端，研究人員付出巨大努力開發(fā)了具有酶催化活性的納米粒子來模擬天然酶的功能.與天然酶相比，納米酶具有成本低、貯存時間長、穩(wěn)定性高、在惡劣環(huán)境下的穩(wěn)定性好、產(chǎn)量大等優(yōu)點(diǎn).研究發(fā)現(xiàn)Ag、Au、Pt等貴金屬以及鐵基金屬材料具有優(yōu)越的類過氧化物酶催化活性，可催化H2O2與有機(jī)底物(以TMB為例)的氧化反應(yīng)，使體系由無色變?yōu)樗{(lán)綠色，催化反應(yīng)如下：

納米酶可以通過優(yōu)化合成途徑來改善其尺寸和形態(tài)[5,6]，研究發(fā)現(xiàn)，納米酶尺寸越小，催化活性越高，這是因為尺寸較小的納米粒子的比表面積相對較大，可以更加充分地與底物接觸，提高催化活性[3].除了尺寸外，粒子的表面結(jié)構(gòu)也會影響其催化活性.Liu等[7]報導(dǎo)了三種不同形貌(團(tuán)簇微球、八面體、三角形)的Fe3O4的過氧化物酶催化活性，研究發(fā)現(xiàn)其催化活性：團(tuán)簇微球 > 三角板 > 八面體，這一現(xiàn)象與材料暴露的Fe位點(diǎn)有關(guān)，比表面積較大的粒子可以暴露更多的活性位點(diǎn)，增加與底物的有效接觸面積，提高納米酶的催化活性.

β-FeOOH是一種天然礦物，廣泛存在于土壤水體和沉積物中，因其特殊的隧道結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定的理化性質(zhì)、巨大的比表面積和豐富的羥基基團(tuán)而受到廣泛關(guān)注.目前已報導(dǎo)的β-FeOOH棒的制備方法包括水熱法、熱分解法、沉淀法、亞鐵氧化法、微乳液法、微波水解法等，這些方法往往需要昂貴的儀器，反應(yīng)條件復(fù)雜，生產(chǎn)周期較長，生產(chǎn)效率低.此外，上述方法制備的粒子多為微米級，形貌調(diào)控難度大，影響因素多，不利于大規(guī)模生產(chǎn).Taeghwan等報導(dǎo)了一種Wrap-bake-peel法制備形貌可控的納米級β-FeOOH棒[8]，但所得的β-FeOOH納米棒分散性較差，后續(xù)應(yīng)用時需表面改性改善材料分散穩(wěn)定性.

研究者發(fā)現(xiàn)β-FeOOH具有類過氧化氫酶活性，可促進(jìn)H2O2的分解產(chǎn)生·OH[9].在隨后的研究中，Zhang等制備了一種Au/FeOOH-APC復(fù)合材料，利用Au和FeOOH棒的協(xié)同作用促進(jìn)體系中H2O2分解為H2O和·OH[10].但上述研究都沒有系統(tǒng)的對FeOOH的類過氧化物酶活性以及催化機(jī)理進(jìn)行討論.

為了進(jìn)一步探討β-FeOOH的酶催化活性及機(jī)理問題，本課題采用了一種簡單地低溫水解沉淀法制備了一種具有類過氧化物酶活性的β-FeOOH納米棒.通過分光光度計法測定·OH的產(chǎn)生情況，對類酶催化的機(jī)理進(jìn)行討論，通過以TMB作為顯色底物評價了β-FeOOH納米棒的酶催化效果，并與天然HRP進(jìn)行了對比，為納米酶代替天然HRP的實際應(yīng)用提供了新思路.

1 實驗部分

1.1 實驗試劑及儀器

1.1.1 主要試劑

六水合氯化鐵(FeCl3·6H2O)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚乙烯亞胺(PEI，Mw～750000)，上海泰坦科技股份有限公司；無水乙醇，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；3,3′，5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，Sigma-Aldrich；乙酸(CH3COOH)，AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙酸鈉(CH3COONa)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；30%雙氧水(H2O2)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；水楊酸(C7H6O3)，上海泰坦科技股份有限公司.以上試劑均為分析純，無需進(jìn)一步純化即可使用.

1.1.2 主要儀器

場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)，日本HITACHI公司；透射電子顯微鏡(TEM)，美國FEI公司；傅里變換紅外光譜分析儀(FT-IR)，德國布魯克Bruker公司；X-射線粉末衍射儀(XRD)，德國布魯克Bruker公司；X光電子能譜(XPS)，美國 Thermo Scientific 公司；紫外可見分光光度計(UV-Vis)，美國安捷倫 Agilent 公司.

1.2 β-FeOOH納米棒的制備

采用先前的報導(dǎo)的方法[11]并做了改進(jìn)，制備了β-FeOOH納米棒，方法如下：取500μL的PEI將其分散于100 mL去離子水中，置于磁力攪拌器上待其分散均勻后，加入5.4 g FeCl3·6H2O(20mmol)磁力攪拌30 min.將上述溶液轉(zhuǎn)入三口燒瓶，油浴升高溫度至80 ℃，反應(yīng)2 h，在此過程中，溶液由橙紅色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色懸濁液.反應(yīng)結(jié)束后，將所得溶液冷卻至室溫，隨后在6 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心30 min，去除上清液，用無水乙醇和去離子水交替清洗3次去除多余的PEI，將產(chǎn)物分散在去離子水中，得到穩(wěn)定分散的黃色溶液.

1.3 β-FeOOH納米棒的酶催化

取4支5 mL離心管，分別編號1～4，設(shè)置1號為空白對照組，研究加入試劑對TMB顯色的催化作用.試劑投入量如表1所示，其中，TMB濃度為25 mM，H2O2為50 mM，β-FeOOH納米棒濃度為10 mg/mL，加樣完成后用pH=4的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液定容至3 mL，快速混勻，室溫反應(yīng)5 min后用紫外可見分光光度計測定200～800 nm吸光度.

表1 β-FeOOH納米棒催化性能

1.4 β-FeOOH納米棒的酶催化性能評價

為評價β-FeOOH納米棒的類酶催化性能，實驗設(shè)計用米氏方程(Michaelis-Menten equation)[12]來表示β-FeOOH納米棒的酶促動力學(xué)，并采用雙倒數(shù)作圖，得到Linrweaver-Burk曲線對計算米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vm.

實驗分別對底物TMB和H2O2的濃度進(jìn)行了單因素控制，研究了β-FeOOH納米棒對兩種底物的親和能力和反應(yīng)速率.其中，TMB濃度為25 mM，H2O2濃度為50 mM，β-FeOOH納米棒濃度為10 mg/mL.

TMB動力學(xué)測定：取10支離心管分別編號1～10，加入30μL的β-FeOOH納米棒和108μL的H2O2溶液，隨后依次加入24μL、48μL、72μL、96μL、120μL、144μL、168μL、192μL、216μL、240μL的TMB溶液，加入乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH=4)，定容至3 mL，體系TMB濃度為0.2～2 mM，混勻后UV-Vis掃描(波長為652 nm，時間間隔1 s，掃描300 s).

H2O2動力學(xué)測定：取10支離心管分別編號1～10，加入30μLβ-FeOOH納米棒和240μL的 TMB水溶液(25 mM)，隨后依次加入12μL、24μL、36μL、48μL、60μL、72μL、84μL、96μL、108μL、120μL的H2O2溶液，加入乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH=4)，定容至3 mL，體系H2O2濃度為0.2～2 mM，混勻后UV-Vis掃描(波長為652 nm，時間間隔1 s，掃描300 s).

1.5 催化機(jī)理

分別取5支5 mL離心管編號1～5，設(shè)置1號為空白對照組，通過UV-Vis在510 nm處的顯色研究水楊酸捕獲·OH，并反應(yīng)生成二羥基苯甲酸情況.實驗設(shè)計如表2所示，其中水楊酸濃度為0.2 M，H2O2為3%，β-FeOOH納米棒濃度為10 mg/mL.加樣完成后用H2O調(diào)整體系體積為4 mL，混合均勻，室溫反應(yīng)5 min后用紫外可見分光光度計測定510 nm處的吸光度.

表2 ·OH含量測定

2 結(jié)果與討論

2.1 形貌分析

納米酶與底物的有效接觸面積是影響反應(yīng)速率的重要因素.實驗首先通過SEM和TEM對粒子的形貌進(jìn)行表征.如圖1(a)所示，粒子表面光滑平整呈現(xiàn)出明確的棒狀結(jié)構(gòu)，尺寸為62*21 nm(Nanomeasure統(tǒng)計).納米級棒狀結(jié)構(gòu)可以提供更大的表面積，暴露更多地活性位點(diǎn)，增加了在酶催化反應(yīng)中與底物接觸的機(jī)率.

從TEM圖可以看出納米粒子在水溶液中的分散性，如圖1(b)所示，納米棒呈現(xiàn)出良好的分散性.此外，水溶液中保存，用激光粒度分析儀測1、3、5、7、15天的平均粒徑，15天內(nèi)納米粒子水溶液保持澄清透明狀態(tài)，經(jīng)DLS測得粒徑分布在61～63 nm范圍內(nèi)(圖1(c))，說明納米粒子在水溶液中具有良好的分散性和穩(wěn)定性.這是因為PEI附著在納米棒的表面，PEI帶有大量氨基基團(tuán)對納米粒子起到保護(hù)作用，提高了分散性，保證了粒子在水溶液中的穩(wěn)定性.這種穩(wěn)定性和分散性可以保證納米酶在反應(yīng)過程中與底物充分接觸，有效提高酶催化的效率.

(a)電子掃描照片(SEM)

(b)透射電子顯微鏡(TEM)

(c)15天內(nèi)平均粒徑的變化(DLS)圖1 β-FeOOH納米棒的形貌表征結(jié)果

2.2 β-FeOOH納米棒成份表征

為了更進(jìn)一步討論β-FeOOH納米棒的化學(xué)組成，實驗采用了XRD、FT-IR、XPS進(jìn)行了表征，如圖2(a)～(d)所示.首先確認(rèn)了實驗產(chǎn)物的物相組成，圖2(a)為β-FeOOH納米棒的XRD衍射圖，由圖可知，在2θ=12 °(110)、26.9 °(310)、35.4 °(211)、39.4 °(301)、56.2 °(521)顯示出尖銳的衍射峰，這與典型的β-FeOOH標(biāo)準(zhǔn)卡片(JCPDS No 34.1266)出峰位置一致，衍射峰無其他雜峰且強(qiáng)度較強(qiáng)，這表明產(chǎn)物為結(jié)晶性能良好的β-FeOOH.

為了研究β-FeOOH納米棒的表面官能團(tuán)，實驗對β-FeOOH納米棒進(jìn)行了FT-IR表征，如圖2(b)所示，856 cm-1、695 cm-1對應(yīng)于文獻(xiàn)報道的β-FeOOH納米棒的Fe-O伸縮振動峰[13]，3 320 cm-1為β-FeOOH納米棒的O-H吸收峰.3 480 cm-1為PEI的N-H伸縮振動峰，1 680 cm-1、1 531 cm-1為PEI所帶的伯氨及仲胺的N-H彎曲振動峰，1 073 cm-1、1 363 cm-1為PEI中的伯氨及仲胺的C-N伸縮振動峰，這是因為在合成中引入了PEI作為一種軟模板，引導(dǎo)β-FeOOH棒狀形貌的生成[14].

此外，實驗還通過XPS討論了β-FeOOH納米棒的元素組成，如圖2(c)、(d)所示.圖2(c)為XPS全譜圖，可以看出β-FeOOH納米棒中含有Fe、O、C、N元素，其中N元素是因為PEI包裹在了β-FeOOH納米棒的表面.在Fe2P的譜圖可以看出在724.2 eV和710.7 eV處有明顯的峰，分別對應(yīng)于β-FeOOH納米棒中Fe2P1/2、Fe2P3/2軌道結(jié)合能的特征峰，這與早前報道一致[15].

綜上所述，實驗通過以PEI作為軟模板成功制備了結(jié)晶性能良好的較高純度的β-FeOOH納米棒，β-FeOOH納米棒表面具有大量的羧基和氨基基團(tuán)，有效提高了粒子的分散性和穩(wěn)定性.這為β-FeOOH納米棒作為納米酶參與催化反應(yīng)提供了有利條件.

(a)粉末X射線衍射圖譜(XRD)

(b)傅立葉紅外光譜譜圖(FT-IR)

(c)X光電子能譜全譜圖(XPS)

(d)XPS譜圖中Fe的光譜圖圖2 β-FeOOH納米棒的表征結(jié)果

2.3 類酶催化活性

在催化劑作用及底物作用下，TMB被氧化會呈現(xiàn)出藍(lán)綠色，生成ox-TMB，因而通過觀察顏色 變化，以及UV-Vis掃描圖譜，可以確定反應(yīng)的發(fā)生.圖3為不同體系中TMB催化氧化顯色的UV-Vis譜圖，插圖為顯色后目視的顏色變化.如圖所示，當(dāng)體系中僅存在TMB(圖3中a曲線)和TMB+β-FeOOH(圖3中b曲線)時，體系中無藍(lán)綠色ox-TMB產(chǎn)生，從UV-Vis圖也可以看出，在652 nm處無特征吸收峰，這表明TMB沒有發(fā)生氧化反應(yīng).

當(dāng)體系中存在H2O2時(圖3中c曲線),在652 nm處有明顯的ox-TMB特征吸收峰，溶液的顏色也顯示出淺藍(lán)綠色，這證明，體系中存在H2O2時可與TMB反應(yīng)，使TMB氧化為ox-TMB.

當(dāng)體系中加入β-FeOOH納米棒(圖3中d曲線)時，在相同時間內(nèi)顯示出深藍(lán)綠色，在UV-Vis譜圖的652 nm處顯示出強(qiáng)烈的吸收峰，這表明體系中有較多的ox-TMB產(chǎn)生，β-FeOOH納米棒的加入加快了TMB的催化氧化，在相同時間內(nèi)反應(yīng)速率更快，起到了催化反應(yīng)進(jìn)程的作用，具有類似天然過氧化物酶的催化效果.

圖3 TMB在不同體系中氧化顯色 的UV-Vis譜圖

2.4 類酶催化活性評價

基于上述研究結(jié)果，實驗對β-FeOOH納米棒的催化活性進(jìn)行了評價.

保持其他條件不變，改變底物TMB或者H2O2的濃度，測定TMB氧化產(chǎn)物(ox-TMB)在652 nm處的吸光度的變化，并通過公式(1)將ox-TMB的吸光度值與ox-TMB的濃度C相對應(yīng)，做出C隨時間t變化的曲線，由曲線斜率得到不同ox-TMB的濃度C下相應(yīng)的氧化反應(yīng)的初始速率V：

(1)

式(1)中：C—不同時刻ox-TMB的濃度；A—652 nm處的吸光度值；εox-TMB—ox-TMB摩爾吸光系數(shù)(39 000 M-1·cm-1)；L—光在樣本中經(jīng)過的距離(通常為比色皿的厚度)，單位cm.

隨后用初始速率V和初始體系中底物濃度[S]擬合得到米氏(Michealis-Menten)曲線(2)：

(2)

取雙倒數(shù)作圖，得到Linrweaver-Burk曲線(3)：

(3)

式(2)、(3)中：[S]—底物濃度(mM)；V—不同[S]時的反應(yīng)速度(10-8M·S-1)；Vm—最大反應(yīng)速率(10-8M·S-1)；Km—米氏常數(shù).

如圖4(a)、(b)所示，以β-FeOOH納米棒為類酶催化劑，對兩種底物催化所得的米氏曲線.在底物濃度較低時，隨底物濃度增加，反應(yīng)速率呈線性關(guān)系增長，當(dāng)TMB濃度超過0.8 mM，H2O2濃度濃度超過1.6 mM時反應(yīng)速率的增速逐漸變緩，這與典型米氏方程的變化特性一致.

將米氏方程進(jìn)行雙倒數(shù)作圖并模擬線性關(guān)系，即可得到Linrweaver-Burk直線(圖4(c)、(d))，其中Linrweaver-Burk直線圖的縱坐標(biāo)截距為1/Vm，斜率為Km/Vm，通過計算即得到β-FeOOH納米棒的動力學(xué)參數(shù)Vm和Km值.

(a)米氏曲線：[V]～[ H2O2]

(b)米氏曲線：[V]～[TMB]

(c)Linrweaver-Burk曲線：[V]-1～[H2O2]-1

(d)Linrweaver-Burk曲線：[V]-1～[TMB]-1圖4 β-FeOOH酶催化動力學(xué)曲線

Km體現(xiàn)了納米酶與底物的親和力大小，Km值越小，親和力越強(qiáng).如表3所示，β-FeOOH納米棒與天然過氧化物酶HRP對兩種底物的親和(Km)相當(dāng)，對底物H2O2而言，Vm(β-FeOOH)>Vm(HRP)，這表明β-FeOOH納米棒與HRP對底物有相似的親和能力，在相同時間內(nèi)β-FeOOH納米棒與底物的反應(yīng)速率更快，大大縮短了反應(yīng)進(jìn)程，使TMB更快被氧化顯色，與HRP相比有更高的酶催化活性.

表3 β-FeOOH納米棒的動力學(xué)參數(shù)

2.5 類酶催化機(jī)理

上述研究發(fā)現(xiàn),β-FeOOH納米棒具有類似HRP的功能，可以催化H2O2氧化TMB發(fā)生顯色反應(yīng).為了進(jìn)一步探明β-FeOOH納米棒催化反應(yīng)的機(jī)理，本文采用分光光度法測定反應(yīng)過程中的·OH[17].以水楊酸作為·OH的捕獲劑，生成二羥基苯甲酸，通過UV-Vis掃描，若在510 nm處可以產(chǎn)生吸收峰，則可證明β-FeOOH納米棒對H2O2與TMB氧化反應(yīng)的催化作用，是緣自于β-FeOOH納米棒催化H2O2分解產(chǎn)生具有強(qiáng)氧化性的·OH，從而完成對TMB的氧化過程[18].

圖5為反應(yīng)5 min時水楊酸捕獲·OH后，掃描510 nm處的紫外吸收譜圖.由圖5可見，當(dāng)體系中存在水楊酸(a曲線)、水楊酸+ H2O2(b曲線)、水楊酸+1 mgβ-FeOOH(c曲線)時在510 nm處無吸收峰，即沒有檢測到二羥基苯甲酸生成這表明在，僅有H2O2或β-FeOOH存在時，體系中，沒有·OH產(chǎn)生.當(dāng)體系中存在H2O2和β-FeOOH時(d、e曲線)，紫外吸收譜圖在510 nm附近顯示出二羥基苯甲酸的特征峰，這是因為水楊酸被體系中的·OH氧化產(chǎn)生了二羥基苯甲酸，這證明加入β-FeOOH納米棒后可以促進(jìn)H2O2的分解，使體系中產(chǎn)生·OH.當(dāng)β-FeOOH投入量從1 mg增加到1.5 mg時，產(chǎn)生的·OH相應(yīng)增多，體系中二羥基苯甲酸含量增加，在510 nm處的吸收峰也隨之增強(qiáng).由此可以看出，β-FeOOH納米棒的加入可以促使H2O2分解生成H2O和·OH，水楊酸迅速捕獲·OH并生成二羥基苯甲酸，在510 nm處顯示出特征吸收峰.隨β-FeOOH納米棒投入量的增加，體系中·OH的含量也隨之增加.

圖5 水楊酸捕獲·OH在510 nm處顯色 的UV-Vis譜圖

TMB與H2O2氧化顯色反應(yīng)，實質(zhì)上依賴于H2O2產(chǎn)生的·OH來氧化TMB，生成ox-TMB顯色.這個過程在室溫條件下是非常緩慢的，常常需要加入酶來促進(jìn)·OH產(chǎn)生，從而加快反應(yīng)速率.β-FeOOH納米棒催化的反應(yīng)過程如圖6所示.在酸性條件下，β-FeOOH納米棒與體系中的H2O2接觸，在極短時間內(nèi)催化H2O2分解產(chǎn)生H2O 和·OH，具有強(qiáng)氧化性的·OH迅速與無色的TMB發(fā)反應(yīng)，將無色溶液氧化為藍(lán)綠色的ox-TMB溶液.通過這種催化作用可以達(dá)到類過氧化物酶的催化效果，實現(xiàn)了加快反應(yīng)速率，縮短TMB氧化顯色時間的目的.

圖6 β-FeOOH納米棒的酶催化 機(jī)理示意圖

3 結(jié)論

本文以FeCl3和聚乙烯亞胺為原料，以簡單的低溫?zé)岢恋矸ㄖ苽淞司哂蓄愡^氧化物酶活性的β-FeOOH納米棒.同時，對β-FeOOH納米棒的酶活性和催化原理和進(jìn)行了研究.通過以TMB作為顯色標(biāo)志物評價β-FeOOH納米棒的類酶催化效果發(fā)現(xiàn)，β-FeOOH納米棒對TMB和H2O2的Km值與HRP類似為0.41，但最大反應(yīng)速率Vm更高，為HRP的2.6倍，這表明在相同條件下，β-FeOOH納米棒催化的反應(yīng)更快，更早到達(dá)反應(yīng)終點(diǎn).對β-FeOOH納米棒的酶催化機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)，β-FeOOH納米棒是通過催化H2O2分解產(chǎn)生具有強(qiáng)氧化性的·OH，迅速氧化TMB發(fā)生顯色，加快反應(yīng)進(jìn)程，從而達(dá)到類過氧化物酶的催化效果.

β-FeOOH納米棒是具有類過氧化物酶特性的納米粒子，其良好的分散性和穩(wěn)定性可以確保在催化過程中與底物的充分接觸，保證了催化反應(yīng)的效率.與HRP相比，β-FeOOH納米棒與底物親和力相似，反應(yīng)速率更高，具有更高的催化活性，且制備簡單，成本更低，為納米酶取代天然酶在工業(yè)、醫(yī)療、生物等領(lǐng)域的實際應(yīng)用提供了新思路.