蛋白質(zhì)力學(xué)穩(wěn)定性的測定方法在食品領(lǐng)域的研究進(jìn)展

吳琪，儀淑敏*，李學(xué)鵬，謝晶，季廣仁，勵(lì)建榮

1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心（錦州 121013）；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院（上海 201306）；3.錦州筆架山食品有限公司（錦州 121000）

隨著現(xiàn)代檢測技術(shù)的蓬勃發(fā)展，越來越多的測定方法被應(yīng)用于食品工業(yè)。食品中蛋白質(zhì)力學(xué)穩(wěn)定性的測定方法有多種，該文主要介紹了熱分析技術(shù)、單分子技術(shù)、流變技術(shù)、質(zhì)構(gòu)分析。

熱分析技術(shù)可以測定蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的熱效應(yīng)，得到蛋白質(zhì)折疊或解折疊過程中的熱力學(xué)參數(shù)，可以定量測定熱誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分子內(nèi)作用力的變化[1]。研究蛋白質(zhì)熱力學(xué)穩(wěn)定性主要采用差示掃描量熱法和等溫滴定量熱法測得熱力學(xué)參數(shù)，二者最大的區(qū)別在于差示掃描量熱法的升溫程序可以檢測蛋白熱膠凝化過程熱焓的變化，而等溫滴定量熱法只能在恒溫下測定蛋白凝膠的反應(yīng)熱。熱力學(xué)參數(shù)的測定能獲得提高食品熱穩(wěn)定性的最大限度，為評估食品穩(wěn)定性和優(yōu)化產(chǎn)品加工保藏工藝提供判定依據(jù)。

單分子技術(shù)是基于單分子層面上的操作，原子力顯微鏡力譜技術(shù)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)均能用于表征蛋白質(zhì)分子內(nèi)的構(gòu)象變化[2]。

流變技術(shù)分析了蛋白質(zhì)的黏彈特性，在熱剪切的作用下，表征剪切速率與黏度的關(guān)系[3]。常見的流變學(xué)技術(shù)方法包括了流變儀分析法和微流變分析儀法。兩者有所不同，流變技術(shù)是對蛋白溶液進(jìn)行熱剪切得到應(yīng)力-應(yīng)變關(guān)系，而微流變技術(shù)用布朗熱運(yùn)動和粒子運(yùn)動面積表征應(yīng)力和應(yīng)變。

質(zhì)構(gòu)分析測定了蛋白凝膠強(qiáng)度，反映的是與蛋白質(zhì)力學(xué)特性有關(guān)的食品質(zhì)地特性。

該文綜述了食品中蛋白質(zhì)力學(xué)穩(wěn)定性的測定方法，以期為評估食品質(zhì)量提供參數(shù)依據(jù)，為優(yōu)化食品產(chǎn)品設(shè)計(jì)提供技術(shù)參考。

1 熱分析技術(shù)

1.1 差示掃描量熱法

差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）是一種高靈敏度的非擾動技術(shù)，用于研究熱誘導(dǎo)相變的熱力學(xué)性質(zhì)，并得到蛋白質(zhì)折疊或解折疊過程中的熱力學(xué)參數(shù)，包括起始溫度（Tonset）、熔融轉(zhuǎn)變溫度（Tm）、量熱焓（ΔHcal）、復(fù)性指數(shù)（RI）[4]。Tonset是熱誘導(dǎo)蛋白質(zhì)解折疊的起始溫度，Tm是轉(zhuǎn)變最大值，ΔHcal是DSC曲線中的面積，Tm和Tonset值越高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性越好[5]。DSC測量了溶液溫度升高所需的能量，從而提供有關(guān)熱誘導(dǎo)蛋白質(zhì)解折疊過程中結(jié)構(gòu)變化的信息[6]。

蛋白質(zhì)的DSC峰表明不同的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域在不同的溫度下展開，用差示掃描量熱儀測定豬肉肌原纖維蛋白-明膠混合物熱變性溫度，豬肉肌原纖維蛋白在57.22 ℃和68.64 ℃出現(xiàn)兩個(gè)明顯的吸熱峰，分別為肌球蛋白和肌動蛋白的熱變性溫度，明膠的加入使肌球蛋白的變性溫度降低[7]。近期研究中，研究了冷等離子體（CAP）對阿拉斯加鱈魚肌原纖維蛋白變性溫度的影響，使用差示掃描量熱儀測定肌原纖維蛋白的變性溫度，高壓下經(jīng)CAP處理后肌原纖維蛋白的變性溫度顯著升高，熱穩(wěn)定性提高，而低壓會破壞肌原纖維蛋白的穩(wěn)定性，導(dǎo)致分子間作用力減弱和肌原纖維蛋白聚集[8]。

1.2 等溫滴定量熱法

等溫滴定量熱法（isothermal titration calorimetry，ITC）是直接檢測兩種溶液相互作用過程的熱效應(yīng)，獲得分子相互作用過程中的結(jié)合常數(shù)（Kd）、結(jié)合計(jì)量比（N）、焓變（ΔH）、熵變（ΔS）等熱力學(xué)參數(shù)的一種實(shí)驗(yàn)方法[9]，其中Kd和N乘積越小，相互作用越弱，需要加大反應(yīng)物濃度[10]。根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)計(jì)算出吉布斯自由能ΔG=ΔH-TΔS（ΔH＞0反應(yīng)吸熱，ΔH＜0反應(yīng)放熱），T是絕對溫度[11]。

1999年，Michael等[12]提出了ITC可用于定量測量蛋白質(zhì)間相互作用的熱力學(xué)性質(zhì)，通過確定配體與其結(jié)合伴侶締合時(shí)產(chǎn)生的熱量直接測量結(jié)合平衡。隨后，基于等溫滴定量熱法進(jìn)行熱力學(xué)分析，有學(xué)者研究了有序單體蛋白質(zhì)與內(nèi)在無序蛋白質(zhì)（IDP）在折疊中的相互作用，ITC測量的等溫線顯示了室溫附近的焓從吸熱轉(zhuǎn)變?yōu)榉艧幔砻髁藛误w蛋白質(zhì)與IDP結(jié)合產(chǎn)生了疏水效應(yīng)[13]。采用ITC測得T=298 K，pH 7.4條件下比辛和乳清蛋白之間的結(jié)合能，將比辛滴定到乳清中得到吸附等溫線，ΔH的值為負(fù)，而ΔS的值為正，表明熵和焓有助于結(jié)合過程，由ΔG=ΔH-TΔS得出ΔG＜0，表明比辛與乳清蛋白的結(jié)合具有自發(fā)性，疏水作用起主要作用[14]。

2 單分子技術(shù)

2.1 原子力顯微鏡力譜技術(shù)

原子力顯微鏡力譜技術(shù)（atomic force microscope single molecule force，AFM-SMF）可以對單個(gè)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行拉伸和松弛，還可以對具有代表性的單蛋白進(jìn)行機(jī)械展開，直接表征蛋白單體特定的折疊和復(fù)性[15]。

1986年，原子力顯微鏡（AFM）被發(fā)明，并開始應(yīng)用于在原子尺度上觀察非均勻生物樣品的形態(tài)和結(jié)構(gòu)[16]。近年來，在傳統(tǒng)的AFM基礎(chǔ)上結(jié)合了單分子力譜技術(shù)（SMF），通過持續(xù)測量蛋白質(zhì)中高能構(gòu)象提供了有關(guān)蛋白質(zhì)折疊途徑、動力學(xué)特性、相互作用和錯(cuò)誤折疊的豐富信息[17]。迄今為止，AFM-SMF在理解糖、DNA和蛋白質(zhì)的力學(xué)性質(zhì)和力誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)重排方面取得了許多突破[18]。

根據(jù)力譜測量的定量特性確定打開蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和破壞單個(gè)受體或配體鍵所需力的值，從而在單分子層面得到蛋白質(zhì)力學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的關(guān)系[19]。原子力顯微鏡用于蛋白質(zhì)聚集的單分子表征，在蛋白質(zhì)聚集初期，溶液中主要存在蛋白單體和寡聚體，AFM成像能夠顯示蛋白質(zhì)聚集過程中存在的最小單體和寡聚體，并在納米尺度上測量其形貌[20]。原子力顯微鏡還可以用來研究用單個(gè)肽分子在底物上的去折疊過程，對單個(gè)肽分子進(jìn)行拉伸，得到不連續(xù)的張力曲線，造成不連續(xù)性的原因是α-螺旋中部分氫鍵斷裂[21]。

2.2 單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)

單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（single molecule fluorescence resonance energy transfer，SM-FRET）用于研究DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子的構(gòu)象變化[22]。此技術(shù)是將單個(gè)蛋白分子上熒光供體和受體作為標(biāo)記位點(diǎn)，定量測量供體和受體之間熒光光強(qiáng)及二者間的共振能量轉(zhuǎn)移效率，得到熒光光強(qiáng)隨時(shí)間變化的軌跡，再擬合出標(biāo)記位點(diǎn)之間的距離，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得到動力學(xué)數(shù)據(jù)[23]。

每種技術(shù)都有其自身的局限性，smFRET也不例外，smFRET的時(shí)間分辨極限大約是1 ms，因此，使用該技術(shù)探測蛋白質(zhì)構(gòu)象時(shí)，需要在毫秒級的時(shí)間分辨率上進(jìn)行動力學(xué)測量[24]。1996年，單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)被發(fā)現(xiàn)，并用于研究兩個(gè)單分子間的相互作用[25]。1999年，首次使用smFRET測得單一蛋白能量傳遞效率（E＞0.9）[26]。目前smFRET已經(jīng)被應(yīng)用于許多不同蛋白質(zhì)系統(tǒng)中蛋白質(zhì)分子內(nèi)構(gòu)象變化的研究，例如，利用smFRET實(shí)現(xiàn)在脂質(zhì)環(huán)境下對蛇形蛋白Ykt6的亞毫秒構(gòu)象動力學(xué)測量，Ykt6與十二烷基磷酸膽堿（DPC）結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，Ykt6在其蛋白結(jié)構(gòu)域與陷阱核的界面處發(fā)生了構(gòu)象變化，說明脂質(zhì)環(huán)境下蛋白質(zhì)-脂質(zhì)的相互作用[27]。

3 流變技術(shù)

3.1 流變儀分析法

流變測量分為動態(tài)測量和靜態(tài)測量，蛋白質(zhì)的黏彈性采用動態(tài)測量測定儲能模量（G’）、損耗模量（G’’）和黏度（η），而靜態(tài)測量測定食品中蛋白質(zhì)的蠕變和應(yīng)力松弛，主要應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域[28]。

對添加天然淀粉和改性淀粉的肌原纖維蛋白（MP）進(jìn)行溫度掃描動態(tài)流變試驗(yàn)，淀粉-肌原纖維蛋白復(fù)合物溶膠在熱膠凝化過程中的彈性取決于G’，添加淀粉后MP凝膠的G’顯著增加，G’與淀粉的糊化溫度呈反比[29]。以肌原纖維蛋白（MP）和橄欖油為原料，在NaCl溶液中用MP或非肉蛋白預(yù)乳化，在pH 6.2下制備熱誘導(dǎo)復(fù)合凝膠，用流變儀研究不同的非肉蛋白（大豆分離蛋白、蛋清分離蛋白和酪蛋白酸鈉）預(yù)乳化液對MP凝膠流變性能的影響，結(jié)果為所有乳液組均顯著提高了MP凝膠的G’，表明非肉蛋白作為乳化劑修飾MP凝膠的潛力和粉碎肉制品的組織特性[30]。

3.2 微流變分析儀法

與傳統(tǒng)流變學(xué)方法相比，微流變學(xué)方法的優(yōu)點(diǎn)是不存在干擾表面效應(yīng)[31]。微流變分析儀基于擴(kuò)散波光譜學(xué)（DWS）技術(shù)測量顆粒位移進(jìn)而分析流體的黏彈特性，通過監(jiān)測蛋白質(zhì)分子的均方位移（MSD）實(shí)現(xiàn)在無干擾、無破壞的情況下對蛋白質(zhì)凝膠的測量，從而從微觀結(jié)構(gòu)的角度對蛋白質(zhì)凝膠的黏彈特性進(jìn)行定量分析[32]。這項(xiàng)技術(shù)使用多散斑擴(kuò)散光譜（MSDWS）檢測出散斑圖像，并繪制去相關(guān)時(shí)間tdec-MSD曲線，去相關(guān)時(shí)間（tdec）是測量時(shí)間，并用廣義斯托克斯-愛因斯坦擴(kuò)散關(guān)系計(jì)算存儲模量（G’）和損耗模量（G’’）[33]。

使用示蹤粒子和動態(tài)光散射技術(shù)來監(jiān)測嵌入蛋白質(zhì)溶液中的示蹤粒子的布朗運(yùn)動，可以獲得樣品的零剪切黏度[34]。將粒子示蹤微流變學(xué)與宏觀流變學(xué)方法相結(jié)合，研究大豆分離蛋白（SPI）溶液及其穩(wěn)定的乳液酸化過程流變性質(zhì)的變化，SPI溶液經(jīng)歷了溶液（G’’＞G’）-凝膠（G’＞G’’）-解凝（G’’＞G’）的過程，MSD先增大后減小，結(jié)果說明了SPI溶液在酸化過程中，蛋白質(zhì)產(chǎn)生聚集，后期未完全解聚[35]。

4 質(zhì)構(gòu)分析

質(zhì)構(gòu)分析（texture Profile Analysis，TPA）模擬測定食品物料單次或多次咀嚼過程中的感官參數(shù)，測試結(jié)果反映的是食品質(zhì)構(gòu)特性，包括硬度、脆性、黏性、內(nèi)聚性、彈性、膠黏性、咀嚼性、回復(fù)性等[36]。

蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)特性與肉制品的感官特性、理化性質(zhì)和加工特性密切相關(guān)。硬度和彈性是衡量質(zhì)構(gòu)特性的兩個(gè)重要的力學(xué)指標(biāo)，直接影響肉制品的質(zhì)量。經(jīng)超細(xì)粉碎處理，雞胸肉肌纖維蛋白膠凝硬度顯著增加，彈性提高，具有更好的凝膠性能[37]。質(zhì)構(gòu)分析可以設(shè)計(jì)具有特定質(zhì)地特性的食品結(jié)構(gòu)，以便尋求更多的替代性蛋白質(zhì)來源。在酪蛋白調(diào)整乳清蛋白凝膠結(jié)構(gòu)特性的研究中，酪蛋白的加入改善了乳清蛋白凝膠結(jié)構(gòu)，使其黏聚性增強(qiáng)，硬度和斷裂度降低，保水性得以保持[38]。質(zhì)構(gòu)分析還可以評估加工過程中蛋白質(zhì)的氧化損傷。使用質(zhì)構(gòu)儀測定即食雞肉餅在烹調(diào)、冷藏、微波加熱過程中的硬度，結(jié)論是烤制后的雞肉餅先冷凍再加熱硬度顯著下降，表明了肉類蛋白質(zhì)的氧化損傷在很大程度上影響了經(jīng)過嚴(yán)格加工的肉類產(chǎn)品的蛋白質(zhì)質(zhì)量、營養(yǎng)價(jià)值和質(zhì)地特性[39]。

5 結(jié)語與展望

在食品領(lǐng)域中，蛋白質(zhì)力學(xué)穩(wěn)定性的測定有助于探究其物理性質(zhì)，并通過定性測量和定量分析得到可靠的數(shù)據(jù)依據(jù)。蛋白質(zhì)力學(xué)穩(wěn)定性的測定方法可以有效地判定外界環(huán)境變化對蛋白質(zhì)分子內(nèi)作用力的影響，以及施加外力時(shí)蛋白質(zhì)分子間的作用力變化。但這些測定蛋白質(zhì)力學(xué)穩(wěn)定性的技術(shù)存在著局限性，同一個(gè)技術(shù)指標(biāo)采用不同研究手段會存在差異，需要多種技術(shù)的聯(lián)用得到更全面、更準(zhǔn)確的力學(xué)指標(biāo)。