生防菌GHt-q6 對黃瓜枯萎病菌的抑制作用

衛(wèi)傳昊，王美琴

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山西太谷030801）

近幾十年來，隨著設(shè)施蔬菜種植規(guī)模的不斷增大，連作現(xiàn)象嚴(yán)重，由鐮刀菌（Fusarium）引起的枯萎病造成死棵是影響蔬菜生產(chǎn)的重要因素。其中，由黃瓜專化型尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporumf.sp.cucumerinum）引起的黃瓜枯萎病嚴(yán)重?fù)p害了黃瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前，防治該病害主要依靠化學(xué)防治及簡單的農(nóng)業(yè)措施，以化學(xué)農(nóng)藥為主導(dǎo)的植物病害防治策略引起了環(huán)境污染、抗藥性增強及農(nóng)藥殘留等嚴(yán)重問題[1]，而農(nóng)業(yè)防治由于技術(shù)與成本問題很難大面積推廣[2]。相對于化學(xué)農(nóng)藥引起的問題，生物菌劑以其無污染、無殘留、綠色環(huán)保等特點成為農(nóng)藥界及植保界研究的熱點[3-4]。

目前，應(yīng)用生防菌及其產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)進(jìn)行枯萎病生物防治的研究取得明顯進(jìn)展。趙文娟等[5]和王永強[6]研究表明，解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）發(fā)酵液可使黃瓜枯萎病菌的菌絲與孢子形態(tài)發(fā)生嚴(yán)重畸形并停止發(fā)育，同時能破壞番茄枯萎病病原菌的菌絲結(jié)構(gòu)，使其扭曲受損，說明解淀粉芽孢桿菌對病原菌的生長發(fā)育有抑制作用。張德珍等[7]和趙佳等[8]研究表明，解淀粉芽孢桿菌可以降低黃瓜枯萎病的嚴(yán)重度，對西瓜枯萎病也有良好防效，說明解淀粉芽孢桿菌可以抑制病害的發(fā)生，具有良好的防治效果。

本研究以山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院生物防治課題組從核桃青皮中分離得到并通過誘導(dǎo)篩選的解淀粉芽孢桿菌高效生防菌株GHt-q6 為生防菌[9-10]，采用平板對峙法、菌落直徑生長抑制法和孢子萌發(fā)法等研究其對黃瓜枯萎病菌的抑菌效應(yīng)，為后續(xù)生防菌劑的生產(chǎn)應(yīng)用提供參考和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試拮抗菌 生防菌GHt-q6 由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實驗室保存提供。

1.1.2 供試病原菌 黃瓜?；图怄哏牭毒‵usarium oxysporumf.sp.cucumerinum）、辣椒?；图怄哏牭毒‵usarium oxysporumf. sp.capsicum）、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、半裸鐮刀菌（Fusarium semitectum）均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實驗室保存提供。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g、蒸餾水1 000 mL；牛肉膏蛋白胨（NA）培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂粉15g、蒸餾水1000mL；LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母膏5 g、氯化鈉8 g、蒸餾水1 000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 生防菌GHt-q6 對4種鐮刀菌菌絲生長的影響 采用平板對峙法，將保存的黃瓜?；图怄哏牭毒?、辣椒?；图怄哏牭毒?、禾谷鐮刀菌和半裸鐮刀菌分別接種于PDA 平板培養(yǎng)活化，待長出菌落后，用直徑為6 mm 的打孔器在菌落邊緣取菌碟，接種于新的PDA 平板中央，用滅菌的接種環(huán)挑取活化好的生防菌GHt-q6 單菌落點在距致病菌2 cm外四周處接入，以不接生防菌的PDA 平板為對照，每個處理重復(fù)3 次，置于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，觀察并測量鐮刀菌的抑菌圈直徑。同時挑取與生防菌GHt-q6 對峙培養(yǎng)的黃瓜專化型尖孢鐮刀菌邊界處菌絲，以不接生防菌的PDA 平板為對照，在顯微鏡下觀察菌絲的生長情況。

1.2.2 生防菌GHt-q6 發(fā)酵液制備 取-20 ℃保存的生防菌GHt-q6，在NA 平板上劃線進(jìn)行活化，28 ℃培養(yǎng)24 h 后，挑取單菌落接種于LB 培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min，振蕩培養(yǎng)24 h 制成種子液，取1 mL 種子液接種到100 mL LB 培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min，振蕩培養(yǎng)48 h，10 000 r/min 離心15 min，除去大部分菌體，取上清液，過0.22 μm 無菌濾膜，濾液置于4 ℃冰箱，備用。

1.2.3 生防菌GHt-q6 發(fā)酵液對黃瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)的影響 制備黃瓜枯萎病病菌孢子懸浮液，將保存的黃瓜枯萎病菌接種于PDA 平板，26 ℃培養(yǎng)活化，長出菌落后，用直徑為6 mm 打孔器在菌落邊緣取菌碟重接在新的PDA 平板上，26 ℃培養(yǎng)5 d，加10 mL 無菌水，在超凈工作臺用玻璃涂布棒刮取菌落表面，使用無菌紗布過濾，去除菌絲，收集病菌孢子，用無菌水調(diào)節(jié)孢子懸浮液濃度至8×105個/mL，4 ℃冰箱保存，備用。向已滅菌的1.5 mL 離心管中加入黃瓜枯萎病菌孢子懸浮液600 μL，按體積比1∶1、2∶1、3∶1 加入生防菌GHt-q6 發(fā)酵液，以體積比1∶1 孢子懸浮液和無菌水為對照，每個處理重復(fù)3 次。分別吸取60 μL 滴加在滅菌凹玻片上，將凹玻片放在鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱27 ℃培養(yǎng)，在6、12、24 h 時鏡檢，觀察孢子萌發(fā)情況，以孢子芽管的長度超過孢子直徑的1/2 記為已萌發(fā)孢子[11]。

1.2.4 生防菌GHt-q6 發(fā)酵液對黃瓜枯萎病菌菌絲生長的影響 將生防菌GHt-q6 發(fā)酵液加入到40～50 ℃的150 mL PDA 培養(yǎng)基中，使其含生防菌GHt-q6 發(fā)酵液的終濃度分別為5%、10%、25%，混勻后倒平板，以正常PDA 平板為對照，用直徑為6 mm 打孔器在活化好的黃瓜枯萎病菌菌落邊緣取菌碟，在各濃度的平板中央接種菌碟，26 ℃培養(yǎng)5 d，每個處理重復(fù)3 次，采用十字交叉法測量病原菌菌落直徑，計算抑菌率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excle 2019 進(jìn)行圖表的制作；采用SPSS 21.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌GHt-q6 對4 種鐮刀菌抑菌活性的影響

從圖1 可以看出，平板對峙培養(yǎng)后，培養(yǎng)5 d時，4 種鐮刀菌與生防菌之間均形成了明顯的抑菌帶，生防菌GHt-q6 周圍產(chǎn)生明顯的抑菌圈，抑菌圈直徑均超過3 mm，說明生防菌GHt-q6 能夠抑制4 種鐮刀菌生長。

2.2 生防菌GHt-q6 對黃瓜枯萎病菌菌絲形態(tài)發(fā)育的影響

由圖2 可知，生防菌GHt-q6 與黃瓜?；图怄哏牭毒鷮χ排囵B(yǎng)，與對照相比，黃瓜專化型尖孢鐮刀菌邊界菌絲發(fā)生了扭曲斷裂，腫大變形，可以清晰看見其內(nèi)含物（圖2-B）。

2.3 生防菌GHt-q6 發(fā)酵液對黃瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)的影響

從表1 可以看出，黃瓜枯萎病菌孢子懸浮液與生防菌GHt-q6 發(fā)酵液不同體積比混合培養(yǎng)后，黃瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)受到顯著影響。其中，培養(yǎng)6 h時，3 個處理組與對照組相比，處理1、2、3 的孢子萌發(fā)率均顯著低于對照組（P＜0.05），均為0，說明生防菌GHt-q6 發(fā)酵液能顯著抑制黃瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)；培養(yǎng)12、24 h 時，4 個處理組間孢子萌發(fā)率差異顯著（P＜0.05），生防菌GHt-q6 發(fā)酵液濃度越高，孢子萌發(fā)率越低，隨著時間的增加，處理1、2、3的孢子萌發(fā)率均呈上升趨勢。培養(yǎng)6 h 時，處理1、2、3 間的孢子萌發(fā)抑制率差異不顯著（P＞0.05），均為100%；培養(yǎng)12、24 h 時，處理1、2、3 間孢子萌發(fā)抑制率差異顯著（P＜0.05）；生防菌GHt-q6 發(fā)酵液濃度越高，孢子萌發(fā)抑制率越高，隨著時間的增加，處理1、2、3 的孢子萌發(fā)抑制率均呈下降趨勢。

表1 生防菌GHt-q6 發(fā)酵液對黃瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)的影響

由圖3 可知，通過顯微鏡觀察凹玻片上黃瓜枯萎病菌孢子的萌發(fā)情況，培養(yǎng)12 h 時，對照組孢子萌發(fā)產(chǎn)生細(xì)長、透明的芽管處理組孢子萌發(fā)產(chǎn)生的芽管均膨大異常，隨著生防菌GHt-q6 發(fā)酵液濃度越高，孢子萌發(fā)產(chǎn)生的芽管長度越短；培養(yǎng)24 h時，處理組孢子變形成泡囊狀，芽管嚴(yán)重畸形，無法產(chǎn)生分生孢子。

2.4 生防菌GHt-q6 發(fā)酵液對黃瓜枯萎病菌菌絲的抑制作用分析

從圖4 可以看出，當(dāng)生防菌GHt-q6 發(fā)酵液與培養(yǎng)基均勻混合后其含生防菌GHt-q6 發(fā)酵液的終濃度分別為5%、10%、25%時，黃瓜枯萎病菌菌落直徑分別為4.65、3.17、2.05 cm，3 個處理間菌落生長直徑差異顯著，均顯著低于對照組的菌落直徑（P＜0.05）；生防菌GHt-q6 發(fā)酵液濃度為5%、10%、25%的抑制率分別為43.36%、63.87%和78.38%，3 個處理間菌絲生長抑制率差異顯著（P＜0.05）；隨著發(fā)酵液濃度的增加，對菌絲生長的抑制效果越來越強。說明生防菌GHt-q6 發(fā)酵液能夠明顯抑制黃瓜枯萎病菌菌絲生長。

3 結(jié)論與討論

本研究以山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院生物防治課題組前期篩選的生防菌GHt-q6 為試驗材料，分析其對黃瓜枯萎病菌的抑制作用。結(jié)果表明，生防菌GHt-q6 對黃瓜?；图怄哏牭毒?、辣椒專化型尖孢鐮刀菌、禾谷鐮刀菌和半裸鐮刀菌均有明顯的抑菌效果。吳紅玉[12]研究表明，此菌對核桃枯梢病菌、番茄灰霉菌和葉霉菌等病原菌也有極強的抑制效果，說明生防菌GHt-q6 具有良好的廣譜抑菌能力。黃瓜枯萎病菌與生防菌GHt-q6 對峙培養(yǎng)后，邊界處菌絲出現(xiàn)明顯受損現(xiàn)象。史一然等[13]研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌LZN01 發(fā)酵液使西瓜枯萎病菌菌絲生長受到抑制，膨大變形且表面受損；李揚等[14]研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌ZJ01 與棗黑斑病菌對峙區(qū)菌絲發(fā)生原生質(zhì)體割裂，菌絲頂端膨大且產(chǎn)孢異常。黃瓜枯萎病菌菌絲在含生防菌GHt-q6 發(fā)酵液平板上生長受到抑制，其在濃度為25%時的抑制率為78.38%。李萍等[15]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌BTF5 對西瓜枯萎病菌的抑制率達(dá)63.01%；許帥等[16]研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌ZF128 對馬鈴薯枯萎病菌的抑制率達(dá)60.65%；趙艷娟[17]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌GY1 對黃瓜、苦瓜、番茄和茄子枯萎病的菌絲抑制率分別為59.01%、60.12%、54.57%和59.01%。本研究與前人研究結(jié)果相比，發(fā)現(xiàn)生防菌GHt-q6 對黃瓜枯萎病菌抑菌效果顯著，具有開發(fā)應(yīng)用的潛力。

自然條件下，黃瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)后產(chǎn)生芽管從根部傷口或根冠細(xì)胞間隙侵入植物[18]。本研究通過生防菌GHt-q6 發(fā)酵液與黃瓜枯萎病菌孢子懸浮液混合培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，生防菌GHt-q6 發(fā)酵液能明顯抑制黃瓜枯萎病菌孢子的萌發(fā)，培養(yǎng)6、12、24 h，體積比為1∶1 時孢子萌發(fā)抑制率分別為100%、58.45%、45.12%。因此，生防菌GHt-q6 抑制黃瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)對于防治黃瓜枯萎病非常關(guān)鍵。苑琳等[19]研究發(fā)現(xiàn)，萎縮芽孢桿菌SF1 對尖孢鐮刀菌胡麻?；偷钠骄志蕿?6%；蘭瑩等[20]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌無菌上清液對黃瓜枯萎病病原真菌孢子萌發(fā)抑制率為76.83%。本試驗與前人研究結(jié)果基本一致，推測生防菌GHt-q6 代謝產(chǎn)生某些抑菌物質(zhì)，從而抑制病原菌生長。

本研究結(jié)果表明，生防菌GHt-q6 具有很大的開發(fā)應(yīng)用價值，可為今后探索防治黃瓜枯萎病的微生物制劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)，但關(guān)于生防菌GHt-q6發(fā)酵液的最佳使用濃度以及穩(wěn)定性還有待進(jìn)一步研究。