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    黃韌帶肥厚動(dòng)物模型研究進(jìn)展△

    2021-04-17 17:36:54吳立康宋國強(qiáng)
    中國矯形外科雜志 2021年22期
    關(guān)鍵詞:動(dòng)物模型造模纖維細(xì)胞

    吳立康,陳 煜,宋國強(qiáng),許 鵬

    (1.常州大學(xué)藥學(xué)院醫(yī)學(xué)院,江蘇常州2131642;2.山東中醫(yī)藥大學(xué),山東濟(jì)南250355;3.海軍軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院脊柱二科,上海200003)

    黃韌帶連接各椎體,起保護(hù)脊髓神經(jīng)的作用。當(dāng)黃韌帶肥厚(ligamentum flavum hypertrophy,LFH)后,壓迫硬膜囊和神經(jīng)根導(dǎo)致患者出現(xiàn)下肢麻木或間歇性跛行的癥狀。建立可靠的動(dòng)物模型對黃韌帶肥厚的發(fā)病機(jī)制研究具有促進(jìn)作用,也可體內(nèi)驗(yàn)證新開發(fā)的治療方法。黃韌帶肥厚屬于慢性退變性疾病,造模耗時(shí)長且個(gè)體間差異大給實(shí)驗(yàn)研究增加難度[1]。近年來,國內(nèi)外關(guān)于黃韌帶肥厚動(dòng)物模型的制作方法多樣,本文總結(jié)這些制作方法的進(jìn)展,為進(jìn)一步研究提供思路。

    1 黃韌帶肥厚的變化

    影像學(xué)分析中,正常的黃韌帶組織厚度應(yīng)在4 mm以下,超過5 mm可判斷為黃韌帶肥厚。正常的黃韌帶是一種結(jié)締組織,主要由彈性纖維(80%)和膠原纖維(20%)組成。隨著黃韌帶的退變,組織肥大,表現(xiàn)為彈性纖維丟失和膠原纖維增多并沉積,具有纖維化病變的特征[2]。引起黃韌帶纖維化的原因復(fù)雜,小關(guān)節(jié)和椎間盤退變是最直接的因素。小關(guān)節(jié)退變導(dǎo)致椎間序列不穩(wěn)定,黃韌帶受到異常的機(jī)械應(yīng)力刺激[3]。長期的機(jī)械應(yīng)力刺激引發(fā)組織微損傷和慢性炎癥的產(chǎn)生,炎癥因子的釋放促使組織過度修復(fù)進(jìn)而產(chǎn)生纖維化。纖維化是黃韌帶肥厚的重要病理因素[4],如果不能有效控制纖維增生,則會(huì)導(dǎo)致結(jié)締組織在細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)大量沉積,成纖維細(xì)胞大量增殖,最終引起彈性纖維減少,膠原沉積增加。

    在黃韌帶肥厚的過程中,多種分子表達(dá)異常。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的表達(dá)增加,并刺激Ⅰ和Ⅲ型膠原的表達(dá)增加[5]。肥厚的黃韌帶組織中毛細(xì)血管明顯增多,血管生成素樣蛋白2和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子表達(dá)增加[6]。這些因素共同作用,促進(jìn)了成纖維細(xì)胞活化,最終引起黃韌帶肥厚[7]。

    2 動(dòng)物模型建立的方法

    近年來多個(gè)動(dòng)物模型模擬了黃韌帶肥厚的病理變化,考慮到經(jīng)濟(jì)成本及實(shí)驗(yàn)難度,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以實(shí)驗(yàn)兔和實(shí)驗(yàn)鼠為主,模型重復(fù)性好,且生理與解剖特征與人相似。

    相較于四足站立或俯臥態(tài),雙足站立姿勢會(huì)使脊柱承受的壓力增加,引起脊椎退變。有限元分析顯示,直立姿態(tài)下,腰椎黃韌帶韌帶受到的應(yīng)力明顯高于伸展?fàn)顟B(tài)。Zheng等[8]利用小鼠的恐水誘導(dǎo)它們采取兩足站立姿勢,將小鼠置于類似燒杯的空間,底部有水,每天站立6 h。并對站立姿態(tài)的小鼠進(jìn)行mi?cro-CT掃描,檢查脊柱的變化。造模10周后,對黃韌帶面積、彈力纖維/膠原纖維比值和細(xì)胞因子受體樣因子1(cytokine receptor like factor 1,CRLF1)的表達(dá)進(jìn)行定量。雙足站立使腰椎黃韌帶受力增加,引起黃韌帶肥厚。組織學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)組小鼠的黃韌帶中,彈性纖維減少,膠原纖維和纖維化因子表達(dá)增加。該團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn),CRLF1表達(dá)增加與黃韌帶肥厚具有重要關(guān)系,在CRLF1敲除的小鼠中,雙足站立實(shí)驗(yàn)組卻不會(huì)刺激肥厚。黃韌帶肥厚是慢性疾病,久坐和不良坐姿會(huì)很大程度提高黃韌帶肥厚的發(fā)病率。通過模擬人類站立的姿勢,可造成黃韌帶受到的擠壓或牽拉應(yīng)力增加。該方法使用的工具簡單,但雙足站立姿勢引起的應(yīng)力不夠明顯,造模效果有待驗(yàn)證,且樣本間個(gè)體差異較大。

    為了使黃韌帶受到的機(jī)械應(yīng)力增加,Sato等[9]人為的造成脊柱序列不穩(wěn),導(dǎo)致黃韌帶受到異常的應(yīng)力刺激,從而建立黃韌帶肥厚模型。具體做法為:大鼠腰部后路切開,摘除L5棘突、L4~6棘上韌帶、L4~5、L5~6棘間韌帶。使得大鼠腰椎第5節(jié)段與上下段之間的正常平衡被打破,在術(shù)后的活動(dòng)中,由于腰椎后方韌帶被摘除,黃韌帶受到的牽拉力大大增加。8周后處死取材。行EVG(Verhoeff's van Gieson)和Mas?son染色,模型組切片纖維排列規(guī)則變差,EVG染色顯示整體區(qū)域彈性纖維變少,Masson染色顯示膠原纖維增加,模型組黃韌帶發(fā)生纖維化。他們還發(fā)現(xiàn),纖維化在靠近橫突的背側(cè)區(qū)域更明顯。這說明黃韌帶的背側(cè)受到的刺激更明顯,在背側(cè)的韌帶更容易發(fā)生肥厚。

    Hayashi[10]用實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行黃韌帶肥厚造模,進(jìn)行L2~3和L4~5后外側(cè)植骨融合術(shù),并切除L3~4椎上肌。將機(jī)械應(yīng)力集中在L3~4水平,用來增加L3~4黃韌帶受到的應(yīng)力刺激。而進(jìn)行融合的L2~3和L4~5段的黃韌帶則減少受到的應(yīng)力刺激。術(shù)后16周,在機(jī)械應(yīng)力的刺激下,黃韌帶組織中彈力纖維斷裂,軟骨基質(zhì)增多,與腰椎管狹窄患者的肥大黃韌帶表現(xiàn)相似。該團(tuán)隊(duì)還用DNA芯片進(jìn)行篩選,實(shí)驗(yàn)組成纖維細(xì)胞生長因子9的表達(dá)增加,主要集中在黃韌帶末端或小關(guān)節(jié)周圍,這是黃韌帶退變肥厚的重要原因[11]。在李學(xué)朋[12]的研究中,雙醋瑞因能抑制肥厚黃韌帶中炎癥因子的表達(dá),改善纖維化。

    通常在黃韌帶肥厚的同時(shí)也伴隨一定程度的椎間盤退變。通過后入路切除或破壞脊椎后方肌肉導(dǎo)致黃韌帶受到的機(jī)械應(yīng)力增加容易導(dǎo)致黃韌帶肥厚,而退變的椎間盤導(dǎo)致椎體間序列變差,引起椎間序列不穩(wěn)也會(huì)引起黃韌帶肥厚。卜憲敏等[13]以新西蘭大白兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,通過頸椎前路穿刺破壞纖維環(huán)及抽吸C4/5髓核組織建立兔頸椎不穩(wěn)動(dòng)物模型。4周后,C4/5節(jié)段黃韌帶纖維排列變差,TGF-β1表達(dá)增加。

    采用切除椎體之間韌帶的方法可使黃韌帶受到的應(yīng)力刺激增加,但樣本間差異依舊較大。在動(dòng)物未處于行走活動(dòng)的時(shí)候,黃韌帶則不受異常的應(yīng)力刺激。為了使樣本受到的應(yīng)力刺激量化,減少樣本間差異,Saito[14]制作了一個(gè)可固定小鼠的裝置,裝置可電動(dòng)控制,往復(fù)彎曲并強(qiáng)迫小鼠進(jìn)行牽拉彎腰動(dòng)作,每日持續(xù)3 h。12周后,通過組織學(xué)分析,應(yīng)力牽拉裝置使小鼠黃韌帶增厚,膠原纖維面積,黃韌帶成纖維細(xì)胞數(shù)量和纖維化相關(guān)因子增加。但這種機(jī)械應(yīng)激模型并沒有觀察到巨噬細(xì)胞浸潤、血管增加和TGF-β表達(dá)增加,而這些變化是人黃韌帶肥厚的標(biāo)志性變化,該裝置并沒有完全模擬黃韌帶肥厚。

    巨噬細(xì)胞浸潤是黃韌帶肥厚的重要特征,慢性炎癥引起黃韌帶組織中的巨噬細(xì)胞增加,分泌大量炎癥因子和TGF-β1,刺激黃韌帶成纖維細(xì)胞增殖分化,最終引起黃韌帶肥厚。Saito團(tuán)隊(duì)[15]通過手術(shù)常規(guī)暴露小鼠椎體后棘突,鈍性分離椎旁肌,暴露黃韌帶。用30號針對黃韌帶背側(cè)進(jìn)行微損傷,常規(guī)縫合。微損傷導(dǎo)致組織內(nèi)巨噬細(xì)胞增加,黃韌帶表現(xiàn)為肥厚,巨噬細(xì)胞刺激膠原表達(dá)增加,而當(dāng)注射含有氯磷酸鹽的脂質(zhì)體清除巨噬細(xì)胞可抑制黃韌帶肥大。

    溶血磷酸脂酸(lysobisphosphatidic acids,LPA)的高表達(dá)可能與黃韌帶肥厚正相關(guān)。Zhou[16]將LPA吸附在明膠海綿中,選擇8周雄性SD大鼠,從腰椎L1~2棘突上方作縱向皮膚切口,分離椎旁肌。部分切除相鄰的棘上韌帶和棘間韌帶。用明膠海綿作為載體,負(fù)載LPA,插入后外側(cè)硬膜外和黃韌帶之間。LPA通過激活LPAR1-Akt信號通路顯著誘導(dǎo)黃韌帶成纖維細(xì)胞增殖和抑制凋亡,最終引起黃韌帶肥厚。

    黃韌帶的動(dòng)物模型目前還不算成熟,多種椎間盤退變動(dòng)物模型的造模思路也可能成為建立黃韌帶肥厚的方法。將小關(guān)節(jié)突切除引起脊柱不穩(wěn),從而導(dǎo)致應(yīng)力刺激增加,引起脊柱退變、小關(guān)節(jié)炎癥[17]。此方法實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物黃韌帶組織在應(yīng)力和炎癥反應(yīng)下引發(fā)退變,但作者并未進(jìn)行詳細(xì)評價(jià),且小關(guān)節(jié)切除時(shí)需把握好量,實(shí)際操作時(shí)容易直接損傷黃韌帶。TGF-β1是引起黃韌帶肥厚的重要因子[18],可采用重組TGF-β1蛋白刺激黃韌帶肥厚。這種方法可用于評估治療黃韌帶肥厚的治療方案,尤其是有關(guān)TGF-β1參與的信號通路。

    3 動(dòng)物模型的評價(jià)方法

    影像學(xué)檢測:采用MRI可最直觀的觀察黃韌帶的肥厚情況。也可應(yīng)用CT、X線片等對椎體等骨骼退變的觀察。

    動(dòng)物行為學(xué)觀察:黃韌帶肥厚造成腰椎管狹窄影響下肢行動(dòng)能力,在建立黃韌帶肥厚的動(dòng)物可進(jìn)行行為學(xué)觀察,如斜板停留實(shí)驗(yàn),BBB運(yùn)動(dòng)功能評分。

    分子檢測:對造模后的動(dòng)物取材,收集黃韌帶樣本。通過PCR或WB分析多種黃韌帶肥厚標(biāo)志物的表達(dá),如TGF-β1,ColⅠ和Ⅲ等。但這種方法不適用于大鼠或小鼠,由于鼠的脊柱結(jié)構(gòu)較小,其黃韌帶的體積也很小,檢測結(jié)果不夠穩(wěn)定。

    組織切片染色:在取材時(shí),很難完整的直接分離出黃韌帶,一般將整個(gè)脊柱節(jié)段保留。進(jìn)行組織切片檢查。為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確性,應(yīng)取相同節(jié)段,盡可能選擇相似的位置進(jìn)行切片。除了HE染色,還可以選擇EVG染色天狼猩紅(sirius red)染色和Masson染色。其中EVG染色是將彈性纖維染成藍(lán)黑色,將膠原纖維染成紅色,天狼猩紅染色將膠原纖維染成紅色,Masson是將膠原纖維染成藍(lán)色。用軟件對樣本間染色面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì),比較彈性纖維/膠原纖維的比值。此外,切片后還可對ColⅠ、TGF-β1等黃韌帶標(biāo)志物免疫組化分析。

    建立黃韌帶肥厚動(dòng)物模型的目的在于模擬人類黃韌帶退變肥厚的組織、細(xì)胞及分子變化,用于研究黃韌帶肥厚的發(fā)生機(jī)制。也可以對體外研究的內(nèi)容在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證,評價(jià)其在組織整體微環(huán)境下的適用情況。在上述的黃韌帶肥厚動(dòng)物模型中,利用黃韌帶受到異常應(yīng)力刺激,損傷或其他刺激以引起炎癥反應(yīng),從而引起動(dòng)物的黃韌帶肥厚。但也存在一定的問題:(1)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定;(2)難以全面的模擬人黃韌帶退變肥厚的機(jī)制;(3)造模時(shí)間長,難度大。黃韌帶肥厚的動(dòng)物模型建立還處于初步探索階段,黃韌帶肥厚的體內(nèi)研究亟需一個(gè)穩(wěn)定且高效的動(dòng)物模型。

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