頂空氣相色譜法測(cè)定甲鈷胺原料藥的7種溶劑殘留

顧曉風(fēng)，田沛霖

(蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心，蘇州 215104)

甲鈷胺又稱(chēng)甲基維生素B12，是維生素B12在體內(nèi)的活性形式之一。甲鈷胺為抗周?chē)窠?jīng)病變藥，通過(guò)促進(jìn)核酸和蛋白質(zhì)的合成，恢復(fù)神經(jīng)軸突傳遞的延遲和神經(jīng)傳遞物質(zhì)的減少，臨床主治由糖尿病引起的神經(jīng)障礙、多發(fā)性神經(jīng)炎，尤其對(duì)糖尿病并發(fā)癥，如麻木、疼痛及麻痹有明顯的效果[1-3]。

甲鈷胺以氰鈷胺為原料，在其生產(chǎn)過(guò)程中，經(jīng)大孔樹(shù)脂吸附提純，普遍采用XAD1180大孔樹(shù)脂[4]，屬于苯乙烯骨架型，可能引入正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯和二乙烯苯等殘留[5-6]，后用丙酮進(jìn)行重結(jié)晶，可能引入丙酮?dú)埩簟＜租挵肥珍浻凇吨袊?guó)藥典》2020年版二部中，但未對(duì)其殘留溶劑進(jìn)行規(guī)定[7]。甲鈷胺的進(jìn)口藥品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)JX20040191規(guī)定了丙酮的測(cè)定方法[8]，所用溶劑α-甲氧基乙醇毒性大，且僅特定品牌對(duì)丙酮測(cè)定無(wú)干擾；直接進(jìn)樣峰形較差，樣品中的甲鈷胺殘留在分流平板上易造成污染。文獻(xiàn)報(bào)道[9-10]，目前尚未對(duì)甲鈷胺多種溶劑殘留，特別是大孔樹(shù)脂殘留進(jìn)行系統(tǒng)地研究。按照人用藥品注冊(cè)技術(shù)國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)(ICH)及《中國(guó)藥典》的相關(guān)要求，采用大孔樹(shù)脂吸附凈化時(shí)，需對(duì)樹(shù)脂殘留進(jìn)行檢測(cè)[11]。為確保原料藥的安全、有效和可控，本文采用頂空氣相色譜法，擬對(duì)甲鈷胺原料藥中的丙酮、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、二乙烯苯和苯乙烯7種溶劑進(jìn)行檢測(cè)[12-19]，為甲鈷胺及其制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 7890B/7697A型頂空氣相色譜儀，Agilent DB-WAX(30 m×0.32 mm，0.5 μm)石英毛細(xì)管柱，安捷倫科技(中國(guó))有限公司；XS205DU型電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2試藥N，N-二甲基甲酰胺(色譜純，德國(guó)默克公司)；丙酮、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯和二乙烯苯均為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；水為去離子水(密理博公司)；7批甲鈷胺原料藥，分別由衛(wèi)材(中國(guó))藥業(yè)有限公司(批號(hào)分別為181252、181253、190451、190551、200453)和河北華榮制藥有限公司(批號(hào)分別為190118-02、191219-05)生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 采用Agilent DB-WAX(30 m×0.32 mm，0.5 μm)石英毛細(xì)管柱。程序升溫，起始溫度為40 ℃，保持5 min，以10 ℃·min-1的速率升至180 ℃，保持5 min。進(jìn)樣口溫度為220 ℃，分流比為2∶1。檢測(cè)器為氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)，溫度為250 ℃。載氣為高純氮，流速為1.5 mL·min-1。頂空平衡溫度為80 ℃，平衡時(shí)間為30 min，定量環(huán)溫度為95 ℃，傳輸管溫度為110 ℃，進(jìn)樣時(shí)間為1 min。

2.2溶液的制備

2.2.1混合對(duì)照品儲(chǔ)備液 精密稱(chēng)取苯、正己烷、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯和丙酮適量，加質(zhì)量濃度為100 g·L-1的N，N-二甲基甲酰胺溶解并稀釋成質(zhì)量濃度分別為4.06、40.16、40.72、39.92、10.79、10.02、1 022.46 μg·mL-1的混合溶液。精密移取上述混合溶液10 mL，加水稀釋至100 mL，搖勻，即得。

2.2.2混合對(duì)照品溶液 精密吸取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液10 mL，置于100 mL量瓶中，加質(zhì)量濃度為100 g·L-1的N，N-二甲基甲酰胺溶液稀釋至刻度，搖勻，移取5 mL置于頂空瓶中，加蓋密封，即得。

2.2.3供試品溶液 精密稱(chēng)取甲鈷胺0.1 g，置于頂空瓶中，精密加入質(zhì)量濃度為100 g·L-1的N，N-二甲基甲酰胺溶液5 mL，加蓋密封，超聲(500 W，40 kHz)處理1 min使溶解，即得。

2.2.4空白溶液 精密移取質(zhì)量濃度為100 g·L-1的N，N-二甲基甲酰胺溶液5 mL，置于頂空瓶中，加蓋密封，即得。

2.3專(zhuān)屬性考察 取2.2項(xiàng)下制備的空白溶液、混合對(duì)照品溶液和供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖 1。由圖1可知，空白溶液無(wú)干擾，混合對(duì)照品溶液中，各峰的理論塔板數(shù)均大于5 000，拖尾因子均小于1.5，分離度大于2.0，符合分析要求。其中二甲苯出峰峰號(hào)5、6、7、8，二乙烯苯出峰峰號(hào)10、11、12、13，定量以各峰面積之和計(jì)算[20]。

圖1 GC圖A.空白溶液；B.混合對(duì)照品溶液；C.供試品溶液；1.正己烷；2.丙酮；3.苯；4.甲苯；5、6、7、8.二甲苯；9.苯乙烯；10、11、12、13.二乙烯苯。Fig.1 GC chromatogramsA.blank solvent；B.mixed reference substance solution；C.sample solution；1.hexane；2.acetone；3.benzene；4.toluene；5，6，7，8.xylene；9.cinamene；10，11，12，13.divinyl benzene.

2.4精密度考察 取2.2.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液6份，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果7種溶劑峰面積的RSD值分別為2.68%、0.30%、2.01%、1.82%、1.79%、1.50%、1.62%，表明儀器精密度良好。

2.5線性關(guān)系考察 精密移取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液20、10、5、2、1 mL，分別置于100 mL量瓶中，加質(zhì)量濃度為100 g·L-1的N，N-二甲基甲酰胺溶液稀釋至刻度，搖勻。精密移取上述系列溶液各5 mL，置于頂空瓶中，密封。按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)表1。

2.6定量限和檢測(cè)限 取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，逐級(jí)稀釋?zhuān)瑴y(cè)定并記錄峰面積，當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得到定量限(LOQ)；信噪比為3∶1時(shí)，得到檢測(cè)限(LOD)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回歸方程、線性范圍、LOD與LOQTab.1 Regression equations，linear ranges and LOD and LOQ

2.7回收率實(shí)驗(yàn) 精密移取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液7.5、5.0、2.5 mL，分別置于100 mL量瓶中，加質(zhì)量濃度為100 g·L-1的N，N-二甲基甲酰胺溶液稀釋至刻度，搖勻。精密稱(chēng)取甲鈷胺(批號(hào)190451)9份，每份0.1 g，分別置于頂空瓶中，每3份為1組。3組分別精密加入上述3種溶液各5 mL，加蓋密封，超聲(500 W，40 kHz)處理1 min使溶解，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算平均回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=9)Tab.2 Results of recovery tests (n=9)

2.8樣品含量測(cè)定 取7批樣品，按照2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液后進(jìn)行測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中殘留溶劑的含量，結(jié)果見(jiàn)表 3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果Tab.3 Determination results of sample content

3 討論

3.1溶劑的選擇 甲鈷胺在水中微溶，而正己烷、苯和苯乙烯等有機(jī)溶劑在水中幾乎不溶，添加N，N-二甲基甲酰胺能提高這些溶劑在水中的溶解度。N，N-二甲基甲酰胺質(zhì)量濃度過(guò)低時(shí)，有機(jī)溶劑可能析出，影響準(zhǔn)確度；N，N-二甲基甲酰胺質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)，會(huì)影響蒸氣壓，造成頂空進(jìn)樣，影響靈敏度。經(jīng)考察，選用質(zhì)量濃度為100 g·L-1的N，N-二甲基甲酰胺溶液作為溶劑，結(jié)果重復(fù)性好，大部分有機(jī)溶劑響應(yīng)值高，靈敏度滿(mǎn)足要求。

3.2色譜柱的選擇 比較了中等極性毛細(xì)管柱Agilent DB-1701(30 m×0.32 mm，0.5 μm)和極性毛細(xì)管柱Agilent DB-WAX(30 m×0.32 mm，0.5 μm)，結(jié)果表明，極性毛細(xì)管柱Agilent DB-WAX(30 m×0.32 mm，0.5 μm)更好地實(shí)現(xiàn)二甲苯與二乙烯苯多個(gè)峰之間的完全分離。

3.3頂空條件的選擇 考察頂空平衡溫度，溫度設(shè)置為70、80、90 ℃。結(jié)果表明，當(dāng)溫度為70 ℃時(shí)，高沸點(diǎn)物質(zhì)峰面積小，靈敏度較差；當(dāng)溫度為80 ℃時(shí)各峰的峰面積重復(fù)性好，峰響應(yīng)較好；溫度80、90 ℃之間無(wú)顯著差異，故選擇80 ℃作為頂空平衡溫度。

分別考察了頂空平衡時(shí)間為15、30 min，結(jié)果表明，平衡時(shí)間為30 min時(shí)，各峰峰面積更加穩(wěn)定，故選擇30 min作為頂空平衡時(shí)間。

4 小結(jié)

參考《中國(guó)藥典》2020年版、甲鈷胺進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)JX20040191及ICH有關(guān)規(guī)定，本文控制7種溶劑的殘留限度分別為不得超過(guò)0.05%、0.002%、0.000 2%、0.002%、0.002%、0.000 5%、0.000 5%。本文建立了甲鈷胺中7種殘留溶劑的頂空氣相色譜法，對(duì)收集到的7批樣品進(jìn)行測(cè)定，其中2批樣品檢測(cè)出樹(shù)脂殘留，5批檢測(cè)出丙酮?dú)埩?，結(jié)果均在限度范圍內(nèi)。該方法操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，可用于甲鈷胺殘留溶劑的質(zhì)量控制。