紅曲柿酒工藝優(yōu)化及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

李慧敏，林鳳，王玉梅，李洋，羅佳沂，毛瑞豐

（廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧530000）

紅曲霉[1]是一種常見(jiàn)的小型絲狀腐生真菌，為食品發(fā)酵常用菌種，自然狀態(tài)下常見(jiàn)于樹(shù)木、土壤和堆積物等處，具備耐酸、耐濕、耐高溫和耐酒精等特點(diǎn)。紅曲[2]是將紅曲霉（Monascus spp.）接種于大米等淀粉含量豐富的原料中并經(jīng)發(fā)酵制成的傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品，自古以來(lái)紅曲米被認(rèn)為具有改善食物消化特性和促進(jìn)血液循環(huán)的作用。目前，紅曲因其多樣化的產(chǎn)品和豐富有益代謝產(chǎn)物而舉世矚目，根據(jù)用途可將紅曲分為色曲、功能曲和釀造曲；釀造曲因具有較高的糖化酶、酯化酶及蛋白酶活力，常用于發(fā)酵酒類(lèi)和醬油。

柿子[3]，是柿科植物漿果類(lèi)水果，大約在每年10 月左右成熟。柿子中含有豐富的生物活性物質(zhì)，以柿子為原料經(jīng)多種工藝釀造而成的柿子酒，具有柿子獨(dú)特的顏色和果香味，同時(shí)還具有促進(jìn)人體消化和生津健脾等多種功能；但柿子由于缺少像葡萄、蘋(píng)果等常見(jiàn)釀酒果實(shí)中所具有的構(gòu)成果酒品質(zhì)特性的多種有機(jī)酸，對(duì)酵母菌的發(fā)酵不利，并且發(fā)酵而成的柿子酒往往風(fēng)味不佳[4]。將紅曲引入果酒發(fā)酵體系，可使柿酒具有獨(dú)特的風(fēng)味、絢麗的色彩和更大的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值3種特色，從而克服柿子酒風(fēng)味欠佳、營(yíng)養(yǎng)成分不足的缺點(diǎn)，使生產(chǎn)的果酒具有更好的感官風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)保健功能。

本研究以廣西桂林脆柿為原料釀制紅曲柿酒，對(duì)柿酒發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定紅曲柿酒制備的最佳工藝參數(shù)，并對(duì)成品酒進(jìn)行理化指標(biāo)和揮發(fā)性成分分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母：安琪酵母股份有限公司；紅曲米：福建省寧德市古田縣；柿子：廣西桂林市恭城縣；蔗糖：廣西鳳糖生化股份有限公司；偏重亞硫酸鉀（食品級(jí)）、果膠酶（3×104U/h）：拉氟德LAFFORTFX 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-800F 恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；RE-2010 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；UV1800-PC 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；XMT-F9 型電熱恒溫水浴鍋：上海洪記儀器設(shè)備有限公司；7890A 型安捷倫氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)安捷倫科技公司。

1.3 方法

1.3.1 紅曲柿酒工藝流程

柿子清洗→脫澀→去果柄和花盤(pán)→果漿調(diào)配→主發(fā)酵→倒酒→后發(fā)酵→倒酒→陳釀→澄清→原酒

1.3.2 發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)

分別以不同發(fā)酵時(shí)間（0、2、4、6、8、10、12 d）、初始糖度（14%、16%、18%、20%、22%、24%）、酵母添加量（200、250、300、350、400、450 mg/kg）、紅曲添加量（0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.5%、4.0%）、發(fā)酵溫度（18、20、22、24、26、28 ℃）作為單因素，以發(fā)酵酒樣中還原糖、酒精度、總酸、可溶性固形物作為評(píng)價(jià)指標(biāo)確定最優(yōu)單因素條件，為下一步響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)提供依據(jù)。

1.3.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)為依據(jù)，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇紅曲米添加量（A）、初始糖度（B）、酵母添加量（C）3個(gè)因素為響應(yīng)變量，以模糊數(shù)學(xué)得到的感官評(píng)分為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken 方案設(shè)計(jì)的因素及水平編碼Table 1 Factors of Box-Behnken scheme design and horizontal coding

1.3.3 模糊數(shù)學(xué)綜合評(píng)價(jià)

設(shè)柿酒的評(píng)價(jià)因素集合為U=（u1，u2，u3，u4），u1、u2、u3、u4 分別代表產(chǎn)品的色澤、香氣、余味、口感；設(shè)柿酒的評(píng)價(jià)評(píng)語(yǔ)集合為V=（v1，v2，v3，v4）=（95，80，65，40），v1、v2、v3、v4 分別代表優(yōu)、良、中、差4 個(gè)等級(jí)，每個(gè)等級(jí)分別對(duì)應(yīng)95、80、65、40 分。權(quán)重集合表示各評(píng)價(jià)因素的重要程度，通過(guò)采用強(qiáng)制對(duì)比法確定產(chǎn)品的權(quán)重 集 合W=（w1，w2，w3，w4）=（0.20，0.25，0.35，0.20），即色澤、香氣、余味、口感，分別占比0.20、0.25、0.35、0.20。

由10 名評(píng)價(jià)人員按表2 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。模糊關(guān)系綜合評(píng)價(jià)結(jié)果：Yi=aRi，其中a 為權(quán)重集，Yi為評(píng)價(jià)得分，Ri為評(píng)判矩陣。

1.3.4 理化指標(biāo)測(cè)定方法

可溶性固形物（殘?zhí)橇浚┯檬殖痔嵌葍x測(cè)定；酒精度：分光光度法[5]；還原糖：二硝基水楊酸法[6]；總酸：酸堿滴定法[6]。

1.3.5 揮發(fā)性成分分析

用頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase microex－tr-action，HS-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）測(cè)定紅曲柿酒中的揮發(fā)性成分[7]。

表2 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Criteria for sensory evaluation

GC 條件：DB-WAX 色譜柱（60m×0.25mm×0.5μm），載氣為氦氣（He），流速19 mL/min；進(jìn)樣口溫度為230 ℃，采用程序升溫，起始溫度為60 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至160 ℃保持1 min，以10 ℃/min 升至230 ℃保持1 min。MS 條件：電子電離（electronic ionization，EI），電子能量70eV，離子源溫度為230℃，連接桿溫度150 ℃。采用全掃模式收集信號(hào)，掃描范圍33 m/z～550 m/z。使用NIST14 質(zhì)譜庫(kù)檢索進(jìn)行定性分析，面積歸一化法進(jìn)行定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，SPSS20.0 用于數(shù)據(jù)分析，Origin8.5 用于數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲柿酒釀造工藝單因素分析

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間的確定

發(fā)酵時(shí)間對(duì)柿酒品質(zhì)的影響見(jiàn)圖1。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)柿酒品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the quality of persimmon wine

如圖1 可知，酒精度與發(fā)酵時(shí)間呈正相關(guān)，還原糖和可溶性固形物與發(fā)酵時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，總酸在0～12 d的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)先升高后降低，而后逐漸趨于穩(wěn)定。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間在2 d～6 d 時(shí)，酒精度增長(zhǎng)速度最快，還原糖、可溶性固形物含量下降速度最快。由此可推測(cè)0～2 d期間，發(fā)酵體系中的菌株處在適應(yīng)新環(huán)境階段，生長(zhǎng)緩慢，糖的消耗也較慢，酒精生成量較少，導(dǎo)致產(chǎn)酸量增加，此階段為適應(yīng)期；2 d～8 d 期間，發(fā)酵微生物迅速增長(zhǎng)，糖迅速被利用，酒精生成速率快，4 d 之后總酸含量開(kāi)始降低；8 d～12 d 期間，酵母菌生長(zhǎng)基本停止，酒精生成速率變慢，糖基本沒(méi)有消耗，總酸趨于穩(wěn)定[8]，因此，發(fā)酵時(shí)間確定為8 d 左右。

2.1.2 紅曲添加量對(duì)發(fā)酵品質(zhì)的影響

紅曲添加量對(duì)柿酒品質(zhì)的影響見(jiàn)圖2。

圖2 紅曲添加量對(duì)柿酒品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of added quantity of red koji on the quality of persimmon wine

紅曲米中的紅曲霉菌、發(fā)酵用酶[9]、活性物質(zhì)、紅曲色素[10]等對(duì)紅曲柿酒的質(zhì)量有直接的影響。由圖2可知，紅曲添加量與柿酒還原糖含量呈負(fù)相關(guān)，與酒精度呈正相關(guān)。添加紅曲后，酒精度最大可增加到13%vol 左右，原因可能是紅曲米中的糖化酶可催化糖化速率，糖化后降低了酒醪中還原糖的濃度，從而減輕高滲透壓對(duì)酵母生長(zhǎng)及發(fā)酵產(chǎn)酒精的抑制[11]；紅曲添加量越多，還原糖消耗越快，還原糖降低可推測(cè)是酵母生長(zhǎng)消耗、紅曲霉生長(zhǎng)消耗、糖化酶糖化反應(yīng)同時(shí)作用的結(jié)果；隨著紅曲添加量增多，可溶性固形物消耗加快，2 d～6 d 消耗速率最大。在紅曲添加量達(dá)到2%以上時(shí)，8 d 左右基本達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)（可溶性固形物減少緩慢），而不加紅曲的柿酒在10 d之后初始糖度仍在8%以上，發(fā)酵仍在進(jìn)行，因此可得添加紅曲可以有效提高發(fā)酵速率，增加可溶性糖利用率。因而，初步確定發(fā)酵時(shí)添加紅曲的適宜量為3%左右。

2.1.3 酵母添加量對(duì)發(fā)酵品質(zhì)的影響

酵母添加量對(duì)柿酒品質(zhì)的影響見(jiàn)圖3。

圖3 酵母添加量對(duì)柿酒品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of yeast addition on the quality of persimmon wine

酵母接種量的多少，直接影響酒體酒精含量風(fēng)味品質(zhì)[12]。如圖3 所示，隨著酵母菌添加量的增加，酒精含量呈先升高后下降的趨勢(shì)，還原糖含量略有下降。酵母通過(guò)無(wú)氧呼吸產(chǎn)生酒精，隨著酵母添加量的增多，酒精含量升高，產(chǎn)酸量下降；而當(dāng)酵母菌添加量過(guò)多時(shí)，酵母菌自身進(jìn)行過(guò)度繁殖將消耗原料中大量的營(yíng)養(yǎng)成分，使糖度降低，酒精生成量減少，總酸含量略微上升。酵母添加量對(duì)柿酒成品品質(zhì)影響很大，添加酵母過(guò)多時(shí)，會(huì)導(dǎo)致酒體發(fā)酵劇烈，影響酒體口感；而酵母添加量過(guò)低時(shí)，環(huán)境中酵母數(shù)過(guò)少，發(fā)酵不徹底，導(dǎo)致酒精度偏低，還會(huì)引起雜菌生長(zhǎng)導(dǎo)致酒的品質(zhì)降低[13]，綜合考慮，酵母添加量應(yīng)在250 mg/kg～350 mg/kg。

2.1.4 初始糖度對(duì)發(fā)酵品質(zhì)的影響

初始糖度對(duì)柿酒品質(zhì)的影響見(jiàn)圖4。

圖4 初始糖度對(duì)柿酒品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of initial sugar content on the quality of persimmon wine

由圖4 試驗(yàn)結(jié)果可知：隨著發(fā)酵體系中初始糖度的提高，酒精含量先增大而后趨于平緩，還原糖、可溶性固形物含量升高，總酸含量影響不顯著（P ＞0.05）。初始糖度超過(guò)20%后，糖分未能被完全利用，酒精度不再繼續(xù)上升，造成發(fā)酵體系中還原糖、可溶性固形物含量偏高。當(dāng)初始糖度過(guò)低時(shí)，會(huì)使紅曲柿酒酒精度偏低，發(fā)酵風(fēng)味不突出，而初始糖度過(guò)高則會(huì)造成殘?zhí)沁^(guò)多，口味過(guò)甜，影響感官。由初始糖度單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，較優(yōu)初始糖度為20%。

2.1.5 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵品質(zhì)的影響

發(fā)酵溫度對(duì)柿酒品質(zhì)的影響見(jiàn)圖5。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)柿酒品質(zhì)的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on the quality of persimmon wine

發(fā)酵溫度是影響柿酒品質(zhì)的一個(gè)主要因素。由圖5可見(jiàn)，隨著發(fā)酵溫度的升高，產(chǎn)酒精速率隨之加快，總酸含量升高，還原糖含量降低。溫度過(guò)高會(huì)使酵母的代謝增快，加速酵母的衰亡，并且也不利于紅曲霉的生長(zhǎng)，導(dǎo)致主發(fā)酵的時(shí)間縮短；而在較低溫度下，酵母、紅曲霉等代謝速率低，不會(huì)有明顯的旺盛發(fā)酵階段[14]，不利于酒精以及風(fēng)味成分的形成。雖然適當(dāng)?shù)蜏乜梢宰璧K醋酸菌、乳酸菌以及雜菌的過(guò)度生長(zhǎng)，從而起到降酸的作用[15-16]，但溫度過(guò)低，會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵不完全，殘?zhí)呛窟^(guò)高等問(wèn)題。當(dāng)溫度在20 ℃～24 ℃時(shí)，紅曲柿酒產(chǎn)酒精速率較為理想，在第8 天發(fā)酵基本終止（酒精度不再上升），還原糖、總酸含量趨于穩(wěn)定，因此確定20 ℃～24 ℃為適宜發(fā)酵溫度。

2.2 基于模糊數(shù)學(xué)感官評(píng)價(jià)的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

按1.3.3 中方法計(jì)算感官評(píng)分，作為響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)回歸模型的建立，得到紅曲柿酒感官評(píng)分多元二次回歸方程：Y=84.06+2.59A+1.20B-0.16C-0.53AB+1.19AC-1.07BC-6.50A2-1.86B2-0.30C2。

由表4 可知，失擬項(xiàng)不顯著（P=0.776 8 ＞0.05），感官評(píng)分所選模型極顯著（P ＜0.01）；在模型的一次項(xiàng)中，紅曲添加量（A）對(duì)感官評(píng)分影響極顯著（P＜0.01），初始糖度（B）對(duì)感官評(píng)分影響為顯著（P＜0.05）；二次項(xiàng)中，A2對(duì)紅曲柿酒感官評(píng)分影響極顯著（P ＜0.01），B2對(duì)感官評(píng)分影響顯著（P＜0.05）。3 種因子對(duì)紅曲柿酒感官評(píng)分的影響程度依次為：紅曲米添加量（A）＞初始糖度（B）＞酵母添加量（C）。

表3 紅曲柿酒響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Response surface methodology design and results of hongqu persimmon wine

由表4 可知，多元二次回歸方程的因變量和自變量之間的線(xiàn)性關(guān)系良好（R2=0.954 0），說(shuō)明該模型可解釋紅曲柿酒中95.4%的響應(yīng)值變化，且變異系數(shù)較低（C.V=1.73%），試驗(yàn)重現(xiàn)性較好。

以感官評(píng)分為響應(yīng)值，最佳發(fā)酵條件為：紅曲添加量3.00%，初始糖度21%，酵母添加量275 mg/kg，紅曲柿酒的感官評(píng)分的理論值為84.657 分。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到最優(yōu)發(fā)酵條件下感官評(píng)分為86.542分，與理論預(yù)測(cè)值相差1.87 分，說(shuō)明參數(shù)準(zhǔn)確可靠，有一定實(shí)用價(jià)值。

表4 回歸方程方差分析Table 4 Analysis results of regression and variance

2.3 柿酒香氣成分分析

發(fā)酵8 d 后的普通柿酒和紅曲柿酒經(jīng)頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用分析后得到主要的風(fēng)味物質(zhì)，其相對(duì)含量對(duì)比結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 柿酒揮發(fā)性成分分析結(jié)果Table 5 Results of analysis of volatile components in persimmon wine

續(xù)表5 果酒揮發(fā)性成分分析結(jié)果Continue table 5 Results of analysis of volatile components in persimmon wine

紅曲柿酒共檢測(cè)出45 種揮發(fā)性物質(zhì)，其中酯類(lèi)27 種，醇類(lèi)4 種，酸類(lèi)7 種，其它類(lèi)7 種。普通柿酒中共檢測(cè)出23 種，其中酯類(lèi)8 種，醇類(lèi)3 種，酸類(lèi)5 種，其它類(lèi)物質(zhì)7 種。兩種果酒相比，添加紅曲后柿酒風(fēng)味物質(zhì)的種類(lèi)增加，特別是酯類(lèi)物質(zhì)。

紅曲柿酒中酯類(lèi)化合物種類(lèi)最多，醇類(lèi)化合物、酸類(lèi)化合物其次，醛酮類(lèi)化合物最少。酯類(lèi)物質(zhì)由高級(jí)醇和脂肪酸在酶的催化作用下形成，是紅曲柿酒中種類(lèi)最多的香氣物質(zhì)，這些物質(zhì)使酒具有果香、花香、蜂蜜香、乳香等，增加了酒體的復(fù)雜性、多樣性和愉悅性。酯類(lèi)物質(zhì)中，以乙酸乙酯、棕櫚酸乙酯、月桂酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯為主。乙酸乙酯微帶果香和酒香[17]，櫚酸乙酯有蠟香和奶油的香氣是紅曲黃酒中特有的香氣物質(zhì)[18]，月桂酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯帶有花香和果香。一般的發(fā)酵果酒中不可能有如此高含量的脂肪酸[19]，推測(cè)高含量的酯類(lèi)成分可能是紅曲米中酯化酶催化相應(yīng)的脂肪酸和乙醇反應(yīng)后形成的酯，具體的形成機(jī)理，仍需要進(jìn)一步研究。

醇類(lèi)物質(zhì)也是酒中重要的香氣組成成分，適當(dāng)含量的高級(jí)醇能賦予酒體清甜的水果香，同時(shí)還是形成酯類(lèi)物質(zhì)的前體有利于紅曲柿酒特征香氣成分的形成。乙醇、苯乙醇是主要的醇類(lèi)物質(zhì)。苯乙醇具有玫瑰香與蜂蜜香，被認(rèn)為對(duì)黃酒香氣有重要影響[20]，同時(shí)苯乙醇也是水果當(dāng)中最重要的香氣成分。

酸類(lèi)物質(zhì)能與醇類(lèi)物質(zhì)反應(yīng)生成相應(yīng)的酯類(lèi)物質(zhì)，從而賦予酒體香味。棕櫚酸、乙酸、辛酸為果酒中主要的酸類(lèi)物質(zhì)，棕櫚酸具有腐敗脂肪氣味，有水果香；乙酸具有食醋內(nèi)酸味及刺激性氣味；少量辛酸有水果香氣。適量含量的酸能豐富酒的口感，提高紅曲柿酒整體協(xié)調(diào)性，過(guò)高或過(guò)低都會(huì)給酒風(fēng)味、口感帶來(lái)負(fù)面影響，適當(dāng)調(diào)整果酒的糖酸比例有助于改善果酒風(fēng)味，提高感官品質(zhì)。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化確定紅曲柿酒的最佳發(fā)酵工藝為：紅曲添加量3.00%，初始糖度21%，酵母添加量275 mg/kg，紅曲柿酒的感官評(píng)分值為86.542 分。

在上述優(yōu)化條件下，對(duì)紅曲柿酒進(jìn)行頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用（HS-SPME-GC-MS）分析，并用未加紅曲米的柿酒作為對(duì)照，結(jié)果表明，紅曲柿酒共檢測(cè)出45 種揮發(fā)性物質(zhì)，其中酯類(lèi)物質(zhì)27 種，醇類(lèi)物質(zhì)4種，酸類(lèi)物質(zhì)7 種，其它類(lèi)物質(zhì)7 種。普通柿酒中共檢測(cè)出23 種揮發(fā)性成分，其中酯類(lèi)物質(zhì)8 種，醇類(lèi)物質(zhì)3 種，酸類(lèi)5 種，其他類(lèi)物質(zhì)7 種。兩種果酒相比，添加紅曲后柿酒風(fēng)味物質(zhì)的種類(lèi)增加，特別是酯類(lèi)物質(zhì)。紅曲柿酒中含有較高含量的脂肪酸酯以及苯乙醇，這些被認(rèn)為是黃酒中的主要成分，說(shuō)明添加紅曲后柿子酒風(fēng)味結(jié)構(gòu)改變，能有效改善柿酒風(fēng)味寡淡問(wèn)題、口感不佳等問(wèn)題。