電針對(duì)T2DM胰島素抵抗大鼠肝臟血清酶學(xué)及AMPK、GLUT4表達(dá)的影響*

李秋艷，李 瑞，段浩茹，莊舒婷，郭孟瑋

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是一種慢性血脂代謝異常疾病，病理基礎(chǔ)以胰島素缺乏和胰島素抵抗(Insulin Resistance,IR)為主，由遺傳和環(huán)境等多因素共同引起[1]。糖尿病總?cè)藬?shù)的90%以上為2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus, T2DM)?！捌咸烟莻}(cāng)庫(kù)”肝臟作為胰島素作用的主要靶器官，是葡萄糖代謝及其他各種代謝的重要場(chǎng)所[2]。加強(qiáng)改善肝臟功能、增強(qiáng)肝臟細(xì)胞膜表面的受體活性及改善肝部損傷可顯著調(diào)節(jié)胰島素分泌和胰島素抵抗[3]。AST、ALT主要由肝細(xì)胞分泌，當(dāng)肝細(xì)胞損傷時(shí)，胞膜表面通透性改變，使胞漿內(nèi)ALT、AST釋放到血液中[4]，血清AST、ALT的升高水平與肝細(xì)胞受損水平呈正比關(guān)系。ALT水平能更敏感地感知肝臟是否受到損傷，其水平程度反應(yīng)了胰島素抵抗程度[5]。肝細(xì)胞中另一項(xiàng)酶學(xué)指標(biāo)GGT與ALT相比，GGT比ALT更好地預(yù)測(cè)早期糖尿病的發(fā)生[6]。AMPK作為細(xì)胞能量的感受器，它的激活可調(diào)控肝糖原合成、葡萄糖和脂肪酸等相關(guān)能量代謝通路[7],亦可調(diào)控GLUT4的表達(dá)和轉(zhuǎn)位，促進(jìn)肝糖原的攝取。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)糖尿病并發(fā)癥如心血管疾病、腎病、腦及視神經(jīng)損傷研究較為廣泛，但對(duì)肝臟相關(guān)疾病方面的研究較少，所以本課題組采取建立2型糖尿病胰島素抵抗大鼠模型的方法，研究電針對(duì)2型糖尿病胰島素抵抗大鼠狀態(tài)的影響以及肝細(xì)胞中轉(zhuǎn)氨酶水平、AMPK和GLUT4的變化，重點(diǎn)從肝臟組織角度為針刺治療胰島素抵抗的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)ZDF大鼠16只與ZL大鼠8只，北京維通利華公司提供，動(dòng)物飼養(yǎng)于23 ℃、空氣流通、相對(duì)濕度50%～70%和12 h晝夜循環(huán)光照的條件下。先普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，此期間動(dòng)物自由飲食水。適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后開(kāi)始4周誘導(dǎo)飼養(yǎng)，在誘導(dǎo)飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)干預(yù)周期中，所有動(dòng)物均用Purina #5008飼料喂養(yǎng)。

1.2 飼料與儀器

羅氏血糖儀(ACCU-CHEK Performa，羅氏血糖健康醫(yī)護(hù)公司);羅氏血糖試紙(羅氏血糖健康醫(yī)護(hù)公司);0.22 mm×13 mm無(wú)菌針灸針(北京中研太和醫(yī)療器械有限公司);電針儀;大鼠[北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006];Purina#5008飼料(美國(guó)PMI營(yíng)養(yǎng)國(guó)際有限責(zé)任公司，粗脂肪≥7.0%，粗蛋白質(zhì)≥23.5%，粗纖維≤4.0%)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大鼠模型的建立

ZDF大鼠以高糖高脂Purina#5008飼料誘導(dǎo)飼養(yǎng)4周后，以空腹血糖FBS及OGTT 2 h血糖均>11.1 mmol/L為成模標(biāo)準(zhǔn)。成模的ZDF大鼠隨機(jī)區(qū)分為兩組，模型組與電針組。8只ZL對(duì)照大鼠作為空白組。

2.2 電針治療

2.2.1 空白組與模型組 采取相同的抓取和固定方式，捆綁時(shí)間同電針組，但不采取其他任何干預(yù)。

2.2.2 電針組 將大鼠捆綁于自制的固定器中,先將大鼠靜置5 min，然后用75%的酒精對(duì)雙側(cè)“足三里”“三陰交”“脾俞”“胃脘下俞”穴消毒后進(jìn)行針刺(足三里位于大鼠后膝關(guān)節(jié)下方，腓骨頭下3 mm處的肌溝中; 三陰交位于大鼠后肢內(nèi)踝尖直上10 mm處; 脾俞位于第11胸椎棘突下旁開(kāi)7 mm處；胃脘下俞位于第8胸椎棘突下旁開(kāi)7 mm處);向下斜刺胃脘下俞穴，直刺足三里穴，深度約4 mm，采取平補(bǔ)平瀉的手法行針1 min后接通電針儀，一端連接足三里，另一端連接同側(cè)胃脘下俞，每隔1 d換另一側(cè)接電針，調(diào)節(jié)頻率15 Hz，電流強(qiáng)度為4～6 mA(大鼠肢體保持輕微抖動(dòng))，干預(yù)時(shí)長(zhǎng)20 min/次。周一至周六上午8:00開(kāi)始進(jìn)行干預(yù)，周日休息，共干預(yù)4周。

2.3 標(biāo)本采集檢測(cè)

干預(yù)4周后，于取材前1日22:00禁食過(guò)夜，可自由飲水，次日8:00以2%戊巴比妥鈉溶液按照45 mg/kg的藥量比腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血5～10 mL于離心管中，4 ℃條件下3 000 r/min離心15 min，快速分離血清，取上清以放射免疫法檢測(cè)各指標(biāo)。剪取部分肝臟組織于-80 ℃冰箱中保存，用蛋白印跡法檢測(cè)AMPK、GLUT4蛋白含量表達(dá)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 干預(yù)前后各組大鼠空腹血糖情況

在干預(yù)前，模型組空腹血糖明顯高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，電針組空腹血糖與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。干預(yù)后，模型組空腹血糖與空白組比較，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，電針組與模型組比較，空腹血糖有顯著降低，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明電針對(duì)于2型糖尿病胰島素抵抗大鼠血糖具有明顯調(diào)節(jié)作用。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠干預(yù)前后空腹血糖比較

3.2 干預(yù)后各組大鼠血清中血脂各指標(biāo)比較

干預(yù)后，模型組大鼠血清中TC、TG、HDL、LDL和vLDL較空白組大鼠均明顯上升(P<0.01)。電針組大鼠血清中TC、HDL較模型組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，電針組大鼠血清中LDL、vLDL較模型組顯著下降，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。說(shuō)明電針可改善2型糖尿病胰島素抵抗大鼠血清中TC、HDL、LDL和vLDL水平。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠干預(yù)后血清中血脂各指標(biāo)比較

3.3 干預(yù)后各組大鼠血清中胰島素INS、C-P水平及OGTT實(shí)驗(yàn)曲線下面積比較

由表3可知，干預(yù)后模型組大鼠胰島素INS、C-P水平較空白組均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，與模型組相比電針組胰島素INS水平顯著下降，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，電針組C-P水平較模型組有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；干預(yù)前后，模型組OGTT曲線下面積均高于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，干預(yù)前，電針組OGTT曲線下面積與模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明具有可比性，干預(yù)后，電針組OGTT曲線下面積與模型組相比有明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明電針可有效改善2型糖尿病胰島素抵抗大鼠血清中胰島素INS、C-P水平以及糖耐受水平，從而改善胰島素抵抗。

表3 各組大鼠干預(yù)后血清中胰島素INS、c肽水平及干預(yù)前后OGTT實(shí)驗(yàn)曲線下面積比較

3.4 干預(yù)后各組大鼠血清相關(guān)轉(zhuǎn)氨酶水平比較

如表4所示，干預(yù)后，模型組AST水平與空白組相比升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，電針組AST水平與模型組相比有下降但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型組ALT、GGT水平與空白組相比均明顯升高，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與模型組相比，電針組ALT水平有所下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，電針組GGT水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明電針可以調(diào)節(jié)2型糖尿病胰島素抵抗大鼠血清中相關(guān)轉(zhuǎn)氨酶水平，從而減少肝細(xì)胞損傷程度。

表4 各組大鼠干預(yù)后血清中相關(guān)轉(zhuǎn)氨酶水平比較

3.5 各組大鼠肝臟組織中AMPK、GLUT4含量表達(dá)差異比較

如圖1、表5所示，模型組與空白組比較，大鼠肝臟組織中AMPK、GLUT4 蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01); 電針組與模型組比較，大鼠肝臟組織中AMPK、GLUT4 蛋白表達(dá)明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明電針可以良性調(diào)節(jié)胰島素傳導(dǎo)信號(hào)通路上的關(guān)鍵分子AMPK、GLUT4蛋白含量。

圖1 各組大鼠AMPK、GLUT4蛋白表達(dá)情況

表5 各組大鼠AMPK、GLUT4 蛋白表達(dá)比較

4 討論

研究報(bào)道證實(shí)，針刺在治療T2DM中具有重要優(yōu)勢(shì)，作用機(jī)制與改善IR關(guān)系密切。針刺可以多層次多方位地有效調(diào)節(jié)糖脂代謝和激素分泌，從整體水平上改善IR[8]。肝臟是IR的起點(diǎn)，IR見(jiàn)于多種慢性肝損傷。改善IR對(duì)各類肝病的治療具有積極影響[2]。本課題組長(zhǎng)期從事于糖尿病的研究并在多年臨床中總結(jié)出電針降糖經(jīng)驗(yàn)穴組。本研究采用的電針穴位“脾俞、胃脘下俞、足三里、三陰交”在前期已被證明對(duì)T2DM有非常好的療效，“三陰交”為肝脾腎三經(jīng)的交會(huì)，“足三里”為胃經(jīng)合穴，可改善糖尿病消谷善饑癥狀，“脾俞”調(diào)節(jié)相應(yīng)的臟腑功能主運(yùn)化升陽(yáng)氣，改善機(jī)體水液代謝從而改善胰島素分泌，“胃脘下俞”是糖尿病的經(jīng)驗(yàn)穴。此4個(gè)穴位符合糖尿病“陰虛為本、燥熱為標(biāo)”的基本病機(jī)。在中醫(yī)經(jīng)典理論中2型糖尿病屬于“消渴”范疇?！鹅`樞·本臟》曰：“肝脆則善病消癉易傷”，最早論述了消渴病與肝臟具有密切關(guān)系，強(qiáng)調(diào)肝失疏泄、肝郁氣滯是消渴病重要的發(fā)病機(jī)理[9]。有臨床研究顯示，疏肝健脾、補(bǔ)益肝腎等從肝的層面治療糖尿病能改善IR、調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂[10]。糖尿病與肝病相互影響互為危險(xiǎn)因素,所以糖尿病患者應(yīng)積極關(guān)注肝臟健康。

本研究中，筆者采用高脂高糖Purina #5008飼料喂養(yǎng)全部動(dòng)物，成功建立了T2DM胰島素抵抗大鼠理想模型。由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得知，干預(yù)結(jié)束后電針組相對(duì)于模型組的空腹血糖顯著降低，表明電針可調(diào)控血糖的上升趨勢(shì)且對(duì)降糖有明確的優(yōu)勢(shì)作用。電針組大鼠干預(yù)后有效降低了TC、HDL、LDL和vLDL水平含量，對(duì)于改善糖尿病心血管并發(fā)癥有較好作用，有效改善糖脂代謝紊亂。INS、C-P均是由胰島β細(xì)胞所釋放，參與機(jī)體糖代謝過(guò)程，INS、C-P水平可反應(yīng)胰島β細(xì)胞分泌功能[11]，本研究干預(yù)后電針組INS、C-P水平均明顯下降，說(shuō)明電針能夠通過(guò)調(diào)控INS、C-P從而改善胰島β細(xì)胞分泌功能，緩解胰島素抵抗，OGTT實(shí)驗(yàn)作為診斷糖尿病的“金標(biāo)準(zhǔn)”，本實(shí)驗(yàn)OGTT曲線下面積也表明，電針組能明顯改善T2DM胰島素抵抗大鼠的糖耐受情況。胰島素發(fā)揮作用的關(guān)鍵時(shí)刻就是與靶細(xì)胞中特異受體結(jié)合，激活相關(guān)通路，使肝細(xì)胞發(fā)揮正常功能，從血液中攝取糖分保證血糖正常。故在糖尿病治療中，如肝臟發(fā)生損傷，肝臟細(xì)胞表面受體活性降低，會(huì)導(dǎo)致胰島素結(jié)合力降低。此實(shí)驗(yàn)干預(yù)后模型組大鼠血清中AST、ALT和GGT3項(xiàng)水平均明顯升高，肝細(xì)胞受損嚴(yán)重，電針組AST水平與模型組相比有所下降但差異較小無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能由于電針調(diào)控肝細(xì)胞的作用機(jī)制靶點(diǎn)不主要是AST，另一方面可能由于干預(yù)時(shí)間較短或本研究統(tǒng)計(jì)數(shù)量不夠充足。李雪等[12]通過(guò)對(duì)2402名成人體檢者的血清血脂、肝臟轉(zhuǎn)氨酶的臨床檢測(cè)得出AST對(duì)于相關(guān)肝臟疾病的反應(yīng)不如ALT、GGT靈敏。GGT是肝膽功能異常的重要指標(biāo),可作為糖耐量受損或早期糖尿病發(fā)生的關(guān)鍵獨(dú)立預(yù)測(cè)因素[13]。本研究中電針組ALT水平與模型組相比雖無(wú)差異，但比較其均值有所降低，說(shuō)明電針對(duì)ALT調(diào)控有下降趨勢(shì)，電針組GGT水平較模型組有明顯下降(P<0.05)，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)電針組顯著性的降糖結(jié)果從而驗(yàn)證了之前各項(xiàng)研究結(jié)果即對(duì)于糖代謝敏感度AST

綜上所述，電針可以有效地治療2型糖尿病，降低血糖血脂，降低相關(guān)血清酶學(xué)指標(biāo),改善胰島素信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子蛋白含量，相比于藥物的局限性和伴隨的副作用，電針具有經(jīng)濟(jì)安全幾乎無(wú)副作用的優(yōu)勢(shì)，結(jié)合此實(shí)驗(yàn)中降糖穴的優(yōu)勢(shì)穴組加辨證論治，可更好地應(yīng)用于臨床。但因?yàn)樘悄虿“l(fā)生胰島素抵抗是一種慢性代謝性疾病，肝臟作為參與各種代謝的樞紐，預(yù)測(cè)糖尿病發(fā)生最敏感的器官之一，本實(shí)驗(yàn)只有轉(zhuǎn)氨酶酶學(xué)指標(biāo)及1條信號(hào)通路AMPK、GLUT4的研究，肝細(xì)胞中還可能存在其他靶點(diǎn)改善肝臟損傷，后續(xù)筆者將會(huì)進(jìn)行更深入的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)探討糖尿病代謝性疾病的發(fā)展中肝細(xì)胞形態(tài)及肝細(xì)胞內(nèi)其他胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路等的變化,以便更好地指導(dǎo)臨床實(shí)踐。