葉際微生物及與植物互作的研究進(jìn)展*

楊 寬，王慧玲，葉坤浩，王 佩，孟廣云，羅 成，郭力維

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201)

葉際 (phyllosphere) 于1955 年由LAST 首次提出，他認(rèn)為：和植物的根和根際類(lèi)似，植物的葉子也有“葉際”[1]；而后RUINEN 將葉際定義為“作為微生物生長(zhǎng)環(huán)境的葉子外表面”，葉際的概念逐漸被人接受[2]。1981 年英國(guó)學(xué)者BLAKEMAN首次提出了葉面微生物的概念，他指出：附生或寄生在植物葉片表面的微生物稱(chēng)為“葉面微生物 (phylloplane microorganism)”[3]，自此研究植物葉面上的微生物有了專(zhuān)業(yè)的術(shù)語(yǔ)，并受到了研究者的廣泛關(guān)注，眾多學(xué)者對(duì)葉面微生物的種類(lèi)、分布和功能等特點(diǎn)做了深入研究[4-6]。除了葉面上的微生物，植物的地上部分，包括莖、花、果等組織表面也包含大量的微生物。隨著研究的深入，LINDOW 等[7-8]對(duì)葉際的概念作了進(jìn)一步的闡釋?zhuān)麄儗⑽⑸锒ㄖ车闹参锏厣喜糠址Q(chēng)為葉際 (phyllosphere)，而生活在葉際的“居民”稱(chēng)為附生微生物 (epiphytes)，并首次提出了葉際微生物學(xué) (phyllosphere microbiology)。對(duì)于葉際微生物的研究，眾多學(xué)者集中在植物組織表面的生境，且以葉面為主，所以近年來(lái)某些學(xué)者直接將葉際定義為“提供適合某些微生物生存環(huán)境的整個(gè)植物地上部分外表面”[9-10]。據(jù)估計(jì)，全球植物地上部分總表面積約為109km2(大部分為葉表面)[11]，同時(shí)在植物葉際生長(zhǎng)著大量的微生物，包括細(xì)菌、酵母菌、絲狀真菌、古細(xì)菌和藻類(lèi)等[7,12]，其中以細(xì)菌的豐度最高，平均每平方厘米葉片表面約有106～107個(gè)細(xì)菌細(xì)胞[11]，這些生活在葉際上的微生物稱(chēng)為葉際微生物(phyllosphere microorganisms)。

對(duì)于葉際微生物來(lái)說(shuō)，葉際環(huán)境是一個(gè)非常苛刻且不穩(wěn)定的生境，生活在葉表的微生物經(jīng)常要面臨水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不足，以及劇烈變化的強(qiáng)光、高溫和高紫外線(xiàn)等的影響。除了要應(yīng)對(duì)環(huán)境變化，葉際微生物還會(huì)遇到植物或其他微生物產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)，同時(shí)也會(huì)受到植物防御反應(yīng)的影響[13-15]。經(jīng)過(guò)層層“篩選”，最終能夠適應(yīng)葉際環(huán)境的微生物生存了下來(lái)，并在與植物長(zhǎng)期的“互作交流”過(guò)程中逐漸形成了正面、負(fù)面或共生的關(guān)系。葉際微生物是一個(gè)非常龐大且多樣性豐富的群體，主要以細(xì)菌群落為主[10]。葉際細(xì)菌群體通常比根際或土壤中的種類(lèi)要少，與土壤中的固氮菌一樣，葉際細(xì)菌中的固氮菌也可以通過(guò)固氮作用在養(yǎng)分循環(huán)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如促進(jìn)植物生長(zhǎng)等[16]。除了可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)，某些葉際微生物還可以通過(guò)養(yǎng)分競(jìng)爭(zhēng)和拮抗作用等機(jī)制來(lái)抑制植物病原菌的生長(zhǎng)，相反葉部植物病原菌的積累也會(huì)使植物發(fā)病[17-18]。因此，葉際微生物、葉際環(huán)境和宿主植物三者所構(gòu)成的微生態(tài)平衡對(duì)植物的健康生長(zhǎng)具有重要意義，這也使得葉際微生物與宿主植物間的互作關(guān)系成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)之一。潘建剛等[19]在2011 年綜述了葉際微生物的研究方法、生物多樣性、生態(tài)功能和生態(tài)效應(yīng)等，但隨著分子技術(shù)的發(fā)展，目前關(guān)于葉際微生物的研究方法已經(jīng)引入了高通量測(cè)序等技術(shù)方法；高爽等[20]概述了葉際微生物的組成以及與外界環(huán)境的互作關(guān)系。為了更好地了解和應(yīng)用葉際微生物，基于前人的研究基礎(chǔ)，本研究主要針對(duì)葉際微生物的分離鑒定方法、群落特征以及和宿主的互作關(guān)系等幾個(gè)方面綜述國(guó)內(nèi)外的最新研究進(jìn)展，展望葉際微生物的研究方向和應(yīng)用前景。

1 葉際微生物的分離鑒定

1.1 葉際微生物的分離

對(duì)葉際微生物進(jìn)行科學(xué)研究，首先需要對(duì)葉際微生物進(jìn)行有效的分離，并且針對(duì)植物的不同部位需要應(yīng)用不同的分離方法。針對(duì)葉表面的微生物，目前用得較多的是洗脫法，主要運(yùn)用洗脫液結(jié)合超聲波和搖床震蕩的方法將葉表微生物進(jìn)行分離[21]。對(duì)于葉內(nèi)的微生物，用得較多的則是勻漿法，首先將葉表面進(jìn)行消毒處理，除去葉表微生物，用緩沖液進(jìn)行研磨勻漿，之后進(jìn)行涂平板分離或提取DNA 進(jìn)行下一步的測(cè)序鑒定[22]。對(duì)于洗脫液的選擇，主要有磷酸緩沖液、TE 緩沖液和無(wú)菌生理鹽水等，不同洗脫液對(duì)于不同植物葉際微生物的洗脫效果沒(méi)有統(tǒng)一的結(jié)論，但不同植物的不同部位、不同生長(zhǎng)期和采樣量則對(duì)微生物的洗脫有很大影響[23-25]。周育等[23]以菜豆葉子為試驗(yàn)材料，比較了不同洗脫液(無(wú)菌水和磷酸緩沖液)對(duì)葉際微生物的提取效果，發(fā)現(xiàn)2 種洗脫液的洗脫效果沒(méi)有顯著差別，并且在一定生長(zhǎng)期內(nèi)葉際微生物數(shù)量會(huì)隨著葉齡的增大而增多。

1.2 葉際微生物的鑒定

傳統(tǒng)的鑒定方法包括使用顯微技術(shù)觀察葉際微生物的顯微特征進(jìn)行分類(lèi)[26]，或使用選擇性培養(yǎng)基以及純培養(yǎng)的方法通過(guò)菌落形態(tài)特征或多種生理生化性狀進(jìn)行鑒定[27-29]。但這些方法通常具有鑒定模糊和分類(lèi)不精準(zhǔn)的問(wèn)題，并且對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的經(jīng)驗(yàn)性要求很高。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及微生物DNA 條形碼的發(fā)現(xiàn)，越來(lái)越多的研究人員選擇使用分子生物學(xué)的方法對(duì)微生物進(jìn)行鑒定，最簡(jiǎn)單的是利用真菌ITS 序列和細(xì)菌16S rRNA 基因序列對(duì)分離獲得的純培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定[30]。隨著環(huán)境微生物研究的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)自然環(huán)境中大多數(shù)微生物是不可培養(yǎng)的，能夠人工分離并獲得純培養(yǎng)的只占很小一部分[31]，大概只有0.1%～3%的環(huán)境細(xì)菌被認(rèn)為是可培養(yǎng)的[32]，所以通過(guò)傳統(tǒng)的分離鑒定方法無(wú)法展示葉際微生物群落的全貌。為了研究環(huán)境微生物多樣性，人們基于現(xiàn)代生化技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)明了磷酸脂肪酸(phospholipid fatty acid，PLFA) 譜圖分析技術(shù)、末端限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(terminal restriction fragment length polymorphism，TRFLP)分析技術(shù)、變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis，DGGE) 技術(shù)和高通量測(cè)序(high-throughput sequencing)技術(shù)等。

PLFA 譜圖分析技術(shù)是基于脂肪酸可作為生物標(biāo)記物而發(fā)展起來(lái)的分析技術(shù)，通過(guò)分析微生物細(xì)胞膜上磷酸脂肪酸的組分來(lái)鑒定微生物的種屬[33]。LV 等[34]通過(guò)PLFA 技術(shù)探究了外源添加細(xì)菌信號(hào)分子N-(3-oxohexanoyl) homoserine lactone 對(duì)煙葉葉際細(xì)菌群落的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)用1 mmol/L 處理后，革蘭氏陽(yáng)性菌(GP)的比例增加，當(dāng)用10 mmol/L 處理后，其比例有所下降。谷立坤等[35]利用PLFA 非培養(yǎng)方法解析了北京地區(qū)甘薯葉際細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有檢測(cè)樣品中，革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌生物量均高于革蘭氏陰性細(xì)菌生物量，甘薯葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受到時(shí)空因素和甘薯生理特性的影響，不同地點(diǎn)和不同生長(zhǎng)季節(jié)甘薯葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有較大差異。PLFA分析技術(shù)適合用于檢測(cè)環(huán)境中微生物群落的整體動(dòng)態(tài)變化。

T-RFLP 分析技術(shù)是一種全面、分辨率高、重現(xiàn)性良好的分子指紋圖譜技術(shù)，它結(jié)合了PCR技術(shù)、熒光標(biāo)記技術(shù)、DNA 限制性酶切技術(shù)和DNA 序列自動(dòng)分析技術(shù)，適合對(duì)來(lái)自土壤、水體和葉際等環(huán)境的微生物多樣性進(jìn)行研究[36]。PE?UELAS 等[37]運(yùn)用T-RFLP 技術(shù)研究了地中海森林優(yōu)勢(shì)樹(shù)種冬青櫟(Quercus ilex)葉際細(xì)菌和真菌的豐富度、多樣性和均勻度的變化，結(jié)果表明：氣候變化會(huì)顯著改變?nèi)~際微生物的豐度和組成。T-RFLP 技術(shù)可以反映環(huán)境樣品中微生物豐富度和均勻度隨時(shí)間的變化，微生物豐富度和均勻度可以反映環(huán)境選擇壓力。

DGGE 技術(shù)是由FISCHER 和LERMAN 在1979 年發(fā)明并將其運(yùn)用在醫(yī)學(xué)上基因點(diǎn)突變的檢測(cè)技術(shù)[38]。1993 年MUZYER 等[39]首次將DGGE技術(shù)應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)研究。由于DGGE 具有可靠性強(qiáng)、重現(xiàn)性高和方便快捷等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)微生物[40]、食品微生物[41]、環(huán)境土壤微生物[42]和根際微生物[43]等的研究。IZHAKI 等[44]通過(guò)DGGE 技術(shù)對(duì)3 種植物(巴旦杏、葡萄柚和粉藍(lán)煙草)的葉際細(xì)菌組成進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)葉際細(xì)菌組成差異種間大于種內(nèi)，且葡萄柚具有最高的葉際細(xì)菌多樣性和豐富度，表明植物種類(lèi)是影響葉表細(xì)菌群落組成的主要因素。

高通量測(cè)序技術(shù)又稱(chēng)下一代測(cè)序(next generation sequencing，NGS)或二代測(cè)序技術(shù)，是相對(duì)于傳統(tǒng)的一代桑格測(cè)序(Sanger sequencing)而言的。高通量測(cè)序技術(shù)可以1 次對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條堿基序列進(jìn)行測(cè)序，具有通量高、信息量大和操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，可以為測(cè)序?qū)ο筇峁┴S富的遺傳學(xué)信息。對(duì)于研究環(huán)境微生物多樣性而言，高通量測(cè)序可以提供更加全面和精準(zhǔn)的微生物分類(lèi)信息，加上近年來(lái)測(cè)序成本越來(lái)越低，更多的研究人員選擇高通量測(cè)序技術(shù)來(lái)研究葉際微生物的多樣性。LAFOREST-LAPOINTE 等[45]基于16S rRNA 基因高通量測(cè)序研究了加拿大魁北克溫帶森林中5 種主要樹(shù)種葉際細(xì)菌群落的組成和影響因素，發(fā)現(xiàn)樹(shù)種的木材密度、葉片含氮量以及氣候變量(夏季平均氣溫和降水量)與葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，并證明了寄主種類(lèi)是影響溫帶樹(shù)木葉際細(xì)菌群落構(gòu)成最重要的因素。孫泓等[46]運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同生境中桂花和夾竹桃葉際細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了探究，結(jié)果表明：來(lái)自3 處生境的2 種植物葉際細(xì)菌多樣性無(wú)顯著差異，植物種類(lèi)、生境及二者的交互作用可以顯著影響葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

2 葉際微生物的多樣性

2.1 葉際微生物的來(lái)源

葉際微生物的最初來(lái)源是多樣的。研究表明：葉際上的絲狀真菌、酵母菌和細(xì)菌等可以通過(guò)昆蟲(chóng)、空氣、種子甚至是動(dòng)物體傳播到達(dá)植物葉子表面[47-48]。來(lái)自一年生植物的種子以及上一代植物殘?bào)w中的微生物也可能是下一代植物葉際微生物的重要來(lái)源，因?yàn)閬?lái)自種子和植物殘?bào)w上的微生物是已經(jīng)適應(yīng)了葉際環(huán)境而存活下來(lái)的[49]。有學(xué)者研究表明：種子或根部的微生物可以進(jìn)入根內(nèi)部成為根內(nèi)生菌，然后通過(guò)植物的脈管系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到植物的地上部分，從而成為葉內(nèi)生菌[50]，同時(shí)生活在葉子表面的微生物也可以直接進(jìn)入葉子內(nèi)部成為葉內(nèi)生菌，葉面微生物和葉內(nèi)生菌都是葉際微生物的一部分[51]。葉際微生物的來(lái)源是多方面的，總體來(lái)源于周?chē)h(huán)境和上一代的“垂直遺傳”。

2.2 葉際微生物的構(gòu)成

葉際微生物的組成種類(lèi)復(fù)雜多樣，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的有細(xì)菌、酵母菌、絲狀真菌、藻類(lèi)、線(xiàn)蟲(chóng)和一些原生動(dòng)物等，總體以細(xì)菌的數(shù)量和種類(lèi)最多[7]。IZHAKI 等[44]在葡萄柚葉片上鑒定出32 種葉際細(xì)菌；劉利玲等[21]在青楊葉片上鑒定出35 科50 屬葉際細(xì)菌和25 科44 屬葉際真菌。葉際微生物的組成是菌群競(jìng)爭(zhēng)、氣候選擇和寄主選擇后的綜合結(jié)果。

葉際細(xì)菌在葉際環(huán)境中的數(shù)量非常龐大，平均每平方厘米葉片表面可以定殖106～107個(gè)細(xì)菌細(xì)胞，占據(jù)了葉際微生物群落中的主要地位[11]。一直以來(lái)，有關(guān)葉際微生物的研究大多集中在葉際細(xì)菌的研究[27,52]。葉面上的細(xì)菌通常不以單細(xì)胞的形式存在，而是趨向于聚集在一起“生活”，并且喜歡聚集在葉面的褶皺凹陷處，這可能與水分的利用有關(guān)[53]。葉際細(xì)菌群落比根際和土壤中的細(xì)菌多樣性要低，這主要是由于葉子壽命通常較短，葉際環(huán)境條件惡劣，而植物的根際則被土壤包圍，生活在土壤中的微生物可以存活多年[11]。植物葉片上葉際細(xì)菌群落的構(gòu)成受植物種類(lèi)、氣候條件和植株生理狀態(tài)所影響。LAFOREST-LAPOINTE 等[45]探究了影響樹(shù)木葉面細(xì)菌群落組成的不同驅(qū)動(dòng)因素，對(duì)不同地點(diǎn)的5 種不同樹(shù)種在不同時(shí)間點(diǎn)的葉片樣品進(jìn)行高通量測(cè)序鑒定其葉面細(xì)菌微生物，并且對(duì)不同驅(qū)動(dòng)因素進(jìn)行評(píng)估量化，結(jié)果表明：影響葉際細(xì)菌組成的因素中寄主種類(lèi)占27%，地理位置占11%，取樣時(shí)間占1%。JACKSON 等[54]研究了廣玉蘭葉面細(xì)菌群落的年際和季節(jié)變化，結(jié)果表明：所有樣品的葉際微生物菌群均以α-變形菌(Alphaproteobacteria)為主，另外屬于廣玉蘭葉際微生物主要組成部分的擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)和放線(xiàn)桿菌門(mén)(Actinobacteria)中的某些代表菌種在不同時(shí)間點(diǎn)采集的樣品中的豐度具有顯著性差異，說(shuō)明廣玉蘭葉際微生物群落組成具有季節(jié)性變化。在眾多的葉際細(xì)菌類(lèi)群中，α-變形菌(Alphaproteobacteria) 和γ-變形菌(Gammaproteobacteria)是一類(lèi)很具有代表性的類(lèi)群，在葉際環(huán)境中扮演著許多重要的生態(tài)“角色”[54-55]。另外，屬于變形菌門(mén)(Proteobacteria)的微生物菌群還具有豐富的代謝多樣性，在葉際細(xì)菌群體中具有甲基營(yíng)養(yǎng)、硝化、固氮和不產(chǎn)氧光合作用等多種功能[56-58]。除了變形菌門(mén)(Proteobacteria)，擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes) 和放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)的微生物都在葉際環(huán)境中執(zhí)行著不同的生態(tài)功能，同時(shí)這2 個(gè)群體在根際環(huán)境中也具有很好的代表性[59-60]。葉際細(xì)菌群體中還包括放線(xiàn)菌門(mén)微生物，放線(xiàn)菌是原核生物中的一個(gè)類(lèi)群，為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，在葉際環(huán)境中充當(dāng)著植物病原體、固氮共生菌、真菌拮抗菌以及分解者等不同的“角色”，其中某些放線(xiàn)菌可以作為植物病原菌的拮抗菌運(yùn)用到農(nóng)作物的抗病過(guò)程[61]。葉際細(xì)菌是葉際微生物的主要組成部分，其未知的生態(tài)功能和應(yīng)用價(jià)值還值得進(jìn)一步的探索。

葉際微生物中的真菌類(lèi)群主要由酵母菌和絲狀真菌兩大類(lèi)群構(gòu)成[62]。在健康的植物葉片上，酵母菌是主要的葉面附生真菌，每克葉片的酵母菌培養(yǎng)數(shù)量可以達(dá)到10～1010CFU[48]。雖然細(xì)菌是最豐富的葉際微生物，但酵母菌以及類(lèi)酵母菌，如出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)等在葉際環(huán)境中也非?！盎钴S”[62]。在溫帶、熱帶和地中海等不同氣候特征生存的植物葉際中都發(fā)現(xiàn)存在酵母菌，這些酵母菌的種類(lèi)分屬擔(dān)子菌和子囊菌兩大類(lèi)群[63-66]。其中多數(shù)植物葉際酵母菌以擔(dān)子菌為主，并以隱球酵母屬(Cryptococcus)、紅酵母屬(Rhodotorula) 和擲孢酵母屬(Sporobolomyces)數(shù)量最多[65,67-68]。屬于子囊菌的酵母在葉際環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的種類(lèi)有漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)、Kazachstania barnetii、美極梅奇酵母(Metschnikowia pulcherima)、Metschnikowia reukaufii、膜璞畢赤酵母(Pichia membranifaciens)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 和幾種假絲酵母等[66,69]。除了對(duì)維管植物葉際酵母類(lèi)群的研究外，有學(xué)者還對(duì)苔蘚植物葉際酵母類(lèi)群進(jìn)行了研究。KACHALKIN 等[70]對(duì)泥炭蘚葉際上的酵母群落進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：泥炭蘚和維管植物葉片上形成的附生酵母群落組成存在顯著差異，泥炭蘚葉際中紅酵母豐度較低，而出現(xiàn)這種差異的原因主要是由不同植物的生長(zhǎng)環(huán)境造成的。葉際酵母群落組成會(huì)隨著季節(jié)變化而改變。GLUSHAKOVA 等[69]測(cè)定了25 種植物在整個(gè)生長(zhǎng)期葉片和花朵上的附生酵母菌數(shù)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：葉表酵母菌數(shù)量隨著季節(jié)的變化而變化，且在春季和夏季有所增加。

葉際絲狀真菌(filamentous fungus)群體因?yàn)榘芏嘀参锊≡艿窖芯空叩膹V泛關(guān)注[71]。絲狀真菌在葉際的種群數(shù)量可以達(dá)到102～108CFU/g，在健康葉片上主要以休眠孢子而不是以活性菌絲體的形式存在[48]。具有侵染活性的絲狀真菌必須在快速劇烈波動(dòng)的溫度、濕度和光照的葉際環(huán)境中存活下來(lái)，需要躲避各種直接和間接的物理破壞，等到條件成熟便可對(duì)植物進(jìn)行侵染[72]。在植物葉際環(huán)境中，絲狀真菌多樣性非常豐富，包括枝孢菌屬(Cladosporium)、鏈格孢菌屬(Alternaria)、鐮刀菌屬(Fusarium)、青霉屬(Penicillium)、枝頂孢屬(Acremonium)、炭疽菌屬(Colletotrichum)、毛霉屬(Mucor) 和曲霉屬(Aspergillus)等多種致病和非致病真菌的存在[18,73]。在植株生長(zhǎng)的各個(gè)階段，葉際環(huán)境中都存在著致病和非致病絲狀真菌。AHMED 等[18]研究了橄欖不同物候期(5、6、10 和12 月)葉、花和果實(shí)的真菌多樣性，結(jié)果表明：葉片的真菌多樣性水平最高，屬于病原菌的炭疽菌屬(Colletotrichum)真菌在成熟的果實(shí)中豐度最高，其他病原菌包括鐮刀菌屬(Fusarium)和鏈格孢菌屬(Alternaria)真菌的檢出率則相對(duì)較低。另外，葉際絲狀真菌群落對(duì)于陸地生態(tài)系統(tǒng)中植物殘?bào)w的分解轉(zhuǎn)化也起到了很大作用[74]。

3 葉際微生物與宿主植物的互作

3.1 宿主植物對(duì)葉際微生物的影響

植物葉際微生物群體復(fù)雜多樣，不同植物葉際微生物組成有所不同，除了受環(huán)境因子的影響外，還受到植物本身植株生理特性的影響，當(dāng)然，植物的基因型才是決定葉際微生物群落組成的核心因素。植物種類(lèi)形態(tài)、葉的位置和高度以及葉齡等都會(huì)影響葉際微生物的種群變化[75]。微生物細(xì)胞或孢子到達(dá)植物葉片表面，最先接觸的是葉片角質(zhì)層。葉片角質(zhì)層對(duì)于植物的生長(zhǎng)具有多種功能，如減少水和溶質(zhì)的損失、具有反射光的作用而降低葉片的溫度波動(dòng)、具有斥水性和阻止病原體入侵等，其中斥水性在防止微生物向葉表面遷移方面尤為重要[76]；同時(shí)角質(zhì)層限制葉片養(yǎng)分流失的功能對(duì)葉面附生微生物種群的生長(zhǎng)也有很大影響[77]。葉際微生物在葉片表面的分布并不均勻，葉際細(xì)菌傾向于聚集在葉表面表皮細(xì)胞壁連接處、氣孔、毛狀體基部和水孔附近，另外植物組織的傷口附近和花粉也會(huì)吸引大量微生物聚集[75,78-79]。YADAV 等[80]通過(guò)對(duì)8 種多年生樹(shù)木葉際細(xì)菌群落的檢測(cè)，評(píng)估了不同葉片特征對(duì)葉際細(xì)菌種群大小的影響，結(jié)果表明：葉表細(xì)菌種群大小與分泌型和非分泌型腺毛密度呈正相關(guān)，與葉片厚度、葉肉厚度和葉背表皮厚度呈負(fù)相關(guān)。

植物葉片的植物化學(xué)物質(zhì)和有機(jī)揮發(fā)物影響葉際微生物群落的構(gòu)成。RUPPEL 等[81]研究了4 種不同植物(芥菜、油菜、菊苣和菠菜)中不同濃度硫代葡萄糖苷和類(lèi)胡蘿卜素與葉際細(xì)菌種群大小的關(guān)系，結(jié)果表明：不同植物的次生代謝產(chǎn)物濃度和組成、細(xì)菌種群大小和微生物群落組成等方面存在顯著差異，且4 種植物葉際細(xì)菌種群密度與β-胡蘿卜素濃度呈正相關(guān)，與2-苯乙基硫代葡萄糖苷濃度呈負(fù)相關(guān)。植物葉片在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生很多揮發(fā)性有機(jī)化合物(volatile organic compounds，VOCs)，這些化合物具有不同的功能，有的具有抗菌作用，有的可以作為碳源被微生物利用，因此，植物VOCs 的排放在決定植物葉際微生物群落特征方面起著重要作用。葉片VOCs 包括小分子的二氧化碳和丙酮，也包括萜類(lèi)和一些醛類(lèi)、醇類(lèi)等，還有一些大分子如長(zhǎng)鏈烴和倍半萜類(lèi)等[9]。有研究表明：葉際細(xì)菌中的某些種類(lèi)如扭托甲基桿菌(Methylobacterium extorquens)和酵母菌博伊丁假絲酵母(Candida boidinii)可以利用甲醇之類(lèi)的VOCs 作為生長(zhǎng)底物[82-83]。具有甲基營(yíng)養(yǎng)代謝方式的微生物在葉際定殖過(guò)程中具有一定的選擇優(yōu)勢(shì)，因?yàn)榭梢岳弥参颲OCs 作為底物的微生物能夠優(yōu)先生長(zhǎng)在可以大量排放這種VOCs 的植物葉際。在植物葉片VOCs 的主要成分中，如萜類(lèi)、苯丙酸類(lèi)和苯環(huán)類(lèi)等化合物具有抗菌活性，還有一些醛類(lèi)，如苯甲醛、乙醛和肉桂醛也具有抑制微生物生長(zhǎng)的特性，這些VOCs 都會(huì)影響微生物在葉際的定殖[84-86]。JUNKER 等[87]研究了肥皂草(Saponaria officinalis)和百脈根(Lotus corniculatus)花瓣和葉片表面細(xì)菌群落組成，結(jié)果表明：同一植株花瓣上細(xì)菌多樣性要遠(yuǎn)低于葉片，主要原因是由于花瓣上釋放更多的抗菌揮發(fā)物質(zhì)所致。

作為一類(lèi)和植物緊密聯(lián)系的微生物群體，葉際微生物菌群平衡和植物的健康息息相關(guān)。最新研究表明：植物可以通過(guò)調(diào)節(jié)葉際微生物菌群平衡來(lái)保證自身健康。CHEN 等[88]通過(guò)16S rRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序檢測(cè)了擬南芥健康植株(野生型，Col-0)和發(fā)病植株(突變體，mfec)葉片總微生物組和葉內(nèi)微生物組，結(jié)果表明：健康葉片和發(fā)病葉片葉內(nèi)微生物豐度和多樣性有顯著差異，發(fā)病葉片內(nèi)微生物多樣性降低，變形菌門(mén)(Proteobacteria)細(xì)菌群體過(guò)度增殖，抑制了厚壁菌門(mén)(Firmicute)細(xì)菌群體，而健康植株可以通過(guò)pattern-triggered immunity (PTI)途徑和MIN7 囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)途徑以及CAD1基因共同調(diào)節(jié)葉內(nèi)生微生物豐富度和多樣性，防止菌群失調(diào)，維持植物健康。

3.2 葉際微生物對(duì)宿主植物的影響

葉際微生物的研究最早是從葉際病原微生物開(kāi)始的[4]。葉際病原微生物可以直接侵入植物葉片組織導(dǎo)致植物發(fā)病[72]，某些葉際微生物也可以通過(guò)一定作用間接使植物發(fā)病，如：冰核活性細(xì)菌(ice-nucleation active bacteria)可以誘發(fā)植物產(chǎn)生凍害[89]。凍害是植物的一種非生物疾病，冰核活性細(xì)菌是一類(lèi)能在?5～?2 ℃條件下催化誘發(fā)植物體內(nèi)水分產(chǎn)生冰核而引起霜凍的細(xì)菌，冰核細(xì)菌可以提高植物的受凍溫度，是誘發(fā)植物產(chǎn)生凍害的關(guān)鍵因素[90-91]。隨著人們對(duì)葉際微生物的深入研究，發(fā)現(xiàn)葉際微生物不僅可以導(dǎo)致植物發(fā)病，某些微生物還具有固氮、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和抗病的作用[92]。氮素對(duì)于所有生物來(lái)說(shuō)都是必不可少的，生物固氮占氮素向陸地生態(tài)系統(tǒng)自然輸入的97%以上，葉際微生物群體中的固氮菌已被廣泛報(bào)道[93]。固氮微生物在葉片中可以促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，提高植物含氮量。GIRI 等[94]從葉際中分離到一批固氮細(xì)菌，選擇2 株固氮菌AN1 和TK2施加到玉米植株的葉面層上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)植物的生長(zhǎng)量和全氮含量顯著提高，平均增產(chǎn)30%～37%，接近于化肥處理。FüRNKRANZ 等[58]研究了哥斯達(dá)黎加不同環(huán)境條件不同雨林植物的葉片氮固定效率，并對(duì)3 種植物固氮細(xì)菌群落進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明：氮素固定效率因植物種類(lèi)、生長(zhǎng)地點(diǎn)(不同的小氣候條件)和光照而不同，其中Carludovica drudei和Costus laevis的葉片相關(guān)固氮細(xì)菌群落主要由藍(lán)細(xì)菌組成，而Grias coliflora葉片上還有γ-變形菌。研究葉際固氮菌的群落特征和活動(dòng)規(guī)律，并運(yùn)用到農(nóng)作物的增產(chǎn)增收，對(duì)于農(nóng)業(yè)有機(jī)生產(chǎn)具有重要意義。葉際微生物可以合成產(chǎn)生植物激素，如生長(zhǎng)素(indole-3-acetic acid，IAA)和細(xì)胞分裂素[92-93]。此外，葉際微生物也可以產(chǎn)生VOCs 對(duì)寄主植物產(chǎn)生影響。一些葉際微生物產(chǎn)生的VOCs 可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)和提高抗逆性，一些非致病微生物釋放的VOCs還可以阻止真菌和細(xì)菌病原體侵染植物等[95]。D'ALESSANDRO 等[96]研究了玉米中1 種主要細(xì)菌VOCs——2,3-丁二醇(2,3-BD)的來(lái)源和作用，結(jié)果顯示：2,3-BD 來(lái)源于玉米幼苗中的1 種內(nèi)生細(xì)菌?產(chǎn)氣桿菌(Enterobacter aerogenes)，并且2,3-BD 可以增加玉米對(duì)病原菌的抗性。另外，葉際微生物還可以通過(guò)誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)來(lái)改變植物VOCs 的排放。TOOME 等[97]用柳葉銹菌侵染柳葉研究病原體對(duì)柳葉揮發(fā)性有機(jī)化合物釋放模式的影響，與對(duì)照相比，受銹菌感染葉片的倍半萜和脂氧合酶產(chǎn)物(LOX) 釋放量分別增加175 倍和10 倍。葉際微生物與宿主植物的健康生長(zhǎng)息息相關(guān)，某些葉部病原菌可以導(dǎo)致植物發(fā)病，而葉片上非致病微生物的多樣性則可以對(duì)植物抵御病害起到保護(hù)作用[98]。

微生物成功定殖植物葉際成為葉際微生物，必須通過(guò)宿主植物的“重重考驗(yàn)”，而一旦成功定殖，某些具有致病能力的微生物則會(huì)導(dǎo)致植物發(fā)病。宿主植物為葉際微生物提供了廣闊的生活場(chǎng)所和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)某些葉際微生物也可以通過(guò)固氮作用和分泌VOCs 等途徑促進(jìn)植物生長(zhǎng)。宿主植物和葉際微生物之間相互影響，雙方處在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過(guò)程，如何維持這種平衡以及深層機(jī)理則是研究宿主植物和葉際微生物互作的一個(gè)重要方向。

4 討論

相對(duì)于根際微生物，葉際微生物的研究起步較晚，研究的廣度和深度暫不如根際微生物，但葉際微生物對(duì)于植物的健康生長(zhǎng)發(fā)育同等重要。相對(duì)于大部分植物來(lái)說(shuō)，葉際部分所占植物個(gè)體的比例較根際大得多，所以對(duì)于葉際微生物的研究，既有挑戰(zhàn)也有機(jī)遇。植物葉際包含葉表和葉內(nèi)，葉表微生物群體數(shù)量比葉內(nèi)微生物群體數(shù)量大，但葉內(nèi)微生物和宿主植物的互作更加緊密。葉際微生物具有固氮、硝化和分解等作用，這對(duì)于全球森林生態(tài)系統(tǒng)、草原生態(tài)系統(tǒng)和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)等不同生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定和有序運(yùn)轉(zhuǎn)具有重要意義，所以研究葉際微生物需要和生態(tài)學(xué)等多種學(xué)科相結(jié)合。葉際微生物中大部分為不可培養(yǎng)群體，雖然新一代測(cè)序技術(shù)基本可以展現(xiàn)葉際微生物的全貌，但想要探索葉際微生物的更多功能并進(jìn)一步運(yùn)用到生產(chǎn)實(shí)踐，則需依靠基礎(chǔ)的微生物培養(yǎng)技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，所以要想分離到更多的葉際微生物，需要探索更有效的分離方法和培養(yǎng)技術(shù)。葉際微生物群體多樣性和植物的基因型密切相關(guān)，植物可以依賴(lài)自身免疫系統(tǒng)來(lái)維持葉際微生物的平衡，也許未來(lái)可以通過(guò)改造植物某些基因來(lái)調(diào)控葉際微生物組成的穩(wěn)態(tài)或?qū)ζ溥M(jìn)行優(yōu)化，提高有益微生物數(shù)量和抑制病原微生物。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，運(yùn)用最新的研究技術(shù)如宏基因組、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等可以更深層的揭示植物和葉際微生物之間的分子互作機(jī)制。最后，和人類(lèi)關(guān)系最密切的是將葉際微生物運(yùn)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，目前已經(jīng)明確部分葉際微生物具有固氮、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和抗病等功能，如何將其應(yīng)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐是研究葉際微生物的重要方向。