環(huán)孢素A對圍著床胚胎的作用及在不明原因反復(fù)著床失敗中的應(yīng)用探索

黃煒，馬燕琳，謝寶國，黃元華

體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)中胚胎可能著床失敗，但反復(fù)著床失敗(recurrent implantation failure,RIF)特別是原因不明會給醫(yī)生和患者帶來極大的困擾。RIF只是一種對治療經(jīng)歷的描述，作為診斷，目前尚未達成統(tǒng)一的標準。胚胎著床失敗的原因源于胚胎、子宮內(nèi)膜容受性和胚胎-子宮內(nèi)膜同步等因素。如何改善胚胎因素成為當今關(guān)注的焦點。

環(huán)孢素A(cyclosporine A,CsA)是一種傳統(tǒng)的免疫抑制藥物，是從真菌Beauveria nivea的代謝產(chǎn)物中提取的環(huán)狀多肽類化合物[1]，由11個氨基酸組成，其中一個是含9碳和1個乙烯雙鍵的新氨基酸，主要用于器官移植和治療自身免疫性疾病。CsA主要作用于T淋巴細胞[2-3]，通過與胞質(zhì)環(huán)親蛋白(cyclophilin)結(jié)合形成復(fù)合物，再與鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin)催化亞單位結(jié)合，抑制其去磷酸化活性，從而抑制活化T細胞核因子的活化與向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，下調(diào)T細胞特異性細胞因子的轉(zhuǎn)錄和白介素2(interleukin 2,IL-2)的分泌，妨礙T細胞活化擴增及其免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。此外，CsA還抑制抗原提呈細胞表面協(xié)同刺激分子的表達及IL-12的生成，調(diào)節(jié)Th1/Th2型細胞因子的平衡[4-6]，同時抑制樹突狀細胞在中樞的遷移和成熟，誘導(dǎo)免疫耐受[7]。

越來越多的研究提示，CsA存在許多其他的生物學(xué)作用，對包括滋養(yǎng)細胞在內(nèi)的多種類型細胞的生物學(xué)功能具有明顯影響。

1 滋養(yǎng)細胞與胚胎著床

胎盤是胎兒與母體直接接觸的器官，其內(nèi)分泌功能、物質(zhì)代謝功能和免疫功能是胎盤最為重要的功能，滋養(yǎng)細胞(trophoblast，TB)是胚胎完成著床的功能細胞。人類胚胎約發(fā)育到第5天形成囊胚，其外圍的扁平細胞為TB。胚胎發(fā)育的第7～8天，著床部位的 TB 外層分化，細胞膜融合形成合體滋養(yǎng)細胞(syncytotrophoblast，ST)，此時的 TB 稱為絨毛前滋養(yǎng)細胞(previllous trophoblast)。子宮內(nèi)膜若處于胚胎著床窗口期，胚胎通過TB經(jīng)過粘附與附著、侵襲植入子宮內(nèi)膜，子宮內(nèi)膜反應(yīng)性增生并包埋胚胎完成胚胎著床。因此，胚胎TB的附著和侵襲功能對著床至關(guān)重要。

粘附是胚胎著床的基礎(chǔ)，它既是TB的基本功能，同時也為TB發(fā)揮侵襲能力，分解細胞外基質(zhì)創(chuàng)造了物理條件。TB在子宮內(nèi)的侵襲過程中一直改變著其與細胞外基質(zhì)的粘附性，表現(xiàn)為具有滋養(yǎng)干細胞的特征性粘附分子減少，而具有血管細胞特征的粘附分子表達增加。纖連素(fibronectin)是整合素αvβ3的生理受體之一[8]，著床前后胚胎和子宮內(nèi)膜出現(xiàn)整合素αvβ3被認為是胚胎著床窗口出現(xiàn)的標志。絨毛外TB上調(diào)與細胞外基質(zhì)結(jié)合的整合素αvβ3表達，下調(diào)與細胞間結(jié)合的E-鈣粘素的表達[9-10]，細胞的遷移與侵襲能力增強。用整合素αvβ3單克隆抗體處理TB后，TB的侵襲能力受到嚴重抑制。此外，蛋白酶與細胞的侵襲能力密切相關(guān)，多項研究提示基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloprotein,MMP)-9是胚胎侵襲能力的標志[11]。

2 環(huán)孢素A對滋養(yǎng)細胞和圍著床胚胎的影響

2.1 環(huán)孢素A與腫瘤細胞增殖

CsA對細胞生物學(xué)功能的影響研究源于器官移植中患者惡性腫瘤高發(fā)現(xiàn)象。長期應(yīng)用CsA的器官移植的患者惡性腫瘤的發(fā)生率增加[12-15]，認為是免疫抑制治療后導(dǎo)致免疫監(jiān)視體系弱化產(chǎn)生的結(jié)果[16-20]。然而，Hojo M等[21]在研究CsA對腫瘤細胞增殖作用中發(fā)現(xiàn)，CsA在體外不依賴于免疫系統(tǒng)的條件下使腺癌細胞發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)變化，包括細胞膜變得活躍，偽足明顯伸出、侵襲性生長，這些變化可以被TGF-β單克隆抗體阻斷。在活體成瘤實驗中，將癌細胞移植到免疫缺陷鼠SCID-beige體內(nèi)，CsA可以促進移植瘤形成，使用TGF-β單克隆抗體則可以阻斷這一作用。這說明CsA可不依賴于降低免疫監(jiān)視功能而直接作用于腫瘤細胞。TB增生活躍，具有侵襲特性，能有效逃避免疫系統(tǒng)的攻擊，它在增殖、侵襲和遷移等方面與腫瘤細胞極為相似[22]，被譽為“假惡性”型組織(pseudo-malignant type of tissue)或生理性轉(zhuǎn)移(physiological metastasis)[23-27]。研究表明，CsA可影響TB的增殖、遷移和侵襲能力。

2.2 環(huán)孢素A與人類早孕絨毛滋養(yǎng)細胞

免疫性流產(chǎn)在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中占較大比重。應(yīng)用CBA(♀)×DBA/2(♂)小鼠免疫流產(chǎn)模型，杜美蓉等[29-31]在小鼠孕4天，胃飼CsA 5、10和15mg/kg，使小鼠胚胎吸收率由20.25%，分別降到2.86%、6.25%和11.24%，說明對于小鼠免疫性流產(chǎn)，小劑量使用CsA治療是有效的，提示了其臨床應(yīng)用的可能。進一步的研究中發(fā)現(xiàn)，CsA對人早孕絨毛TB有直接作用，包括促進增殖、遷移和侵襲，抑制凋亡。

杜美蓉等觀察了CsA對人早孕期絨毛TB的影響。在0.001、0.01、0.1、1 μmol/L濃度下，TB的偽足增加、延長，但當濃度增加到10 μmol/L后，其作用反倒減弱。在transwell assay實驗中，在0.001、0.01、0.1、1 μmol/L濃度下，隨濃度增加，細胞的侵襲遷移能力增強，到10 μmol/L時，遷移受到抑制。周文慧等[32]發(fā)現(xiàn)CsA增加人早孕期合體絨毛TB的侵蝕性，促進MMP-9和MMP-2的表達，增加其活性。

CsA可上調(diào)包括Titin在內(nèi)的6個基因的表達[33]，推測這些因子可能在CsA調(diào)節(jié)人類TB生長和侵襲中發(fā)揮了重要的作用。TB的金屬蛋白酶在分解細胞外基質(zhì)，使TB侵入子宮內(nèi)膜具有重要的作用。Titin也稱為connectin，是連接構(gòu)成橫紋肌(striated muscle)A-段和I-段的一種巨型蛋白(肌肉巨球蛋白)，也是細胞運動、細胞形態(tài)和跨膜信息轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，該蛋白涉及肌肉的收縮和彈性，并涉及細胞核中的染色體凝聚。

CsA對T淋巴細胞功能的抑制是通過MAPK信號傳導(dǎo)中JNK和p38MAPK通路傳導(dǎo)[34]。對于TB，杜美蓉等[35-36]證實CsA通過MAPK/ERK(1/2)信號通路促進TB的增殖、遷移和MMPs(MMP-9和MMP-2)的表達。有證據(jù)表明，無論在細胞內(nèi)或細胞外，ERK1/2的酪氨酸殘基先于蘇氨酸殘基被磷酸化[37]，僅有酪氨酸磷酸化的ERK激酶不具有活性，必須積聚起來，達到閾值才能使蘇氨酸磷酸化，使激酶迅速轉(zhuǎn)為活性狀態(tài)。由此推測MEK-MAPK激活的特點可增強MAPK激酶活化的協(xié)同性，并允許其它信號途徑進行調(diào)節(jié)。MAPK/ERK的生物效應(yīng)包括促進細胞增殖、調(diào)節(jié)細胞分化和調(diào)節(jié)細胞周期，具有雙相活性(G1至S期和G/M期活性增強，而在G1期和M期發(fā)生雙相激活)。在大多數(shù)細胞中，如成纖維細胞、蛤卵母細胞中，MAPK的激活是one-time事件，可調(diào)節(jié)細胞周期中的G0/G1期轉(zhuǎn)換。MAPK/ERK信號傳導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)與CsA在TB功能效應(yīng)影響相一致。

著床是圍著床胚胎的基本功能，就胚胎而言，主要涉及囊胚外層合體TB和隨后分化的絨毛外TB。不同于早孕絨毛TB，圍著床胚胎具有以下特點：① 它是一個生命整體，其總體功能取決于不斷變化的胚胎內(nèi)多系細胞(細胞TB、合體TB、絨毛外TB、內(nèi)細胞團)的相互作用。② 其功能表現(xiàn)最終以整個胚胎表現(xiàn)呈現(xiàn)。

黃元華等[38]以小鼠胚胎為模型進行了有關(guān)CsA影響的研究。在0.1～10 μM CsA的作用濃度下，從2細胞期到胚胎孵出前(4日胚胎)沒有發(fā)現(xiàn)CsA對胚胎的發(fā)育速度、細胞數(shù)量、胚胎質(zhì)量、細胞凋亡、囊胚形成率、內(nèi)細胞團/TB比例和囊胚孵出率等存在影響。在胚胎孵出后，發(fā)現(xiàn)CsA存下以下方面的影響：① 胚胎在層粘蛋白(laminin)包被的培養(yǎng)皿底部的粘附能力增強；② 胚胎占據(jù)層粘蛋白包被的培養(yǎng)皿底部的面積增加，提示遷移細胞遷移能力提高；③ CsA上調(diào)整合素β3亞基和MMP9 mRNA轉(zhuǎn)錄，上調(diào)它們的表達，研究提示在胚胎整體層面，CsA改善胚胎粘附、滋養(yǎng)細胞遷移和侵襲功能。直接觀察胚胎與層粘蛋白粘附的研究中發(fā)現(xiàn)[39]，CsA促進圍著床胚胎粘附經(jīng)熒光標記的層粘蛋白活性片段Fn 120的能力，并且這個能力通過Ca2+、鈣粘素和蛋白激酶C自行放大。

李丹等[40]電鏡下觀察了CsA對圍著床胚胎TB微結(jié)構(gòu)的改變。TB頂端的囊泡內(nèi)含大量的蛋白質(zhì)、核酸、mRNA轉(zhuǎn)錄酶等物質(zhì)，與質(zhì)膜融合并釋放內(nèi)容物到其他細胞，其功能主要促進細胞生長、侵襲、轉(zhuǎn)移[41]；將D4孵出的胚胎置于層連蛋白包被的培養(yǎng)皿培養(yǎng)，并于D5和D6觀察囊泡變化發(fā)現(xiàn)，D5胚胎TB內(nèi)囊泡的數(shù)量明顯增加，D6胚胎TB的囊泡明顯增大。

在著床的過程中，同時伴有TB的分化。絨毛外TB在這個過程中形成，并在此后的胎盤形成中發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用。黃煒、汪佳星等[42-43]分別用胚胎干細胞誘導(dǎo)分化的絨毛外TB、iPS細胞誘導(dǎo)分化的絨毛外TB、原代TB分化的絨毛外TB和HTR-8/SVneo細胞株(一種絨毛外TB株)進行研究表明，CsA具有改善絨毛外TB增殖、遷移和侵襲能力。

毋夢蘭等[44]在活體觀察了CsA對小鼠胚胎著床的影響。取3日小鼠囊胚，依據(jù)Gardner評級標準，內(nèi)細胞團A、B級胚胎用于移植。依據(jù)TB發(fā)育，胚胎分為A、B和C 級，每級分為治療組和對照組。治療組于移植日腹腔注射CsA 5 mg/kg，每組使用6個雌鼠作為代孕鼠。移植后11日處死代孕鼠，計數(shù)著床胚胎。結(jié)果顯示，在TB為B級的囊胚中，使用了CsA的代孕鼠胚胎著床率為73.9%，明顯高于對照組(50%，P<0.05)。當TB為A級或C級時，CsA并不能顯著改善胚胎著床率。提示TB完整的胚胎期著床能力具有一定限度，TB嚴重缺陷時CsA的作用有限，在TB層輕度受損時，其作用較為明顯。

3 環(huán)孢素A在反復(fù)著床失敗中的臨床應(yīng)用探索

3.1 原因不明反復(fù)著床失敗的原因混雜

對于具有明確原因的著床失敗，原則上是針對原因處理。但在具體患者中，每個月經(jīng)周期的內(nèi)分泌與卵母細胞、子宮內(nèi)膜、胚胎都具備獨特性，科學(xué)認知和檢驗方法存在局限性，并受到患者年齡、IVF-ET方案、治療的規(guī)范性、不孕癥人群特征等影響，較多的RIF的因素無法在具體的患者中得到確定[45-47]，常常歸類于原因不明。因此在不同的被研究的不明原因RIF對象中，病因組成各不相同，這給臨床研究、觀察和方案制定帶來了諸多困擾。目前尚不明了TB功能不足相關(guān)的著床失敗在RIF人群中的比例。經(jīng)過嚴格原因檢查，仍然不能解釋著床失敗者，CsA對TB功能的影響可能在解決部分RIF中發(fā)揮作用。

3.2 環(huán)孢素A在不明原因反復(fù)著床失敗的應(yīng)用嘗試

我們以不少于2次胚胎移植，或不少于3個優(yōu)質(zhì)胚胎移植無著床者為RIF標準，在嚴格對RIF進行病因檢查的基礎(chǔ)上，對35歲以下、不明原因的RIF進行了CsA隨機對照研究(未發(fā)表資料)，對照組140例，(32.7±4.5)歲，共移植(3.5±0.8)優(yōu)質(zhì)胚胎，治療組122例，(32.9±4.4)歲，共移植(3.8±1.8)優(yōu)質(zhì)胚胎。治療組于取卵后3天(或子宮內(nèi)膜孕激素轉(zhuǎn)化后3天)開始使用CsA 150 mg/日共13日，生化妊娠陽性者繼續(xù)用藥30天至出現(xiàn)胎心。結(jié)果顯示，對照組和治療組的胚胎著床率、臨床妊娠率、繼續(xù)妊娠率和獲嬰率分別為14.2%和20%(P=0.002)，27.1%和39.3%(P=0.048)，21.4%和34.4%(P=0.026)，20%和31.1%(P=0.046)。治療組的治療結(jié)局雖然較同期IVF-ET差，但較對照組有明顯的改善。結(jié)果初步說明：① 不明原因RIF患者中部分患者存在TB功能不足；② 部分患者通過改善TB功能而取得胚胎著床。但目前的結(jié)果尚不足以得出結(jié)論，多中心觀察正在進行中。

3.3 環(huán)孢素A在改善胚胎著床中的應(yīng)用前景展望

基礎(chǔ)研究表明，CsA對圍著床胚胎的作用發(fā)生于囊胚孵出后，且作用點在TB，而臨床上難以就TB功能障礙做出明確的判斷，這成為確定應(yīng)用場景的難點。減少不必要的用藥十分關(guān)鍵，因此其在RIF的應(yīng)用場景需符合以下條件：胚胎具備發(fā)育成囊胚并孵出的能力，同時需排除形態(tài)學(xué)上胚胎質(zhì)量問題、胚胎存在遺傳學(xué)問題(或胚胎植入前遺傳學(xué)檢測觀察具備遺傳學(xué)問題的胚胎比例過高)、導(dǎo)致胚胎著床障礙的宮腔病變、腹腔病變、既往移植中胚胎-子宮內(nèi)膜同步調(diào)節(jié)問題等。

進一步研究判斷在胚胎著床障礙中使用CsA的明確的靜態(tài)或動態(tài)形態(tài)學(xué)特征、生物化學(xué)的相關(guān)參數(shù)仍需進一步的研究和探索。

4 環(huán)孢素A在生殖領(lǐng)域的應(yīng)用探索與風(fēng)險

必須清晰地認識到，在藥典上明確規(guī)定CsA是用于器官移植和自身免疫性疾病的藥物，且在使用說明書中明確表示孕婦和哺乳婦女禁用。因此應(yīng)用于生殖領(lǐng)域包括法律、子代、孕婦的風(fēng)險不可忽視，其中法律風(fēng)險與子代風(fēng)險尤為突出。

4.1 母體和子代風(fēng)險

實驗動物和人類的數(shù)據(jù)均表明CsA不存在遺傳毒性作用[48]。在器官移植長期服用CsA的患者中腫瘤的發(fā)生風(fēng)險增加，其機制尚不十分明了，免疫抑制和對細胞增殖的促進作用可能是因素之一。在生殖和發(fā)育方面，動物實驗中應(yīng)用高劑量CsA會產(chǎn)生一些不良影響。在人類臨床應(yīng)用中尚沒有觀察到先天性畸形和遺傳疾病增加，但出現(xiàn)輕度的發(fā)育受限(體重略低)。人類的數(shù)據(jù)主要來自于器官移植婦女妊娠的觀察。但上述患者的結(jié)果需要考慮兩個方面的影響因素：一方面患者由于接受移植器官而整個孕期都在用藥中，另一個方面是這些婦女的健康問題(如腎功能)。目前尚不知道CsA在其中發(fā)揮的作用。同時也必須注意到，人類的觀察數(shù)據(jù)受到標本數(shù)量的限制，對子代觀察的數(shù)據(jù)也缺乏統(tǒng)一標準。CsA用于器官移植免疫排異抑制的劑量較大(維持劑量為2～6 mg/kg/日)，且整個孕期暴露于藥物中。就我們的觀察而言，在生殖領(lǐng)域的應(yīng)用劑量小(2～3 mg/kg/日)，不同于器官移植婦女的全孕期用藥，用藥時間短(胚胎著床前后到孕60天)，孕婦風(fēng)險推測較小，估計子代風(fēng)險不高于器官移植婦女生育所經(jīng)歷的風(fēng)險。

4.2 環(huán)孢素A在不明原因反復(fù)著床失敗的作用探索與藥物濫用問題

生育中胚胎發(fā)育是受精卵的基因組依據(jù)編程在正確的時間、正確的空間以正確的強度表達的結(jié)果。盡可能避免對這一過程的干擾是每個生殖醫(yī)學(xué)工作者必須遵循的原則。然而，在實際工作中，在面對不明原因RIF和其他早期妊娠異常(如不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn))，藥物濫用現(xiàn)象嚴重，包括CsA的濫用，給子代安全帶來了較大的潛在風(fēng)險。醫(yī)生必須杜絕基于“怕”胚胎不著床或“幫助”胚胎著床對非特異性患者進行濫用藥物。

目前，盡管對CsA在生殖領(lǐng)域?qū)ψ哟娘L(fēng)險進行了估計，但數(shù)據(jù)主要來源于動物實驗和器官移植婦女的生育觀察，存在偏差的可能性，不能排除潛在風(fēng)險。CsA對圍著床胚胎的研究主要集中在TB及其功能研究，對內(nèi)細胞團的研究及胚胎形成研究極少，多中心的臨床觀察尚未完成，對子代的觀察尚不深入。這決定了臨床醫(yī)生對這方面的探討必須持十分謹慎的態(tài)度。

不明原因RIF不是單因素導(dǎo)致的結(jié)果，因此，不同的患者產(chǎn)生的機制各不相同，并不存在一種措施能解決所用不明原因RIF的藥物方案。對于RIF“不明原因”，預(yù)示著臨床處理都帶有一定的試探性。CsA作用于孵出后圍著床胚胎的TB，在實際探索中，RIF發(fā)生機制須較大的可能性發(fā)生于這一環(huán)節(jié)。建議試探性用CsA處理不明原因RIF需符合以下條件：1.正面清單。體外培養(yǎng)表明胚胎具備發(fā)育成囊胚的能力，如觀察到胚胎具有孵出能力則更好。2.負面清單。① 靜態(tài)或動態(tài)形態(tài)學(xué)觀察，胚胎質(zhì)量差；② 胚胎存在遺傳學(xué)問題，或胚胎植入前遺傳學(xué)檢測觀察具備遺傳學(xué)問題的胚胎比例過高；③ 既往移植胚胎-子宮內(nèi)膜同步調(diào)節(jié)問題的可能性高；④ 存在可能導(dǎo)致胚胎著床障礙的宮腔病變。

胚胎著床不僅是妊娠的開始，同時也是生殖安全的重要自然選擇機制。為了避免不必要的對胚胎著床的干擾和藥物影響，最大限度地保障生殖安全，在專業(yè)人員內(nèi)需要對RIF的診斷標準、病因判斷程序等方面達成共識。

4.3 風(fēng)險防范

CsA在不明原因RIF的應(yīng)用探索屬于超范圍用藥，其臨床驗證和子代風(fēng)險評估研究不充分，因此臨床探索必須堅持以下原則，同時建議其他應(yīng)用于不明原因RIF的超范圍使用的藥物也遵循這些原則。

① 應(yīng)當清醒地認識到臨床超范圍用藥的法律責任，以十分謹慎的態(tài)度對待臨床各種治療探索。

② 病因判斷上盡可能縮小RIF的范圍，提高用藥機制的相對精準性。杜絕不針對患者特定情況和藥物作用機制的藥物濫用。

③ 機構(gòu)必須對超使用說明書范圍用藥進行管控，對超范圍用藥進行倫理審查。對于具體患者，需要建立超范圍使用藥物的專業(yè)管理和程序，且一人一議。

④ 嚴格執(zhí)行知情同意程序并簽訂知情同意書。簽訂知情同意書一定要建立在當面詳細談話的基礎(chǔ)上。包括具體患者RIF原因判斷，CsA對胚胎著床作用的不確定性，超范圍用藥可能的受益和風(fēng)險(特別是子代)，不良事件的責任和義務(wù)，超范圍用藥的自愿原則，糾紛解決方式等。

⑤ 患者的決定應(yīng)當是慎重考慮后決定的。用藥需在子宮內(nèi)膜準備或促排卵前確定，避免治療中甚至移植前的倉促談話與決定。

⑥ 應(yīng)對子代進行嚴格的監(jiān)測，保障其安全性。