低分子肝素改善子癇前期中的內(nèi)皮損傷的機(jī)制研究

鄧乾葆，張忠霞，王茹，韋秋圓，鄧思思

子癇前期(preeclampsia，PE)是妊娠期特有的疾病，在妊娠婦女中的發(fā)病率約為5%～7%，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦及新生兒死亡的主要原因之一[1]。迄今為止，其具體病因及發(fā)病機(jī)制尚未闡明，主流觀點(diǎn)認(rèn)為胎盤發(fā)育不全、滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)異常、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、氧化應(yīng)激、遺傳和免疫等均參與調(diào)控PE的發(fā)生發(fā)展[2-3]。其中全身血管內(nèi)皮細(xì)胞的活化及功能障礙被認(rèn)為是PE發(fā)病機(jī)制中重要因素之一。大量數(shù)據(jù)顯示聯(lián)合使用低分子肝素能夠顯著改善PE的臨床預(yù)后[4-8]，但關(guān)于低分子肝素對(duì)PE患者的血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)機(jī)制尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。Delta樣配體4(Delta-like ligand 4，DLL4)屬于Notch信號(hào)通路Delta樣配體家族成員之一[9]。既往研究發(fā)現(xiàn)，唯一特異性存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞的DLL4配體能夠通過(guò)DLL4/Notch信號(hào)通路影響血管生成，并調(diào)控血管萌發(fā)及分支的形態(tài)[10-13]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察PE患者在經(jīng)低分子肝素聯(lián)合硫酸鎂治療后胎盤組織中DLL4的變化以評(píng)價(jià)其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響及作用機(jī)制，以期對(duì)PE孕婦的臨床治療提供理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象及分組

選取2018年3月至2019年4月在海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科住院分娩的早發(fā)型重度PE患者60例，按隨機(jī)數(shù)字表法將其分為PE組與低分子肝素組，各30例。兩組明確PE診斷后(診斷標(biāo)準(zhǔn)按照第9版《婦產(chǎn)科學(xué)》[14])予以充分臥床休息及硫酸鎂注射液(遼寧備齊，國(guó)藥準(zhǔn)字H20051795，注射劑，規(guī)格10 mL∶2.5 g)常規(guī)解痙，減壓治療，即首劑20 mL硫酸鎂加入10%葡萄糖注射液100 mL，30 min靜脈快速滴注，隨后給予相同規(guī)格的硫酸鎂20 mL加入5%葡萄糖注射液500 mL中,2.0 g/h靜脈持續(xù)滴注。每個(gè)孕婦24 h硫酸鎂總量不超過(guò)30 g。低分子肝素組在此基礎(chǔ)上每日經(jīng)皮下注射5 000 U的低分子肝素鈉(齊魯制藥，國(guó)藥準(zhǔn)字H20030429，注射劑，規(guī)格0.4 mL∶5 000 IU)。PE組與低分子肝素組孕產(chǎn)婦至少連續(xù)上述治療5天。選取同期因相對(duì)頭盆不稱行剖宮產(chǎn)的正常妊娠孕產(chǎn)婦30例為對(duì)照組。3組孕產(chǎn)婦均為經(jīng)腹剖宮產(chǎn)分娩，并實(shí)時(shí)應(yīng)用地塞米松促進(jìn)胎肺成熟，其一般臨床資料比較詳見(jiàn)71頁(yè)表1。

所有孕產(chǎn)婦均排除對(duì)肝素過(guò)敏及過(guò)敏體質(zhì)者，無(wú)合并原發(fā)性高血壓、肝腎疾病、心臟疾病、糖尿病、甲狀腺疾病、胎盤早剝、前置胎盤、自身免疫性疾病及經(jīng)陰道分娩者，且孕期未使用避孕藥、免疫調(diào)節(jié)劑及其他激素類藥物，妊娠前或孕期未使用阿司匹林或低分子肝素者。本研究所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 細(xì)胞系及主要試劑

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。RPMI1640、0.25%胰蛋白酶(美國(guó)Hyclone公司)；Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；胎牛血清(FBS)、青鏈霉素混合液(均為100 U/mL)(杭州四季青生物公司)；DAPI試劑、Notch信號(hào)通路抑制劑MK-O752(美國(guó)sigma公司)；TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Roche公司)；檢測(cè)ET-1、sVCAM-1的ELISA試劑盒(美國(guó)BD公司)；兔抗Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、GAPDH單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記(HRP)的山羊抗兔IgG(廣州晶彩)；二胺基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(中杉金橋)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。電泳槽、電泳儀及化學(xué)發(fā)光熒光成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Bad公司)。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 于剖宮產(chǎn)手術(shù)當(dāng)日采集3組產(chǎn)婦的晨起空腹肘靜脈血5 mL,1 200 rpm/min離心5 min后收集血清，置于-80℃冰箱中儲(chǔ)存，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用；術(shù)中胎盤娩出后立即在無(wú)菌條件下于胎盤母體面取大小約1 cm×1 cm×1 cm蛻膜組織5～10塊，置于預(yù)冷的無(wú)菌生理鹽水中并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，再次使用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行充分漂洗，以去除殘存血跡，置于4%的多聚甲醛中進(jìn)行固定。

1.3.2 免疫組織化學(xué)(immunohistochemical，IHC)染色 取固定于4%的多聚甲醛溶液中的胎盤組織，梯度酒精脫水，二甲苯透化，石蠟包埋后，切片至4 mm厚度，脫蠟水化后，應(yīng)用檸檬酸緩沖液微波進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻至室溫后，PBS漂洗組織，加入5% BSA于室溫下孵育20 min進(jìn)行封閉，滴加適當(dāng)稀釋后的兔抗DLL4單克隆抗體(1∶100)4℃過(guò)夜，次日于室溫下復(fù)溫20 min，PBS溶液沖洗3次，每次5 min。再加入HRP標(biāo)記的二抗，37℃恒溫反應(yīng)半小時(shí)，PBS溶液沖洗3次，每次5 min。加DAB顯色液顯色(棕色)，顯微鏡下觀察，以及時(shí)終止顯色。蘇木精輕微復(fù)染，返藍(lán)后，再次脫水，透化，中性樹(shù)脂封片，顯微鏡下觀察并參考相關(guān)文獻(xiàn)[15]進(jìn)行結(jié)果判定及分析。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)血清中內(nèi)皮素-1、可溶性血管細(xì)胞黏附分子-1表達(dá)水平 按照內(nèi)皮素-1(endothelian-1,ET-1)、可溶性血管細(xì)胞黏附分子-1(soluble vascular cell adhesion molecule-1,sVCAM-1)的ELISA試劑盒使用說(shuō)明方法檢測(cè)3組孕婦產(chǎn)婦血清中上述細(xì)胞因子表達(dá)水平。上述實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.3.4 內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)及分組 常規(guī)復(fù)蘇HUVEC后使用含10% FBS、1%青鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%～90%時(shí)用0.25%的胰酶進(jìn)行消化傳代。按實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟⒖枷嚓P(guān)文獻(xiàn)[16-18]將內(nèi)皮胞分為4組：陰性對(duì)照(negative control，NC)組，正常培養(yǎng)，無(wú)任何特殊處理的HUVEC；PE血清組，使用含20%PE組孕產(chǎn)婦血清的 RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行處理的HUVEC；PE血清組+低分子肝素組，使用含20%PE患者血清與10 IU/mL的RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行處理的HUVEC；PE血清組+低分子肝素組+MK-O752組，使用含20%PE患者血清與10 IU/mL及25 uM的RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行處理的HUVEC。

1.3.5 TUNEL染色檢測(cè)凋亡 選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC，常規(guī)消化后，細(xì)胞計(jì)數(shù)，取約1×105個(gè)細(xì)胞接種至15 mm的細(xì)胞爬片上，按上述條件于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，按方法1.3.4進(jìn)行處理，并將細(xì)胞分為NC組，PE血清組，PE血清組+低分子肝素組，再次置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，使用4%的多聚甲醛于室溫下固定30 min，PBS輕輕洗滌細(xì)胞，根據(jù)TUNEL試劑盒使用說(shuō)明方法進(jìn)行染色，每張爬片滴加50 uL的TUNEL染色液，室溫下避光孵育1 h，PBS充分洗滌后加入DAPI進(jìn)行染核，PBS再次洗滌細(xì)胞，最后加入封片液于熒光顯微鏡觀察。

1.3.6 單層內(nèi)皮細(xì)胞膜通透系數(shù)的檢測(cè) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HUVEC，計(jì)數(shù)后按1×105個(gè)/孔接種于24孔板的Transwell小室中，分別于上室及下室中加入100 uL、600 uL的RPMI1640培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至單層內(nèi)皮細(xì)胞后，更換上、下室的培養(yǎng)液為不含F(xiàn)BS與酚紅的RPMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)4 h后進(jìn)行透光性檢測(cè)。按方法1.3.4中對(duì)HUVEC進(jìn)行不同的分組處理，同時(shí)在上室加入100 uL FITC標(biāo)記的葡聚糖FD40(1 ug/mL)，培養(yǎng)5 min后取下室培養(yǎng)液200 uL于熒光分光光度計(jì)中檢測(cè)葡聚糖FD40的熒光強(qiáng)度作為基礎(chǔ)值，下室中補(bǔ)充等體積的RPMI1640。于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h時(shí)，再次取200 uL的下室培養(yǎng)液按上述方法檢測(cè)葡聚糖FD40的熒光強(qiáng)度。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。應(yīng)用各組最終檢測(cè)值減去基礎(chǔ)值作為葡聚糖FD40的熒光強(qiáng)度，計(jì)算分析各組細(xì)胞的葡聚糖FD40熒光強(qiáng)度值變化。

1.3.7 Western blot實(shí)驗(yàn) 取方法1.3.4中不同處理的各組細(xì)胞，RIPA細(xì)胞裂解液及蛋白酶抑制劑進(jìn)行提取內(nèi)皮細(xì)胞中的總蛋白。BCA法進(jìn)行蛋白定量，按照1∶4向上清液中加入5×上樣緩沖液，并于沸水中加熱變性10 min。取35 ug的蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳進(jìn)行蛋白分離，采用濕轉(zhuǎn)法將分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%的脫脂牛奶于室溫下封閉2 h后,分別加入Bax(1∶500)、Bcl-2(1∶500)、Cleaved caspase-3(1∶500)、GAPDH(1∶1 000)一抗，4℃搖床孵育過(guò)夜。TBST溶液清洗3次，5 min/次，以辣根酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，以 TBST溶液清洗3次，5 min/次。最后均勻滴加ECL發(fā)光液后于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照。Image J軟件測(cè)定條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參GAPDH的比值作為其相對(duì)含量。以上實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 3組產(chǎn)婦的一般情況比較

3組產(chǎn)婦的年齡、孕周及體質(zhì)量指數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，PE組和低分子肝素組產(chǎn)婦的舒張壓、收縮壓、24 h尿蛋白均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)表1。

表1 3組產(chǎn)婦的一般情況

2.2 低分子肝素對(duì)子癇前期患者血清中ET-1、sVCAM-1表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，PE組及低分子肝素組產(chǎn)婦血清中ET-1、sVCAM-1表達(dá)水平明顯更高；與PE組相比，低分子肝素組產(chǎn)婦血清中上述細(xì)胞因子的表達(dá)水平明顯更低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)表2。

表2 低分子肝素對(duì)PE患者血清中ET-1、sVCAM-1表達(dá)的影響

2.3 低分子肝素對(duì)子癇前期患者胎盤組織中DLL4表達(dá)的影響

IHC檢測(cè)結(jié)果顯示DLL4主要表達(dá)于胎盤組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞中，且與對(duì)照組(63.5%)相比，PE組及低分子肝素組的胎盤組織中DLL4的表達(dá)陽(yáng)性率(分別為14.7%、36.9%)均明顯更低(χ2=8.263，P=0.031)，而低分子肝素組較PE組中DLL4的表達(dá)明顯更高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.541，P=0.027)，見(jiàn)圖1(彩插1)。

2.4 低分子肝素對(duì)子癇前期血清誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL染色結(jié)果顯示，與NC組相比，PE血清組處理后內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率明顯更高(P<0.05)，而與PE血清組相比，PE血清+低分子肝素組的細(xì)胞凋亡率明顯更低(P<0.05)，見(jiàn)圖2(彩插1)。

2.5 低分子肝素對(duì)子癇前期血清誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞完整性的影響

通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞通透性試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)低分子肝素對(duì)PE血清誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的完整性影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組相比，HUVEC在PE血清處理24h后，細(xì)胞的通透性明顯更高(P<0.05)，而與PE血清組相比，PE血清+低分子肝素組的細(xì)胞通透性明顯更低(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

注：與NC相比，*P<0.05;與PE血清組相比，#P<0.05。

2.6 低分子肝素對(duì)子癇前期血清誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中凋亡蛋白表達(dá)的影響

應(yīng)用Notch通路阻滯劑MK-0752檢測(cè)低分子肝素是否主要通過(guò)Notch/DLL4信號(hào)通路發(fā)揮抗PE血清誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用，Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同處理情況下的HUVEC中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax及Cleaved-caspase-3的表達(dá)，結(jié)果顯示，與NC組相比，HUVEC在PE血清處理后，細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯更低(P<0.05)，而蛋白Bax及Cleaved-caspase-3的表達(dá)均明顯更高(P<0.05)；而與PE血清+低分子肝素組相比，PE血清組與PE血清+低分子肝素+MK-0752組中抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯更低(P<0.05)，Bax及Cleaved caspase-3蛋白明顯更高(P<0.05)，見(jiàn)下頁(yè)圖4。

圖4 低分子肝素通過(guò)Notch/DLL4信號(hào)通路抑制PE血清誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中凋亡蛋白

3 討論

近年來(lái)，隨著生活習(xí)慣的改變與妊娠平均年齡的不斷增加，PE的發(fā)生率也隨之升高[2]。低分子肝素因其具有抗炎、抗血栓、安全性較高等特點(diǎn)，理論上能夠改善處于高凝、炎癥因子大量釋放及血管內(nèi)皮受損的PE患者臨床癥狀。同時(shí)，國(guó)內(nèi)外大量研究證實(shí)對(duì)PE患者加用低分子肝素能夠明顯減少抽搐的發(fā)生，延長(zhǎng)妊娠時(shí)間并改善預(yù)后[8,19]。Notch基因最早在研究果蠅的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中被發(fā)現(xiàn)，在果蠅中該基因的局部功能缺失會(huì)導(dǎo)致其翅膀邊沿形成一些缺刻(Notch)而得名。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，Notch信號(hào)通路擁有4種受體及5種配體，分別為Notch1-4受體與配體Jagged1、Jagged2及Delta樣配體DLL1、DLL3、DLL4[20]。在小鼠心外膜血管生成的研究中發(fā)現(xiàn)富含低分子肝素的舒洛地平能夠通過(guò)抑制Notch1/DLL4信號(hào)通路的活化，進(jìn)而下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，最終抑制心外膜組織中血管的生成[21]。而DLL4是唯一特異性存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞的Notch信號(hào)配體，其能通過(guò)Notch信號(hào)通路影響血管生成，尤其是在調(diào)控胚胎血管發(fā)育與腫瘤血管形成中具有重要的地位。正常生理情況Notch/DLL4信號(hào)通路主要通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞的活性，下調(diào)其遷移、分化能力，進(jìn)而抑制血管的萌發(fā)及分支的生成，維持血管形態(tài)及穩(wěn)定[22]。在既往的研究發(fā)現(xiàn)DLL4在PE患者胎盤組織中的表達(dá)顯著降低[13-14]，提示炎癥因子及氧化應(yīng)激等不良刺激通過(guò)Notch/DLL4信號(hào)通路可能參與PE血管內(nèi)皮損傷的發(fā)生發(fā)展。

硫酸鎂作為預(yù)防及治療PE的臨床一線用藥，能夠通過(guò)減少患者體內(nèi)乙酰膽堿的釋放，松弛骨骼肌以預(yù)防子癇發(fā)作，然而臨床工作中發(fā)現(xiàn)單用硫酸鎂治療PE的療效并不理想，因此常常采用硫酸鎂與拉貝洛爾等其他減壓藥物進(jìn)行聯(lián)合治療。在本研究中我們通過(guò)觀察對(duì)比單用硫酸鎂與聯(lián)合應(yīng)用硫酸鎂與低分子肝素進(jìn)行治療的PE患者中胎盤組織DLL4的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，較正常妊娠的胎盤組織相比，PE患者中的DLL4表達(dá)顯著降低，而聯(lián)合使用硫酸鎂與低分子肝素治療的PE患者胎盤組織中DLL4的表達(dá)顯著增加，且DLL4主要定位于胎盤組織的內(nèi)皮細(xì)胞中。這提示低分子肝素對(duì)PE的治療可能與內(nèi)皮細(xì)胞中DLL4表達(dá)增加有關(guān)。ELISA檢測(cè)受試者血清中內(nèi)皮損傷相關(guān)細(xì)胞因子ET-1與sVCAM-1的表達(dá)顯示，PE患者中ET-1、sVCAM-1表達(dá)較正常妊娠孕產(chǎn)婦明顯增加，而聯(lián)合使用低分子肝素后PE患者中的上述細(xì)胞因子水平較單用硫酸鎂的患者明顯降低。ET-1、sVCAM-1是血管內(nèi)皮激活或損傷的標(biāo)志性細(xì)胞因子，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞損傷時(shí)其表達(dá)將顯著增加[23]。為進(jìn)一步明確低分子肝素是否通過(guò)DLL4對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用，本研究應(yīng)用PE患者血清刺激不同處理情況下的HUVEC，結(jié)果證實(shí)預(yù)先使用低分子肝素處理可顯著抑制PE血清對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的促凋亡作用，并改善PE血清對(duì)其通透性的影響，進(jìn)而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的完整性。最后Western blot結(jié)果表明，低分子肝素能夠通過(guò)促進(jìn)抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)，抑制促凋亡蛋白Bax、Cleaved caspase-3表達(dá)來(lái)改善PE血清對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，而使用Notch信號(hào)通路抑制劑MK-0752能顯著逆轉(zhuǎn)低分子肝素對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的上述影響，即降低抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)，而促進(jìn)Bax、Cleaved caspase-3表達(dá)。Bax是分布于細(xì)胞質(zhì)中的重要促凋亡蛋白，其在接受上游傳導(dǎo)的凋亡信號(hào)后被激活并發(fā)生分子構(gòu)象的改變，隨即進(jìn)入線粒體并破壞線粒體膜的完整性，其還可以與凋亡抑制蛋白Bcl-2相結(jié)合，對(duì)抗其抗凋亡作用。凋亡蛋白酶Caspase-3是各種凋亡途徑的樞紐分子，也是細(xì)胞凋亡的指示劑，它的激活表示細(xì)胞已進(jìn)入凋亡早期，并最終發(fā)生細(xì)胞死亡[24]。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用低分子肝素能夠通過(guò)促進(jìn)胎盤組織內(nèi)皮細(xì)胞中DLL4的表達(dá)，其可能通過(guò)Notch/DLL4信號(hào)通路抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，從而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的完整性。本研究從內(nèi)皮細(xì)胞損傷層面論證了低分子肝素在PE患者治療中的有效性，為臨床低分子肝素在臨床治療中的推廣提供新的依據(jù)。