海口市美蘭區(qū)畜禽生鮮肉沙門氏菌分離及耐藥性分析

郭定乾，羅 瑛，洪 楓，滿初日嘎

（海南大學 動物科技學院，?？?570228）

沙門氏菌（Salmonella）為腸桿菌科沙門氏菌屬成員，具有極其廣泛的動物宿主，是一種常見的人畜共患病食源性病原體，主要寄生在人和動物體腸道內(nèi)，通過多種方式與微生物競爭，破壞微生物區(qū)系平衡，最終引發(fā)腹瀉、腸炎等疾?。欢抽T氏菌致病因子鞭毛和脂多糖等也可誘導炎癥的產(chǎn)生[1]。雞肉是沙門氏菌感染人的主要媒介之一，在屠宰前雞的沙門氏菌攜帶率為3%～4%，離開屠宰場時雞肉沙門氏菌污染率達到35%[2]。對于豬肉而言，沙門氏菌存在于豬養(yǎng)殖的各個階段，尤其是在屠宰后貯藏和銷售過程中豬肉極易被沙門氏菌污染，檢出率也較高[3]。而由肉類沙門氏菌引發(fā)的人體食物中毒現(xiàn)象層出不窮，此菌也是報道最為頻繁的食源性致病菌之一。近幾年，四川[4]、江蘇[5]、寧夏[6]、上海[7]、重慶[8]等地己報道了多起由于沙門氏菌導致的食物中毒事件，而全球每年更是有過億人口感染沙門氏菌。由此可見，沙門氏菌對常見肉類的污染從而對食品安全構(gòu)成了較大威脅。沙門氏菌可以通過飼料原料、生產(chǎn)設(shè)備、鼠和墊料等介質(zhì)傳播，因此飼料原料的把控、嚴格的生物安全措施、畜舍衛(wèi)生的加強、垂直傳播的控制等是目前預防沙門氏菌感染的主要措施。

海南屬于熱帶季風氣候，年平均氣溫較高（23～26 ℃）且常年降水充沛，此高溫濕潤環(huán)境非常適合細菌等微生物的生長和繁衍，而生鮮肉也為微生物的繁殖提供了良好溫床[9]，由此導致海南地區(qū)市場售賣生鮮肉感染沙門氏菌概率較高。目前，尚未有關(guān)海南?？诘貐^(qū)市場生鮮肉感染沙門氏菌的相關(guān)調(diào)查或檢測報告。因此，本研究選取?？谑忻捞m區(qū)大型農(nóng)貿(mào)市場和超市為采樣點，評估市場室內(nèi)、外環(huán)境下豬肉和禽類肉品感染沙門氏菌的情況，旨在為預防?？诒镜厣抽T氏菌引起的食源性疾病提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料按簡單隨機抽樣原則采集生鮮肉樣，分別于2019 年3 月至5 月從海口市美蘭區(qū)大型農(nóng)貿(mào)市場室內(nèi)、室外采集樣本共50 份，樣品信息詳見表1。每次取2 份平行樣，分別放于2 支無菌袋中，2 h內(nèi)低溫運回實驗室進行下一步處理。

1.2 細菌培養(yǎng)基緩沖蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸鈉煌綠增菌液（TTB）、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、HE 瓊脂培養(yǎng)基（HE）、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基（TSI）、動力?吲哚?尿素基礎(chǔ)培養(yǎng)基（MIU）和革蘭氏染色液等試劑購于青島海博生物技術(shù)有限公司；亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基（BS）購于杭州微生物試劑有限公司。

表1 生鮮肉樣品信息Tab.1 Samples of meats collected

1.3 藥敏紙片藥敏實驗抗生素（購于杭州微生物試劑有限公司）按化學成分分為青霉素類：青霉素（Penicillin）、阿莫西林（Amoxicillin）、氨芐西林（Ampicillin）；頭孢菌素類：頭孢拉定（cephradine）；氨基糖苷類：卡那霉素（Kanamycin）、慶大霉素（Gentamicin）、鏈霉素（streptomycin）；四環(huán)素類：多西環(huán)素（doxycycline）、四環(huán)素（Tetracycline）；酰胺醇類：氯霉素（chloramphenicol）、氟苯尼考（Florfenicol）；大環(huán)內(nèi)酯類：紅霉素（Erythromycin）、吉他霉素（kitasamycin）；喹諾酮類：諾氟沙星（Norfloxacin）、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin）；磺胺類：磺胺異噁唑（Sulfisoxazole）。

1.4 菌株分離純化本研究樣品參照按照國標GB4789.4—2016 方法進行操作：在超凈工作臺中剪取每個樣本5 g，置于盛有45 mL BPW 的無菌三角瓶中，以1 000～1 300 r·min?1均質(zhì)1～2 min，振蕩混勻后37 ℃培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)后的BPW 前增菌液樣本混合均勻，取1 mL 菌液置于TTB 增菌液中，恒溫（37 ℃）振蕩培養(yǎng)18～24 h。隨后挑取菌落在HE 和BS 瓊脂培養(yǎng)基中進一步培養(yǎng)18～24 h，隨后觀察培養(yǎng)基上是否產(chǎn)生了黑色、有金屬光澤的疑似沙門氏菌菌落，并將可疑菌落接種于BS 瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，再次觀察BS 瓊脂平板是否產(chǎn)生了單個疑似沙門氏菌菌落，若無則繼續(xù)純化培養(yǎng)至有上述描述菌落為止。將純化的菌落挑至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，用于后續(xù)實驗。

1.5 生化鑒定挑取純化后獲得的單個菌落，在超凈工作臺上均勻涂布在滴有生理鹽水無菌載玻片上，進行革蘭氏染色，鏡檢觀察可疑菌落菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.6 PCR 鑒定選擇沙門氏菌保守基因invA設(shè)計引物序列（F5′-AAACCTAAAACCAGCAAAGG -3′；5′-TGTACCGTGGCATGTCTGAG-3′）[10]，目的片段大小605 bp。采用菌落PCR 擴增反應(yīng)，體系為：2×PCR預混液12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL、菌液2 μL，ddH2O 8.5 μL，共計25 μL。PCR 反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30 個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取5 μL PCR 產(chǎn)物，經(jīng)w=1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因片段擴增情況，PCR 產(chǎn)物進行測序（生工生物工程上海股份有限公司）。

1.7 藥敏試驗按WHO 提供的Kindy-Bauer 紙片擴散方法進行，以抑菌圈的大小作為評定沙門菌株對藥物敏感度強弱的依據(jù)，藥敏結(jié)果判斷依據(jù)NCCLS2010 年標準。挑選PCR 鑒定為沙門氏菌的菌液，接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中37 ℃ 培養(yǎng)18 h，輕搖0.5 號麥氏濁度標準管，將液體培養(yǎng)物加入無菌試管中，并加入無菌生理鹽水，直到濃度與0.5 號麥氏濁度標準管濃度相同，菌液密度約為1.5×108cfu·mL?1，取1 mL 菌液滴加在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上并涂布均勻，37 ℃下培養(yǎng)24 h，每個培養(yǎng)皿貼上4 種不同藥敏片，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)基里紙片藥敏圈大小并記錄直徑。

1.8 耐藥基因PCR 檢測3 種耐藥基因（qurB，sul2，tetA）引物序列分別為qurB：F 5′-GATCGTGAAA GCCAGAAAGG -3′，R 5′-ACGATGCCTGGTAGTTGTCC -3′，目的條帶大小為469 bp；sul2：F5′-GCGC AGGCGCGTAAGCTGAT-3′，R 5′-CGAAGCGCAGCCGCAATTC-3′，目的條帶大小為514 bp；tetA：F5′-GCTACATCCTGCTTGCCTTC-3′，R5′-CATAGATCGCCGTGAAGAGG-3′，目的條帶大小為210 bp[10]。對鑒定為沙門氏菌的樣本菌株進行菌落PCR 擴增反應(yīng)，體系為2×PCR 預混液12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL、模板DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL，共計25 μL。PCR 產(chǎn)物進行w=1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因片段擴增情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙門氏菌分離及生化試驗結(jié)果如圖1 所示，BS 瓊脂平板上疑似沙門氏菌的單個菌落，革蘭氏染色后鏡檢結(jié)果顯示菌體形態(tài)為短棒狀的革蘭氏陰性菌，初步判斷39 份樣本分離到了疑似菌株。

圖1 BS 培養(yǎng)基可疑菌落革蘭氏染色8、10、16、29 為分離菌株編號。Fig.1 Gram staining of suspicious colonies in BS mediumStrain number: 8、10、16、29.

將樣本進行進一步TSI 接種培養(yǎng)，結(jié)果顯示（表2），50 株分離菌株樣本中檢測出17 株非沙門氏菌，33 株為疑似沙門氏菌。從表3 可知，MIU 瓊脂反應(yīng)現(xiàn)象觀察統(tǒng)計50 株分離菌株樣本中檢測出13 株非沙門氏菌，37 株為疑似沙門氏菌。

表2 三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基菌群培養(yǎng)Tab.2 Triple sugar iron agar medium culture of isolates

表3 沙門氏菌分離株生化反應(yīng)鑒定Tab.3 Biochemical identification of Salmonella isolates

2.2 PCR 擴增電泳以invA毒力基因為靶基因PCR 擴增產(chǎn)物的部分電泳結(jié)果見圖2，605 bp 位置有條帶可判定為陽性，即該菌為沙門氏菌。從圖2 中可知，50 份樣本中4 份為陽性，編號為8，10，16，29，P 為陽性樣本，為實驗室保存的鼠傷寒沙門氏菌CMCC 50 013 DNA 樣。根據(jù)以上實驗結(jié)果，在海口美蘭區(qū)海甸島農(nóng)貿(mào)市場選取的50 份樣本豬肉和雞鴨肉樣本中，4 份檢出陽性，總陽性檢出率為8%，雞肉檢出率8.33%，鴨肉檢出率25%，豬肉檢出率3.33%，室內(nèi)檢出率2.56%，室外檢出率9.1%（表4）。

圖2 沙門氏菌分離株invA 靶基因PCR 擴增結(jié)果陽性為陽性對照鼠傷寒沙門氏菌（CMCC 50013）。Fig.2 Electrophoretic detection of target gene invA from Salmonella isolatesPositive of standard Salmonella typhimurium (CMCC 50013).

表4 生鮮肉樣本沙門氏菌檢出數(shù)Tab.4 Salmonella detection of meat samples

表5 Kindy-Bauer 法藥敏實驗Tab.5 Kindy-Bauer antibiotic resistance test

2.3 藥敏試驗反應(yīng)分析結(jié)果分離沙門氏菌菌株進行16 種抗生素藥物敏感實驗結(jié)果見表5。從表5 可知，除環(huán)丙沙星外，4 株沙門氏菌對其他抗生素呈現(xiàn)出不同耐藥性。其中，4 株菌株對青霉素、氨芐西林、四環(huán)素和吉他霉素產(chǎn)生完全耐藥性，耐藥率為100%；4 株菌株中有3 株對氯霉素、阿莫西林和磺胺異噁唑產(chǎn)生完全耐藥，耐藥率為75%；4 株中有2 株對多西環(huán)素、紅霉素、卡那霉素、諾氟沙星和鏈霉素產(chǎn)生完全耐藥，耐藥率為50%；4 株菌株中有1 株對頭孢拉定和慶大霉素產(chǎn)生完全耐藥，耐藥率為25%。

2.4 耐藥基因PCR 鑒定以qurB、tetA和sul2耐藥基因為靶基因進行PCR 擴增鑒定，判定沙門氏菌的該種類耐藥基因?qū)ο鄳?yīng)藥物的耐藥性。其中，4 株沙門氏菌（菌株編號為8、10、16、29）對磺胺類藥物耐藥基因sul2和喹諾酮類耐藥基因qurB基因檢出率為0；而有2 株菌株（菌株編號為16、29）檢出四環(huán)素類耐藥基因tetA。

3 討 論

沙門氏菌常存在于禽畜肉類及其制品中，人食用后可引發(fā)嘔吐、腹瀉等食物中毒癥狀。本研究結(jié)果顯示，50 份豬肉及雞鴨禽類樣本中有4 份檢出陽性，總檢出率為8%，其中，禽類檢出率為15%，豬肉檢出率3.33%。彭峻烽等[11]對成都地區(qū)343 份鴨源樣本檢測結(jié)果顯示沙門氏菌的分離率為28.86%；宋晟等[12]在長沙地區(qū)市場上采集的豬肉和雞肉樣本中沙門氏菌的檢出率分別為83.8%和78.9%；郭耀東等[13]的檢測結(jié)果表明，西安地區(qū)白條雞在銷售環(huán)節(jié)樣品中沙門氏菌的檢出率為18.75%；王瑩等[14]在長春市售豬肉雞肉中檢出沙門氏菌比例為16.84%。此外，亞洲其他國家如泰國、馬來西亞以及歐洲、非洲等其他地區(qū)近年也有在畜禽類產(chǎn)品中檢測到沙門氏菌的報道[15?18]。由此可見，畜禽肉類生鮮產(chǎn)品存在的沙門氏菌污染情況在世界范圍內(nèi)依舊普遍。而本研究中，沙門氏菌檢出率較低的原因可能是樣品量來源于局部區(qū)域且數(shù)量較少，也與不同地區(qū)沙門氏菌流行情況不同有關(guān)。本研究結(jié)果同時顯示，4 例檢出樣本中3 例是室內(nèi)樣本。因此，在室內(nèi)情況下人口密度大、環(huán)境較封閉、局部溫度高，細菌更易生存與繁殖。

目前，畜牧養(yǎng)殖過程中抗生素依舊是治療動物沙門氏菌等病菌感染的主要藥物，抗生素的廣泛使用也導致沙門氏菌耐藥范圍逐漸擴大、耐藥程度逐漸增加，對于預防和治療相關(guān)疾病帶來極大挑戰(zhàn)[19]。本研究藥敏試驗結(jié)果顯示，樣品中分離的沙門氏菌對青霉素、氨芐西林、四環(huán)素、氯霉素、阿莫西林、磺胺異噁唑和吉他霉素具有很高的耐藥性，而對頭孢拉定、慶大霉素和環(huán)丙沙星不敏感，且對紅霉素、卡那霉素、諾氟沙星和鏈霉素等也具有一定敏感性，4 株菌的耐藥譜達到10 余種，因此具有多種耐藥性。黃裕等[20]對深圳市畜禽產(chǎn)品中分離的沙門氏菌菌株進行藥敏試驗的結(jié)果顯示，70 株沙門氏菌有24 種多重耐藥譜，全部菌株對頭孢唑啉、阿米卡星和慶大霉素耐藥，對厄他培南、亞胺培南和美洛培南敏感。杜雄偉等[21]對大連市零售豬肉中分類的沙門氏菌檢測發(fā)現(xiàn)其對硫酸慶大霉素、鹽酸諾氟沙星、氟苯尼考和鹽酸環(huán)丙沙星、阿莫西林、頭孢噻吩、頭孢噻肟、氨芐西林等均有耐藥性，共產(chǎn)生10 種耐藥譜。可見不同地區(qū)畜禽鮮肉中感染的沙門氏菌均具有較強的耐藥性。本實驗對分離的沙門氏菌株分別進行磺胺類（qurB）、四環(huán)素類（tetA）和喹諾酮類（sul2）耐藥基因檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只存在tetA耐藥基因。李少博等[22]認為，食源性沙門氏菌的耐藥性是由于編碼沙門氏菌某些成分的基因發(fā)生突變而造成的，而抗性基因的嵌入以及通過基因的轉(zhuǎn)移也能導致細菌耐藥性不斷增強。因此，檢測食源沙門氏菌的耐藥性有助于全面掌握耐藥性的流行規(guī)律，為抗菌藥物預警制度和遏制耐藥性產(chǎn)生措施的建立和實施提供科學合理的依據(jù)。益生元、益生素、植物提取物（中草藥）以及有機酸等通過改善腸道菌群結(jié)構(gòu)及微生態(tài)環(huán)境從而對沙門氏菌的增殖起到一定的抑制作用，也在一定程度上能夠逐漸解決抗生素使用而產(chǎn)生的細菌抗藥性問題[23?24]。

目前，海南省海口市美蘭區(qū)市場生鮮肉感染沙門氏菌的情況并不普遍，但分離得到的菌株具有較強的耐藥性，可能在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中存在抗生素使用的情況，相關(guān)部門應(yīng)加強養(yǎng)殖過程中抗生素濫用的監(jiān)管。同時，應(yīng)重視畜禽動物養(yǎng)殖、屠宰、運輸、加工、貯存及銷售等環(huán)節(jié)的管理，明確海南市售生鮮肉沙門氏菌易感來源及關(guān)鍵環(huán)節(jié)，并進行針對性的防控；監(jiān)管部門應(yīng)對生鮮肉流通過程中所處環(huán)境進行監(jiān)督, 督促相關(guān)人員對有關(guān)環(huán)節(jié)進行消毒和滅菌工作, 防止交叉感染, 降低沙門氏菌污染機率，以降低其感染人的風險，保證消費者的健康和安全。