頭孢地尼中雜質(zhì)來(lái)源分析與合成

王靜，吳丹，劉龍,3*

(1.泰州醫(yī)藥高新技術(shù)產(chǎn)區(qū)園區(qū)公共平臺(tái)服務(wù)中心，江蘇 泰州 225300;2.廣州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 511436；3.天津佰肽特醫(yī)藥科技有限公司，天津 300000)

頭孢地尼(Cefdinir，圖1)，化學(xué)名(6R，7R)-7-[[(2-氨基-4-噻唑基)-(肟基)乙?；鵠氨基]-3乙烯基-8-氧代-5硫雜-1-氮雜雙環(huán)[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸，是一種優(yōu)良的第三代口服頭孢類抗生素，由日本藤澤藥品工業(yè)株式會(huì)社研制開發(fā)，于1991年首次在日本上市，商品名為：Cefzon?。1997年12月經(jīng)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市，商品名為：Omnicef?。1999年在韓國(guó)上市，2001年獲批在我國(guó)上市，商品名為：世扶尼?[1-5]。

圖1 頭孢地尼結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of Cefdinir

已經(jīng)有很多文獻(xiàn)報(bào)道了頭孢地尼原料藥的合成[6-18]，其中最常用的方法是以7-AVCA(11)和活性酯CAEM(1)為原料，以四氫呋喃和水為溶劑，在三乙胺的作用下縮合得到O-乙酰頭孢地尼(12)(以下簡(jiǎn)稱“雜質(zhì)S”)，O-乙酰頭孢地尼在氯化銨和碳酸鉀的作用下水解得到頭孢地尼?！吨袊?guó)藥典》2015年版[19]和《美國(guó)藥典》40版[20]均已收載該品種?！吨袊?guó)藥典》2015年版收錄的頭孢地尼有關(guān)物質(zhì)，對(duì)特定雜質(zhì)A～S進(jìn)行了定量控制，但沒有對(duì)《美國(guó)藥典》40版中的特定雜質(zhì)噻唑乙?；拾彼犭?2)進(jìn)行控制。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于頭孢地尼雜質(zhì)的合成報(bào)道較少，部分雜質(zhì)目前未見文獻(xiàn)報(bào)道，Prasada Rao等[21]報(bào)道了《中國(guó)藥典》2015年版中的雜質(zhì)D(8)和雜質(zhì)G(10)的合成路線，但未提供純化方法。

因此，本文參考以上兩部藥典對(duì)頭孢地尼有關(guān)物質(zhì)的規(guī)定，基于頭孢地尼的合成工藝路線，對(duì)美國(guó)藥典中規(guī)定的特定雜質(zhì)噻唑乙酰基甘氨酸肟(2)和《中國(guó)藥典》2015年版中的特定雜質(zhì)O(7)、雜質(zhì)D(8)、雜質(zhì)G(10)和雜質(zhì)S(12)進(jìn)行合成、分離和純化，使其純度均達(dá)到了99%以上，為頭孢地尼質(zhì)量控制中的雜質(zhì)對(duì)照品提供了來(lái)源，極大地降低了購(gòu)買對(duì)照品的成本。

1 雜質(zhì)來(lái)源和合成路線

噻唑乙?；拾彼犭?2)：化學(xué)名N-[(Z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-2-(羥基亞氨基)乙?；鵠甘氨酸，由頭孢地尼上的β內(nèi)酰胺環(huán)開環(huán)裂解產(chǎn)生。本研究以CAEM(1)和Gly為原料，在堿性條件下縮合，酸性條件脫除肟上的乙?；玫疆a(chǎn)物(2)，產(chǎn)率為30%，純度達(dá)到99.6%,見圖2。

圖2 噻唑基乙?；拾彼犭亢铣陕肪€Fig.2 Synthesis of Thiazolylacetyl glycine oxime

雜質(zhì)O(7)：化學(xué)名(6R,7R)- 7-[(Z)-2-(2-氨基-4-噻唑基)乙酰氨基]-3-乙烯基-8-氧代-5-硫雜-1-氮雜雙環(huán)[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸，是由頭孢地尼起始原料CAEM(1)中的雜質(zhì)引入并參與后續(xù)?；磻?yīng)，得到的副產(chǎn)物。以2-(2-氨基噻唑-4-基)乙酸(3)為原料，經(jīng)過羧基酯化，氨基Trt保護(hù)，水解酯基，羧基成酰氯，與7-AVCA(11)縮合，脫Trt保護(hù)基制得雜質(zhì)O(7)，產(chǎn)率為11%，純度99.2%,見圖3。

圖3 雜質(zhì)O合成路線Fig.3 Synthesis of impurity O

雜質(zhì)D(8)：化學(xué)名(6R,7R)-7-[(Z)-2-(2-氨基-4-噻唑基)-2-(肟基)乙酰氨基]-3-乙烯基-5,8-氧代-5-硫雜-1-氮雜雙環(huán)[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸，是由頭孢地尼氧化得到的雜質(zhì)。以頭孢地尼為起始原料，過氧乙酸氧化得到雜質(zhì)D(8)，產(chǎn)率為27%，純度99.6%,見圖4。

圖4 雜質(zhì)D的合成路線Fig. 4 Synthesis of impurity D

雜質(zhì)G(10)：化學(xué)名(6R,7R)-7-[(Z)-2-(2-氨基-4-噻唑基)-2-(肟基)乙酰氨基]-3-甲基-8-氧代-5-硫雜-1-氮雜雙環(huán)[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸，是由原料7-AVCA中的微量雜質(zhì)，參與后續(xù)反應(yīng)得到的副產(chǎn)物。雜質(zhì)G(10)與頭孢地尼的合成工藝基本一致，即活性酯CAEM(1)與7-ADCA(9)在堿性條件下縮合，再經(jīng)堿性水解，即可生成，產(chǎn)率為80%，純度99.1%,見圖5。

圖5 雜質(zhì)G的合成路線Fig.5 Synthesis of impurity G

雜質(zhì)S(12)：化學(xué)名(6R,7R)-7-[(Z)-2-(2-氨基-4-噻唑基)-2-乙酰亞氨基乙酰氨基]-3-乙烯基-8-氧代-5-硫雜-1-氮雜雙環(huán)[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸(25)，簡(jiǎn)稱“O-乙酰頭孢地尼”。原料7-AVCA(11)和CAEM(1)縮合反應(yīng)到頭孢地尼，當(dāng)水解不完全時(shí)，會(huì)生成雜質(zhì)S。與頭孢地尼的合成一致，不同的是?；磻?yīng)完成后，不經(jīng)水解，立即加酸將pH調(diào)至6，析出固體，過濾，即得產(chǎn)物，產(chǎn)率80.3%，純度99.3%,見圖6。

圖6 雜質(zhì)S的合成路線Fig.6 Synthesis of impurity S

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器材料

核磁共振氫譜(1H NMR)用BurkerAV-300型核磁共振儀測(cè)定，TMS為內(nèi)標(biāo)；質(zhì)譜(MS)用Agilent 1100 ESI-MS型質(zhì)譜儀測(cè)定；紅外光譜(IR)用Shimadzu FTIR-8400型紅外光譜儀測(cè)定，固體KBr壓片；熔點(diǎn)儀用天津市分析儀器廠RY-1G型熔點(diǎn)儀測(cè)定；液相色譜儀為Shimadzu LC-20A系列檢測(cè)；薄層色譜(TLC)采用GF254薄層層析硅膠(青島海洋化工廠)；柱層析采用硅膠H(青島海洋化工廠)；合成實(shí)驗(yàn)所用溶劑及試劑均為化學(xué)純或分析純；高效液相色譜法(HPLC)所用試劑均為色譜純。

2.2 化學(xué)合成

噻唑基乙?；拾彼犭浚簩AEM (5 g，13 mmol)、甘氨酸(1.95 g，26 mmol)、四氫呋喃(75 mL)、水(75 mL)加入到反應(yīng)瓶中，室溫下攪拌30 min。緩慢滴加三乙胺至反應(yīng)液pH為8, 滴畢，室溫反應(yīng)36 h。體積分?jǐn)?shù)10%硫酸水溶液調(diào)pH至6，析出白色固體，冰浴條件下繼續(xù)攪拌1 h，析出晶體，抽濾，冷水洗滌。40 ℃真空干燥得白色粉末，二氯甲烷打漿，過濾，得類白色粉末(0.98 g，產(chǎn)率30%，HPLC純度99.6%)， m.p.190～194 ℃。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) ,δ: 1.84(s, 1H), 3.84(d,J=4.8 Hz, 2H), 6.89(s, 1H), 7.13(s, 2H), 8.73(s, 1H), 11.22(brs, 1H); ESI-MS(m/z): 245 [M+H]+; IR (KBr, cm-1)：3355, 3303, 3182, 2360, 2341, 1637, 1508, 1482, 1428, 1386, 1354, 1308, 1270, 1105, 1074, 1034, 1013, 954, 848, 749, 624, 541。

雜質(zhì)O：將化合物3(5 g，32 mmol)、乙醇(88 mL)加入反應(yīng)瓶中，攪拌制成混懸液，滴加濃鹽酸(25 mL)，滴畢，加熱回流，TLC跟蹤至反應(yīng)完全。降至室溫，反應(yīng)液濃縮至40 mL，加飽和碳酸鈉水溶液(37 mL)，析出固體，過濾，水洗濾餅(30 mL×2)，40 ℃真空干燥，得白色固體。將干燥的白色固體、三苯基氯甲烷(12.1 g，48 mmol)、二氯甲烷(200 mL)加入到反應(yīng)瓶中，室溫?cái)嚢?0 min，滴加TEA(4.86 g，48 mmol)，繼續(xù)攪拌15 h，TLC跟蹤至反應(yīng)完全。加水(75 mL)淬滅反應(yīng)，靜置分層，水層用二氯甲烷萃取(60 mL ×2)，合并有機(jī)層，減壓濃縮，得粗品。硅膠柱層析分析(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=3∶1)，得到化合物4。

化合物4 加入反應(yīng)瓶，在反應(yīng)瓶中加入3 mol/L氫氧化鈉甲醇溶液(20 mL)，室溫?cái)嚢? h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)結(jié)束。反應(yīng)液用體積分?jǐn)?shù)10%硫酸水溶液調(diào)pH至3.0，析出灰白色固體，過濾，濾餅水洗，40 ℃真空干燥12 h，得化合物5(5.8 g)。

在反應(yīng)瓶中加入乙醚(10 mL)，催化量 DMF，冰浴條件下滴加草酰氯(2.2 g，17.4 mmol)，有氣體生成，5 min后生成白色固體。反應(yīng)液減壓濃縮，除去乙醚，加無(wú)水二氯甲烷(10 mL)，攪拌得混懸液。反應(yīng)液降溫至-10 ℃，加入化合物5(5.8 g，14.5 mmol)，TLC跟蹤至反應(yīng)完全，得到酰氯化合物。將7-AVCA (3.3 g，14.5 mmol)、DMF(10 mL)、六甲基二硅脲(3.3 g，16 mmol)，吡啶(2.5 mL，31 mmol)依次加入到反應(yīng)液中，反應(yīng)液維持在-5～-10 ℃攪拌30 min。加二氯甲烷(15 mL)，水(15 mL)，室溫?cái)嚢?5 min，靜置分層，水層用二氯甲烷(15 mL×2)萃取，合并有機(jī)層。有機(jī)層濃縮至15 mL，加入乙酸乙酯(18 mL)，降溫，析出固體，冰箱冷凍過夜，過濾，得白色固體6(4.1 g)。

98%甲酸(10 mL)加入至反應(yīng)瓶中，冰浴降溫至0 ℃，加入化合物6，攪拌至反應(yīng)液變澄清，升溫至室溫，繼續(xù)攪拌2 h，三苯甲基水解，過濾，得到濾餅。濾餅繼續(xù)用甲酸溶解，得到澄清液體，室溫緩慢加入丙酮，冰箱冷凍過夜析晶，過濾，得到濾餅，35 ℃真空干燥，得白色固體雜質(zhì)O(1.26 g，產(chǎn)率11%，HPLC純度98.6%)，m.p.178～180 ℃(decomp) 。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6),δ：3.38(s，2H), 3.57&3.86(ABq，J=17.8 Hz，2H), 5.14(d，J=4.8 Hz，1H)，5.31(d，J=11.3 Hz，1H)，5.59(d，J=17.6 Hz , 1H)，5.69(dd，J=4.8 Hz、8.4 Hz，1H), 6.25(s，1H), 6.86～6.95(m, 2H), 6.90(dd,J=11.3 Hz、17.6 Hz, 1H) ，8.93(d，J=8.4 Hz，1H); ESI-MS(m/z)：367[M+H]+; IR(KBr，cm-1)：3288, 1764,1657, 1543, 1389, 1346, 1237, 1167, 1119, 711, 556。

雜質(zhì)D：頭孢地尼(3 g，0.007 6 mol)、水(10 mL)加入至反應(yīng)瓶中，攪拌30 min制成混懸液，溫度控制在10～15 ℃，加碳酸氫鈉(0.96 g，0.011 mol)，反應(yīng)液攪拌至澄清。降溫至0 ℃緩慢滴加30%過氧乙酸(2.1 g，0.008 4 mol)，維持0 ℃攪拌2 h，體積分?jǐn)?shù)10%硫酸水溶液調(diào)pH至6，攪拌1 h析晶，過濾，水洗，得灰白色固體雜質(zhì)D(0.84 g，產(chǎn)率27%，HPLC純度99.6%)，m.p.178～183 ℃(decomp)。1H NMR(300 MHz, DMSO-d6), δ:3.45&4.18(ABq,J=18.0 Hz, 2H), 4.94(d,J=4.0 Hz, 1H), 5.23(d，J=11.3 Hz，1H), 5.49(d,J=17.4 Hz , 1H)，5.87(dd，J=4.6 Hz，8.3 Hz , 1H), 6.71(s，1H), 6.97(dd，J=11.3 Hz, 17.4 Hz, 1H), 7.24(brs, 2H), 8.49(d,J=8.3 Hz, 1H), 11.6(brs, 1H); ESI-MS(m/z)：412[M+H]+; IR(KBr，cm-1)：3629, 3398, 2361, 2343, 1774, 1700, 1654, 1637, 1522, 1396, 1121, 1020。

雜質(zhì)G：反應(yīng)瓶中依次加入CAEM(2 g，0.009 mol)、7-ADCA(3.75 g，0.010 mol)、水(10 mL)、THF(20 mL)，攪拌30 min，滴加TEA(1.0 g，0.01 mol)至pH為8，室溫?cái)嚢? h，溶液變澄清。加二氯甲烷(20 mL)，水(10 mL)，繼續(xù)攪拌10 min，靜置分層，二氯甲烷層用水萃取(10 mL×2)，合并水層。水層加氯化銨(1.3 g，0.025 mol)，滴加碳酸鉀水溶液(0.9 mol/L)維持pH至8.0～8.5，攪拌2 h，用體積分?jǐn)?shù)10%硫酸水溶液調(diào)pH至5，降溫至0 ℃，固體析出，抽濾，得到濾餅， 35 ℃真空干燥，得白色固體(3-甲基頭孢地尼:雜質(zhì)G)(2.75 g，收率80%，HPLC純度99.0%), m.p.179～185 ℃(decomp)。1H NMR (300 MHz , DMSO-d6)，δ：2.00(s, 3H, CH3), 3.34&3.54(ABq,J=18.1 Hz,2H),5.09(d,J=4.6 Hz, 1H,),5.70(dd，J=4.6 Hz,8.0 Hz, 1H), 6.69(s, 1H), 7.41(brs, 2H), 9.50(d,J=8.0 Hz, 1H), 11.48(brs, 1H); ESI-MS(m/z): 384[M+H]+; IR(KBr, cm-1): 3274, 3112, 2961, 1762, 1637, 1528, 1378, 1320, 1245, 1189, 1076, 1035, 1013, 750, 605。

雜質(zhì)S：純化水(12 mL)、四氫呋喃(36 mL)，7-AVCA(3 g，0.013 mol)，CAEM(5.9 g，0.016 mol)加入反應(yīng)瓶，緩慢滴加三乙胺(1.6 g，0.016 mol)，使反應(yīng)液pH在7.5～8.0，滴畢，室溫下攪拌4 h(液相監(jiān)控7-AVCA≤1%)。反應(yīng)液中加入二氯甲烷(30 mL)、純化水(30 mL)，攪拌10 min，靜置分層。二氯甲烷層用純化水(10 mL×3)萃取，合并水層。水層立即用體積分?jǐn)?shù)10%硫酸水溶液調(diào)pH至3，過濾，水洗，35 ℃真空干燥，得灰白色固體雜質(zhì)S(4.21 g，產(chǎn)率80.3%，HPLC純度97.5%), m.p.165～170 ℃(decomp)。1H NMR(300 MHz, Acetone-d6),δ:2.2(s, 3H), 3.72&3.92(ABq,J=17.8 Hz，2H),5.33(d,J=3.2 Hz, 1H), 5.36(d,J=3.1 Hz, 1H), 5.64(d,J=17.6 Hz , 1H), 6.03(dd,J=4.8 Hz、8.6 Hz,1H),7.14(m，4H),8.84(d,J=8.6 Hz, 1H); ESI-MS(m/z): 460[M+Na]+; IR(KBr, cm-1): 3434, 3269, 3095, 2969, 1766, 1655, 1628, 1584, 1536, 1370, 1212, 1181, 1001, 918, 852。

3 結(jié)果與討論

本研究成功制備了頭孢地尼原料藥成品中存在的5個(gè)關(guān)鍵雜質(zhì)，合成路線短，操作簡(jiǎn)單。其中雜質(zhì)噻唑乙?；拾彼犭渴遣捎肅AEM和Gly縮合得到。雜質(zhì)O以2-(2-氨基噻唑-4-基)乙酸與7-AVCA縮合再脫Trt保護(hù)基得到。雜質(zhì)D是由頭孢地尼直接通過過氧乙酸氧化得到。雜質(zhì)G是由CAEM與7-ADCA縮合得到。雜質(zhì)S采用與與頭孢地尼的合成方法一致，不同的是?；磻?yīng)完成后，不經(jīng)水解，立即加酸將pH調(diào)至6，析出固體得到。5種雜質(zhì)均經(jīng)1H NMR和MS確證了結(jié)構(gòu)，純度經(jīng)HPLC測(cè)定均達(dá)到了99%以上。這些雜質(zhì)的合成，為頭孢地尼的質(zhì)量控制提供了依據(jù)和參考，對(duì)改進(jìn)頭孢地尼合成工藝，提升原料藥質(zhì)量具有實(shí)際意義。