4種淫羊藿黃酮苷類主要成分體外藥理活性比較

史闊豪, 張光財, 武康雄, 王 彬, 萬閩歌, 李 菡*

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.陜西商貿(mào)學(xué)院 醫(yī)藥學(xué)院， 陜西 西安 712046)

0 引言

淫羊藿(EpimediiFolium)，別名仙靈脾，首次記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有補腎陽、強筋骨、祛風(fēng)濕的功效[1].黃酮類是其主要活性成分，其中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C與淫羊藿苷結(jié)構(gòu)相似，是淫羊藿標(biāo)志性化合物，占淫羊藿黃酮類成分的40%～50%，2020年版《中國藥典》中將淫羊藿苷作為淫羊藿的質(zhì)控成分[2,3].淫羊藿屬植物中分離得到的活性黃酮大都為C8位具有異戊烯基取代的黃酮醇苷類化合物，淫羊藿苷的結(jié)構(gòu)為在此基礎(chǔ)上C4′發(fā)生羥基甲基，C7位被葡萄糖取代，C3位為鼠李糖基取代.朝藿定類化合物是淫羊藿黃酮類化合物如淫羊藿苷等經(jīng)過進一步結(jié)構(gòu)修飾的結(jié)果，朝藿定A為在淫羊藿苷C3位鼠李糖基上再連接1個葡萄糖，朝藿定B為連接1個木糖，朝藿定C為連接1個鼠李糖形成二糖取代.4種成分結(jié)構(gòu)式如圖1所示.

淫羊藿黃酮在抗腫瘤、增強免疫功能、改善心腦血管功能、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、抗骨質(zhì)疏松、抗炎、增強學(xué)習(xí)記憶能力和改善生殖功能等方面具有顯著的藥理活性[3-6].淫羊藿苷已被證明具有骨保護、調(diào)節(jié)生殖功能、神經(jīng)保護、免疫保護和抗氧化等作用[7-10].朝藿定C對肉瘤sarcoma-180 細胞以及肝癌SK-Hep-1細胞均表現(xiàn)出抗腫瘤活性[11,12]，提示人們朝藿定類化合物具有可觀的藥用價值.但目前針對朝藿定類化合物生物活性研究還是較少，繼續(xù)挖掘該類化合物的生物活性對淫羊藿黃酮類化合物的開發(fā)利用具有重要意義.因此本研究通過比較朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C與淫羊藿苷的抗菌、抗氧化和抗腫瘤活性,以期為淫羊藿以及朝藿定的功能性產(chǎn)品開發(fā)和綜合應(yīng)用研究提供技術(shù)支持和理論參考.

R1=Rha,R2=Glc,R3=CH3 淫羊藿苷 R1=Rha-Glc,R2=Glc,R3=CH3 朝霍定A R1=Rha-Xy1,R2=Glc,R3=CH3 朝霍定B R1=Rha-Rha,R2=Glc,R3=CH3 朝霍定C圖1 四種淫羊藿黃酮苷化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料及菌種

朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷，購自寶雞辰光生物科技有限公司.

供試菌種：大腸桿菌ATCC-25922和金黃色葡萄球菌EATT-25236，實驗室保存.

人肝癌細胞株BEL-7402購自中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所，本實驗室保存.

1.1.2 主要試劑

LB肉湯(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司);瓊脂(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司);生理鹽水(中牧股份江西生物藥廠);無水乙醇(天津市天力化學(xué)試劑有限公司); DPPT、ABTS、K2S2O8(笛醫(yī)生物科技有限公司)；維生素 C(天津市天力化學(xué)試劑有限公司)；青霉素、鏈霉素(上海源葉生物科技有限公司)；RPMI 1640 培養(yǎng)基( 以色列Biological Industries公司) 、胰蛋白酶(以色列Biological Industries公司) 、WST-1 試劑盒( 博士德(Boster)生物公司); DCFH-DA 熒光探針 (上海碧云天生物技術(shù)有限公司) ;其余試劑均為分析純.

1.1.3 主要儀器

全波長掃描式多功能讀數(shù)儀(賽默飛世爾科技有限公司)；調(diào)速型迷你離心機(上海生工有限公司)；超凈工作臺(蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司);電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);微量移液器(德國Eppendorf);冰箱(青島海爾股份有限公司);漩渦振蕩儀器(常州諾基儀器有限公司);恒溫培養(yǎng)箱(上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司);恒溫振蕩培養(yǎng)箱(哈爾濱東聯(lián)電子公司);流式細胞儀(美國BD有限公司).

1.2 實驗方法

1.2.1 抑菌圈的測定

取一張濾紙,用6 mm打孔器將其制備成圓形濾紙片.濾紙片經(jīng)高壓滅菌后烘干，完全干燥后取出貼于加入菌液培養(yǎng)基的平板上，用移液器吸取6μL的藥液滴到濾紙上.兩組都用液體培養(yǎng)基做空白對照,朝藿定類A、B、C和淫羊藿苷的用藥濃度均為10 mg/mL,其中金黃色葡萄球菌組用濃度為10μg/mL的青霉素作陽性對照，大腸桿菌組用濃度為20μg/mL鏈霉素作陽性對照，做三組平行.置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,觀察各組的抑菌效果.使用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的直徑,以評價其抑菌的效果.參照抑菌活性判定使用標(biāo)準(zhǔn)，抑菌圈直徑d≤6 mm，藥物敏感度判定為不敏感；6 mm20 mm，藥物敏感度判定為極高敏.

1.2.2 最小抑菌濃度(MIC)的測定

采用雙倍稀釋法測定朝藿定類化合物和淫羊藿苷對大腸桿菌的MIC值.用微量加樣器分別取各個濃度的藥液50μL，依次由低濃度到高濃度加到96孔板中并做好標(biāo)記.再取50μL的各個菌液加入到96孔板中.同時每個實驗菌組設(shè)陰性對照組和空白對照組.空白對照孔內(nèi)加50μL液體培養(yǎng)基和50μL菌液，陰性對照孔內(nèi)加50μL鏈霉素和50μL菌液.將96孔板振蕩1 min，使孔內(nèi)菌液與藥液混勻后用封口膠密封好，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱.24 h后，觀察菌液的渾濁情況，相鄰濃度有明顯差距，較澄清的實驗組的藥物濃度為最低抑菌濃度(MIC).

1.2.3 DPPH自由基清除試驗

精密稱取12.50 mg DPPH,在250 mL棕色容量瓶中溶解,以無水乙醇為溶劑,得到濃度為0.05 mg/mL的DPPH溶液,避光保存,備用.在試管中加入2 mL不同濃度 (1.562 5μg/mL、3.125μg/mL、 12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)的朝藿定A、B、C和淫羊藿苷溶液,再加入已經(jīng)配制好的0.05 mg/mL DPPH溶液2 mL,空白管以無水乙醇代替藥液，對照管用無水乙醇代替DPPH溶液.水浴避光30 min,在517 nm波長處測定各溶液的吸光度.每個樣品重復(fù)測定三次，抗壞血酸為陽性對照.

1.2.4 ABTS自由基清除試驗

ABTS水溶液(7 mmol/L)和過硫酸鉀水溶液(7.35 mmol/L)等比例混合，室溫黑暗條件下反應(yīng)12～16 h，以無水乙醇稀釋調(diào)整至在波長734 nm處吸光度為0.70±0.02，制備得到ABTS+溶液.取2 mL不同濃度 (1.562 5μg/mL、3.125μg/mL、 12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL) 的朝藿定A、B、C和淫羊藿苷溶液，加入5 mL ABTS+溶液，以水代替樣品作為空白組，室溫反應(yīng)6 min，于波長734 nm處測定吸光度，并計算自由基清除率I%.平行測定三次，抗壞血酸為陽性對照.

1.2.5 CCK-8法測定抗腫瘤活性

取傳代培養(yǎng)生長情況良好的BEL-7402細胞進行實驗,96孔板加入200μL含不同濃度藥物(終濃度10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L)的培養(yǎng)液，并設(shè)置空白對照組，每組設(shè)置3個復(fù)孔，分別培養(yǎng)24 h后加入20μL CCK-8溶液培養(yǎng)箱中孵育,酶標(biāo)儀讀取波長450 nm下的OD值,將各測試孔OD值減去空白OD值,細胞存活率%=(加藥孔OD-空白OD)/(對照孔OD-空白OD)×100%.

1.2.6 流式細胞儀檢測朝霍定C對細胞內(nèi)活性氧水平的影響

取對數(shù)期生長的BEL-7402細胞，以5×106個細胞/孔接種在6孔板，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.每孔加入朝霍定C(10μmol/L，20μmol/L和40μmol/L) 后培養(yǎng).用PBS洗滌，加入DCFH-DA 熒光探針后孵育30 min，吸掉探針染色液，PBS洗滌，胰酶消化再收集細胞.離心，棄上清用PBS重懸細胞，再離心，最后用流式細胞儀收集檢測活性氧(reactive oxygen species，ROS) 水平.

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，數(shù)據(jù)圖中用誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)差.組間差異采用單因素方差分析，*P<0.05表示具有顯著性差異，**P<0.01表示差異極顯著.

2 結(jié)果與討論

2.1 抑菌圈實驗的結(jié)果分析

從表1的實驗結(jié)果來看，對于大腸桿菌的抑菌作用，朝藿定A和淫羊藿苷的抑菌圈的直徑大于10 mm而小于15 mm均屬于中敏；朝藿定B和朝藿定C的抑菌圈的直徑大于6 mm而小于10 mm，均屬于低敏；表明對于大腸桿菌，四種淫羊藿苷均具有一定的抑菌活性，其中朝藿定A和淫羊藿苷的抑菌活性較強，兩者作用相當(dāng)，而朝藿定B和朝藿定C的抑菌作用較弱.對于金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑，朝藿定A和淫羊藿苷的抑菌圈的直徑大于10 mm而小于15 mm均屬于中敏；朝藿定B和朝藿定C均無抑菌活性.總的來說，對于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，朝霍定A和淫羊藿苷均表現(xiàn)出較強的抑菌活性，具有開發(fā)成抑菌藥的潛力.

表1 朝藿定A、B、C和淫羊藿苷對大腸桿菌和金

2.2 最低抑菌濃度(MIC)的測定

朝藿定A和淫羊藿苷對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有較強的的抑菌活性，進一步采用雙倍稀釋法檢測了最小抑菌濃度(MIC)，如表2所示.結(jié)果表明：對于金黃色葡萄球菌，朝霍定A和淫羊藿苷的MIC分別為25和15 mg/mL；對大腸桿菌，朝霍定A和淫羊藿苷的MIC分別為12.5 mg/mL和15 mg/mL.結(jié)合抑菌圈測定結(jié)果，可以看出朝藿定A和淫羊藿苷對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有較好的的生長抑制效果，具有后續(xù)抑菌作用研究的潛能.

表2 朝藿定A和淫羊藿苷對大腸桿菌和

2.3 清除DPPH自由基能力的結(jié)果分析

由圖2所示的實驗結(jié)果可以看出，在1.562 5～100μg/mL的濃度范圍內(nèi)，朝藿定A、B、C和淫羊藿苷對DPPH的清除作用呈現(xiàn)一定的正相關(guān)趨勢，隨著樣品濃度的升高，其對DPPH自由基清除作用也隨之增強.用 Excel 軟件做統(tǒng)計,得到樣品的回歸方程并計算出 IC50和 AE，如表3所示.通過比較得出清除 DPPH自由基的清除能力：淫羊藿苷>朝霍定C>朝霍定A>朝霍定B,表明淫羊藿苷結(jié)構(gòu)C3位鼠李糖基上進行糖基取代會減弱其抗氧化性.

圖2 樣品對DPPH·自由基的清除率 隨濃度的變化

表3 樣品對DPPH自由基清除效果

2.4 清除ABTS自由基能力的結(jié)果分析

ABTS自由基清除能力也是常用的抗氧化活性檢測方法.從圖3可以看出，朝藿定A、B、C和淫羊藿苷均隨著濃度的增加抗氧化能力逐漸增強； 由表4可知，ABTS自由基清除能力：淫羊藿苷>朝霍定C>朝霍定A>朝霍定B,結(jié)果和DPPH自由基的清除率呈相關(guān)性.可以說明這兩種方法基本能夠一致地反映4種淫羊藿黃酮的抗氧化活性.

圖3 樣品對ABTS·自由基的清除率 隨濃度的變化

表4 樣品對ABTS·自由基清除效果

2.5 CCK8法檢測不同淫羊藿黃酮苷對BEL-7402細胞存活率的影響

實驗結(jié)果如圖4所示，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷均能夠抑制BEL-7402細胞的增殖.隨著藥物濃度的增加，細胞存活率呈現(xiàn)下降的趨勢.同時，相同濃度比較，朝藿定C和淫羊藿苷有更加明顯的抑制作用，且抑制作用呈濃度依賴性.

圖4 四種淫羊藿黃酮苷對肝癌細胞 BEL-7402生長抑制作用比較

2.6 朝霍定C對細胞內(nèi)ROS的含量影響

朝霍定C表現(xiàn)出明顯的抑制BEL-7402細胞增殖的作用，為進一步研究其作用機制，用不同濃度( 10μmol/L，20μmol/L，40μmol/L) 的朝霍定C處理BEL-7402 細胞后，檢測ROS水平，其試驗結(jié)果如圖5所示.由圖5可知，朝霍定C呈濃度依賴性地升高細胞中ROS水平( P<0.05或P<0.01)，表明朝霍定C可能是通過升高細胞內(nèi)ROS的含量誘導(dǎo)BEL-7402細胞死亡.

圖5 朝霍定C對肝癌細胞BEL-7402 ROS含量影響

3 結(jié)論

朝藿定類化合物(包括朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C)和淫羊藿苷是中國傳統(tǒng)中藥淫羊藿的重要活性成分，是淫羊藿活性黃酮的重要組成部分，具有多種藥理活性，同時也是喘可治注射液以及仙靈骨葆膠囊等成藥的主要成分，具有可觀的藥用價值[1-5,13,14].因此研究朝藿定類化合物的生物活性具有重要意義，也為其他淫羊藿活性黃酮類化合物的開發(fā)研究提供借鑒.

本研究比較分析了朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的抗氧化、抑菌與抗腫瘤活性.其中，在抑菌圈和微量稀釋法評價四個淫羊藿黃酮苷的抑菌實驗中，抑菌效果最佳的是朝霍定A和淫羊藿苷，對金黃色葡萄球菌的MIC ，朝霍定A為25 mg/mL，淫羊藿苷為15 mg/mL；對大腸桿菌的MIC，其朝霍定A為12.5 mg/ mL，淫羊藿苷為15 mg/mL.

實驗表明，朝霍定A和淫羊藿苷對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有較強的抑菌效果，而朝霍定B和朝霍定C的抑菌作用較弱.通過檢測ABTS自由基和DPPH自由基清除能力確定化合物的抗氧化活性，結(jié)果表明四種淫羊藿黃酮苷的抗氧化活性為：淫羊藿苷>朝霍定C>朝霍定A>朝霍定B,提示淫羊藿苷結(jié)構(gòu)C3位鼠李糖基上進行糖基取代會減弱其抗氧化性.在CCK8法測定四種活性成分對肝癌細胞BEL-7402的生長抑制作用中，四種化合物均體現(xiàn)出一定的增殖抑制作用，以朝霍定C和淫羊藿苷的增殖抑制作用最為突出，進一步研究朝霍定C的作用機制，表明朝霍定C可能是通過升高細胞內(nèi)ROS的含量誘導(dǎo)BEL-7402細胞死亡.

盡管通常認為黃酮類化合物是天然高效抗氧化劑，能抑制ROS的產(chǎn)生而防止氧化應(yīng)激損傷，起到細胞保護作用[15].但近年來，多項研究提示黃酮化合物對細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的影響可能與藥物濃度相關(guān)，不同藥物濃度作用甚至產(chǎn)生截然不同的影響，推測黃酮類化合物是發(fā)揮促氧化還是抗氧化作用可能與其在細胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物組分和細胞本身的氧化還原狀態(tài)相關(guān)[16-18].腫瘤細胞與正常細胞內(nèi)氧化還原水平不同，有研究報道某些黃酮類如兒茶素能通過氧化還原反應(yīng)使口腔癌細胞中ROS含量呈劑量依賴性升高，誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，而將正常細胞中活性氧調(diào)制正常水平[19]，表明不同研究體系中各黃酮化合物生物活性不一致甚至相互矛盾.

本研究中朝藿定C具有一定清除DPPH和ABTS自由基的作用，但當(dāng)作用濃度為10μmol/L，20μmol/L，40μmol/L，作用于腫瘤細胞BEL-7402時，又能升高ROS的含量起到抗腫瘤作用.本項目采用生物活性為導(dǎo)向篩選，為淫羊藿黃酮苷化合物藥用價值的利用提供依據(jù).本文僅從抗菌、抗氧化和抗腫瘤對淫羊藿黃酮苷化合物進行了初步比較，后續(xù)還應(yīng)從不同角度(作用機制、構(gòu)效關(guān)系等)深入探究其活性規(guī)律.