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      TTLL12過表達(dá)對(duì)口腔鱗癌SCC-25細(xì)胞株生物學(xué)特性的影響

      2021-04-19 10:18:38薛伶俐李雅冬
      重慶醫(yī)學(xué) 2021年6期
      關(guān)鍵詞:細(xì)胞質(zhì)微管小室

      曾 艷,薛伶俐,方 川,程 維,李雅冬

      (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院頜面外科 400016)

      口腔鱗癌是頭頸部腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一[1]。雖然目前臨床治療口腔鱗癌的方法較多,但由于其易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[2-3],在過去的幾十年中,存活率仍沒有得到明顯的提高,且發(fā)病率還在逐年升高[4]。伴隨著腫瘤發(fā)展并對(duì)鄰近組織的侵襲,會(huì)嚴(yán)重影響患者的言語、進(jìn)食、吞咽、呼吸等功能,從而大大降低患者的生存質(zhì)量[5]。因此,臨床迫切需要找到新的有效的治療方法。

      眾所周知,癌癥的生物學(xué)基礎(chǔ)是抑癌基因的失活或原癌基因的激活,從而導(dǎo)致細(xì)胞不受控制的增殖和異常的凋亡,因此,癌癥的發(fā)生和發(fā)展與原癌基因密切有關(guān)[6]。本課題組曾經(jīng)報(bào)道,在頭頸腫瘤中發(fā)現(xiàn)微管蛋白酪氨酸連接酶類似物12(tubulin tyrosine ligase like 12,TTLL12)可通過阻礙硝基化酪氨酸與微管蛋白的結(jié)合,而促進(jìn)頭頸鱗癌的生長(zhǎng),具有潛在原癌基因的作用[7]。但目前,對(duì)于TTLL12在細(xì)胞內(nèi)的分布尚不清楚,這為進(jìn)一步深入研究TTLL12的作用機(jī)制造成了不小的障礙,本文將主要闡述近期本課題組的研究成果,以期為口腔鱗癌的治療提供理論基礎(chǔ)。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      人舌磷癌SCC-25細(xì)胞株由重慶醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供,培養(yǎng)液成分:伊格爾培養(yǎng)基、10%小牛血清、1 mmol/L丙酮酸鈉、40 μg/mL慶大霉素(美國(guó)Sigma公司)。激光共聚焦掃描顯微鏡(德國(guó) Leica),CF15型低溫離心機(jī)(德國(guó)Heraeus公司)。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、Boyden 小室、siRNA及脂質(zhì)體LipofectamineTM2000(Sigma公司),內(nèi)參TATA結(jié)合蛋白(TATA-binding protein,TBP)抗體、TTLL12抗體、β微管蛋白(β-tubulin)抗體(美國(guó)Sigma公司),Na+/K+-ATPase α1抗體(美國(guó)Proteintech公司),YG-875型超凈工作臺(tái)、CO2孵箱(美國(guó)Bio-Rad公司)。

      1.2 方法

      1.2.1建立TTLL12過表達(dá)的SCC-25細(xì)胞株

      利用慢病毒將TTLL12 cDNAs轉(zhuǎn)染入SCC-25細(xì)胞,篩選穩(wěn)定高表達(dá)TTLL12的細(xì)胞株(過表達(dá)組),同時(shí)利用空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入SCC-25細(xì)胞,建立空白對(duì)照組。

      1.2.2Western blot

      收集細(xì)胞,PBS清洗2遍,加入細(xì)胞裂解液,收集裂解產(chǎn)物,煮沸變性,行蛋白電泳,轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜,5%的牛奶封閉1 h,依次加入一抗,4 ℃孵育過夜,加二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記鼠抗兔IgG抗體,1∶1 000稀釋),室溫下孵育2 h,TBST洗滌3次,每次10 min后,利用DAB顯色試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)并拍照。用美國(guó)BioRad公司Quantity One系統(tǒng)進(jìn)行灰度分析,以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶的灰度值比值為目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

      1.2.3間接免疫熒光法檢測(cè)

      待過表達(dá)組和空白對(duì)照組SCC-25細(xì)胞爬滿玻片后,棄去培養(yǎng)液,用100%乙醇固定細(xì)胞,然后依次與一抗和二抗孵育60 min。 取出玻璃片,用濾紙吸去多余水分,滴加一滴甘油緩沖液(甘油和pH7.4 PBS液以9∶1體積混合而成),再覆以蓋玻片。熒光顯微鏡高倍視野下觀察,判定結(jié)果。

      1.2.4TTLL12在SCC-25細(xì)胞內(nèi)的分布檢測(cè)

      取穩(wěn)定過表達(dá)TTLL12的SCC-25細(xì)胞株,PBS清洗兩遍,分別提取總細(xì)胞蛋白、細(xì)胞質(zhì)蛋白、細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞膜蛋白。加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,收集裂解后產(chǎn)物,得到總細(xì)胞蛋白。室溫下1 000 r/min離心5 min,棄去上清夜,輕彈管底,將離心管置于冰面,加入600 μL冷bufferA,振蕩15 s,置于冰面15 min,加25 μL 10% NP40,振蕩 5 s,置于冰面10 min,在4 ℃下10 000×g離心5 min,輕輕吸取上清液為細(xì)胞質(zhì)蛋白,PBS清洗2遍,在4 ℃下10 000×g離心5 min,將離心管置于冰面,加100 μL冷bufferC,反復(fù)振蕩,在冰面上靜置40 min,在4 ℃下13 000×g離心20 min,輕輕吸取上清液為細(xì)胞核蛋白,PBS清洗2遍,獲得細(xì)胞核膜蛋白。利用各組蛋白進(jìn)行Western檢測(cè)TTLL12的分布。

      1.2.5沉默TTLL12在SCC-25細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

      將1×105/mL濃度的SCC-25細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中,加伊格爾培養(yǎng)基,于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),待細(xì)胞長(zhǎng)至70%時(shí),進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染。參照LipofectamineTM2000試劑說明操作,干擾組siTTLL12序列:5′-GGU UGU UCG UGU AUG AUG U-3′,轉(zhuǎn)染空白對(duì)照序列的為對(duì)照組,轉(zhuǎn)染24 h后,收集細(xì)胞,利用Western blot檢測(cè)TTLL12的表達(dá)情況。

      1.2.6四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖

      將干擾組與對(duì)照組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,接種到96孔培養(yǎng)板內(nèi),使每孔細(xì)胞數(shù)為2 000個(gè),在37 ℃的CO2孵箱中孵育,每24小時(shí)檢測(cè)1次,共9 d,檢測(cè)前在每個(gè)孔內(nèi)加入MTT(5 mg/mL)10 μL,放入CO2孵箱中孵育4 h,去上清液,每孔加入二甲基亞砜與0.04 mol/L鹽酸的混合物150 μL,震蕩1 h后,再利用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處比色,每次檢測(cè)至少6個(gè)孔,最后取其平均值。

      1.2.7Boyden小室侵襲試驗(yàn)

      將Boyden小室放入每孔加有500 μL含10%胎牛血清的6孔培養(yǎng)板中,Boyden小室中加入500 μL不含胎牛血清的培養(yǎng)基,取濃度為4×105/mL的各組細(xì)胞懸液200 μL加入Boyden小室,37 ℃孵育4 h后,取出Boyden小室,濾膜下層向上,PBS洗滌,3%戊二醛固定,蘇木素染色,用棉花棒擦凈小室濾膜上層未侵襲的細(xì)胞。使用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照,計(jì)算出穿過濾膜的細(xì)胞百分比。

      1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

      2 結(jié) 果

      2.1 TTLL12在SCC-25細(xì)胞的表達(dá)分析

      經(jīng)Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示過表達(dá)組TTLL12相對(duì)表達(dá)水平較空白對(duì)照組明顯增強(qiáng),證明TTLL12穩(wěn)定高表達(dá)的SCC-25細(xì)胞株成功建立,見圖1。間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果顯示過表達(dá)組SCC-25細(xì)胞內(nèi)有亮紅色熒光,分布于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和細(xì)胞核膜,而空白對(duì)照組SCC-25細(xì)胞內(nèi)僅有較暗、較淺的紅色熒光,見圖2。間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果還顯示TTLL12與α-tubulin的分布重合,見圖3。

      圖1 Western blot檢測(cè)TTLL12在SCC-25細(xì)胞的表達(dá)

      2.2 TTLL12在細(xì)胞內(nèi)的分布

      Western blot結(jié)果顯示在細(xì)胞總蛋白中,TTLL12、β-tubulin、TBP和Na+/K+-ATPase α1均有條帶顯示;在細(xì)胞質(zhì)蛋白中,TTLL12和β-tubulin有條帶顯示;在細(xì)胞核蛋白中,TTLL12和TBP有條帶顯示;在細(xì)胞核膜蛋白中,TTLL12和Na+/K+-ATPase α1有條帶顯示,見圖4。

      A:空白對(duì)照組;B:過表達(dá)組。

      2.3 干擾TTLL12在SCC-25細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

      利用siRNA沉默TTLL12的表達(dá),經(jīng)Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示干擾組TTLL12蛋白較對(duì)照組降低,見圖5。

      A:細(xì)胞核;B:α-tubulin;C:TTLL12;D:重合。

      圖4 Western blot檢測(cè)TTLL12在SCC-25細(xì)胞中的分布

      圖5 干擾TTLL12在SCC-25細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

      2.4 干擾TTLL12對(duì)SCC-25細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

      MTT法檢測(cè)SCC-25細(xì)胞生長(zhǎng)的情況,結(jié)果表明,干擾組SCC-25細(xì)胞的生長(zhǎng)較對(duì)照組受到明顯抑制(P<0.05),見圖6。

      圖6 SCC-25生長(zhǎng)曲線

      2.5 干擾TTLL12對(duì)SCC-25細(xì)胞侵襲的影響

      Boyden小室侵襲試驗(yàn)結(jié)果表明,干擾組穿過濾膜的細(xì)胞百分比為(31±2)%,對(duì)照組穿過濾膜的細(xì)胞百分比是(56±5)%,干擾組SCC-25細(xì)胞穿過濾膜的細(xì)胞百分比較對(duì)照組明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖7。

      圖7 Boyden小室侵襲試驗(yàn)

      3 討 論

      口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)逐級(jí)進(jìn)行的復(fù)雜生物學(xué)過程,其中,原癌基因的過表達(dá)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色[8]。筆者曾經(jīng)報(bào)道在頭頸鱗癌中,TTLL12具有潛在原癌基因的作用[7]。近年,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)TTLL12在肺腺癌、結(jié)腸腺癌、直腸腺癌、前列腺癌和肺癌中表達(dá)明顯升高,并與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)(P<0.05)[9-12]。還有一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)TTLL12與人體免疫有關(guān),例如PENG等[13]發(fā)現(xiàn),和HIV陰性的健康人比較,TTLL12在HIV陽性患者中的表達(dá)升高,表明TTLL12可能與先天免疫調(diào)節(jié),免疫缺陷綜合征的疾病進(jìn)展和HIV-1復(fù)制相關(guān)。JU等[14]發(fā)現(xiàn)TTLL12可以抑制抗病毒的RIG-I通路活性,從而增強(qiáng)RNA病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制能力,LORENZ等[15]發(fā)現(xiàn)在發(fā)生急性閉角型青光眼后的0~12周,TTLL12在患者的血清中的表達(dá)呈線性增長(zhǎng)趨勢(shì)。

      根據(jù)目前的研究成果可知,TTLL12具有SET和TTL結(jié)構(gòu)域,而TTLL12的TTL結(jié)構(gòu)域缺少其他家族成員所保留的7個(gè)基序中的3個(gè)。TTLL12的TTL結(jié)構(gòu)域可能與TTLL12參與微管修飾功能有關(guān)[16-17]。有研究認(rèn)為在真核細(xì)胞的進(jìn)化過程中,TTLL12的SET結(jié)構(gòu)域可能對(duì)異染色質(zhì)和常染色質(zhì)的形成起到非常重要的作用[18]。另外,TTLL12高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致H4K20表達(dá)升高,很可能與TTLL12的SET結(jié)構(gòu)域有關(guān)[17,19]。但TTLL12在細(xì)胞內(nèi)的分布及生物學(xué)功能尚不清楚。

      了解和掌握TTLL12在細(xì)胞中的分布,對(duì)進(jìn)一步研究TTLL12的功能至關(guān)重要,因此,本研究利用間接免疫熒光法和Western blot率先證實(shí)TTLL12主要分布在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及細(xì)胞核膜,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的α-微管蛋白與TTLL12的分布一致,這一結(jié)果很好地解釋了TTLL12的已知功能。筆者前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)TTLL12會(huì)干擾硝基化酪氨酸與微管蛋白的結(jié)合。在真核細(xì)胞中,α-tubulin主要分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),參與形成細(xì)胞骨架、維持細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞移動(dòng)、細(xì)胞內(nèi)各種物質(zhì)的運(yùn)輸及細(xì)胞的分裂等,與細(xì)胞的正常生命活動(dòng)密切相關(guān)。硝基化酪氨酸與α-tubulin結(jié)合,形成硝基化酪氨酸微管蛋白,影響微管的功能,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。TTLL12可能利用TTL結(jié)構(gòu)域的微管蛋白酪氨酸連接酶活性,與細(xì)胞質(zhì)中的α-tubulin結(jié)合,從而阻礙了硝基化酪氨酸與α-tubulin的結(jié)合,最終促進(jìn)頭頸鱗癌的生長(zhǎng)[7]。分布在細(xì)胞核和細(xì)胞核膜的TTLL12很可能與染色體數(shù)量明顯增多[17],H4K20表達(dá)升高[19],HIV-1復(fù)制[13]有關(guān),而這些功能很可能與TTLL12的SET結(jié)構(gòu)域有關(guān)。由此可見,搞清楚了TTLL12的分布,可以更好地理解TTLL12的各種功能,同時(shí)也為下一步研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

      另外,在沉默TTLL12的表達(dá)后,本研究利用MTT試驗(yàn)和Boyden小室侵襲試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲能力的變化,結(jié)果表明沉默TTLL12會(huì)導(dǎo)致SCC-25細(xì)胞生長(zhǎng)變慢,侵襲能力變?nèi)?。這說明沉默TTLL12可有效抑制SCC-25細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲,其原因可能是,沉默TTLL12后,阻斷了TTLL12對(duì)微管的影響作用。微管與細(xì)胞周期和細(xì)胞移動(dòng)密切相關(guān)[20-21],在細(xì)胞間期時(shí),α-tubulin聚合形成微管,形成細(xì)胞內(nèi)的網(wǎng)架結(jié)構(gòu),當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入分裂期時(shí),核膜分解,α-tubulin解聚,然后重新聚合形成紡錘體,并引導(dǎo)染色體運(yùn)動(dòng),在分裂末期,紡錘體又會(huì)發(fā)生解聚,重新形成細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的網(wǎng)架結(jié)構(gòu),核膜重新形成。當(dāng)細(xì)胞移動(dòng)時(shí),會(huì)發(fā)生形狀改變,偽足形成,這些都需要微管的參與[22]。在沉默TTLL12后,TTLL12對(duì)微管的作用也會(huì)消失,從而導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)變慢,侵襲能力變?nèi)酢TLL12在核膜也有分布,這或許影響了有絲分裂時(shí)的核膜分解和形成。但其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

      綜上所述,TTLL12分布于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及細(xì)胞核膜。由于其分布較廣,TTLL12很可能還有一些其他功能尚未發(fā)現(xiàn),需進(jìn)一步研究。沉默TTLL12會(huì)導(dǎo)致SCC-25細(xì)胞生長(zhǎng)變慢,侵襲能力變?nèi)酢R虼?,TTLL12有望作為治療口腔鱗癌的靶點(diǎn)之一。

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