飲用水中銅綠假單胞菌檢測結(jié)果的 不確定度評定

◎ 田 浩，李光耀，張 凡，王 杰，史笑娜，馬驍杰，楊少淼

（1.河北東淼檢測科技股份有限公司，河北 保定 071000；2.河北納微環(huán)境檢測有限公司，河北 保定 071000）

2015 年5 月實施的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 包裝飲用水》（GB 19298—2014）中增加了銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）限量，而不再使用傳統(tǒng)的菌落總數(shù)指標(biāo)對包裝飲用水的衛(wèi)生情況進(jìn)行評價。根據(jù)國內(nèi)外的研究情況，Nagaveni 等在匈牙利國內(nèi)492 份成品水中的7 份檢出銅綠假單胞菌，該菌的污染率為1.4%[1]；魏磊等在中國9 個省36 家水廠采集的108 個包裝飲用水樣品中銅綠假單胞菌的污染率達(dá)到了5.6%[2]。

銅綠假單胞菌分布廣泛，對有機(jī)營養(yǎng)要求較低，對不良環(huán)境抵抗力強，世界衛(wèi)生組織（WHO）將其列為人類皮膚污染指示菌；HACCP（Hazard Analysis Critical Control Point）評估明確指出其是嬰兒瓶裝飲用水的危害指示菌，可造成嬰兒腹瀉[3]。由此可知，生活飲用水中的銅綠假單胞菌是一種污染率較高、危害較為嚴(yán)重的衛(wèi)生指示菌。

《檢測和校準(zhǔn)實驗室能力的通用要求》（ISO/IEC17025：2005）明確要求認(rèn)可實驗室需評定和報告測量不確定度[4]；《測量不確定度的要求》（CNAS-CL07：2011）中明確要求“實驗室應(yīng)有能力對每一項有數(shù)值要求的測量結(jié)果進(jìn)行測量不確定度評定”[5]；CMA（China Metrology Accreditation）評審依據(jù)的《檢驗檢測機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定評審準(zhǔn)則》明確要求“檢驗檢測機(jī)構(gòu)應(yīng)根據(jù)需要建立和保持應(yīng)用評定測量不確定度的程序”[6]。近年來，食品檢測領(lǐng)域的第三方實驗室發(fā)展加速，不確定度評定作為保證數(shù)據(jù)質(zhì)量、規(guī)范檢測行為的重要手段逐漸受到各方的重視。在實踐中，微生物檢測數(shù)據(jù)出現(xiàn)臨界值、不符值等非正常值時，正確評定不確定度可以保證檢測結(jié)果的科學(xué)性和公正性[7]。但由于生物學(xué)科本身分散性較強和不易度量的特點，不確定度評定的應(yīng)用仍主要存在于非生物類實驗中。

為探索有效、簡便、適用的微生物實驗不確定度評定方案，本研究針對包裝飲用水中銅綠假單胞菌檢測結(jié)果的不確定度進(jìn)行評定。首先分析不確定度產(chǎn)生來源并分別計算不同分量產(chǎn)生的不確定度，而后得出合成不確定度和擴(kuò)展不確定度，最后折算回檢測結(jié)果，得到報告范圍。

1 材料與方法

1.1 材料

參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》（GB 4789.28—2013）附錄D 要求采用標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 27853 銅綠假單胞菌，自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購買[8]。本研究采用三代生長期標(biāo)準(zhǔn)菌株。

包裝飲用水樣品（批號：20170325），自保定市場采購買。使用1.1 中的標(biāo)準(zhǔn)菌株對包裝飲用水樣品進(jìn)行人工污染。

1.2 儀器與試劑

3M Petrifilm 致病菌測試紙（環(huán)凱微生物科技有限公司）、滅菌精密250 mL 玻璃量筒（易購安（北京）科技有限公司）、0.1 ℃ ZHSY恒溫培養(yǎng)箱（三洋電機(jī)（中國）有限公司）、ZF-20C 紫外燈（上海楚柏實驗室設(shè)備有限公司）、0.45 μm 無菌濾膜（杭州盈天科學(xué)儀器有限公司）、100×顯微鏡（株式會社日立制作所）、BCD-610W 冰箱（羅伯特·博世有限公司）以及BHC-1300IIA/B2生物安全柜（蘇州凈化設(shè)備有限公司）。

假單胞菌瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基/CN 瓊脂（編號：20170112F）、金氏B（King’s B）培養(yǎng)基（編號：20170112）、乙酰胺液體培養(yǎng)基（編號：20170119）、綠膿菌素測定用培養(yǎng)基（編號：160919）、營養(yǎng)瓊脂（編號：20160115）、氧化酶試劑（編號：20160824）以及鈉氏試劑（編號：20170112）。

1.3 方法

按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗方法》（GB 8538—2016）中銅綠假單胞菌[9]的要求進(jìn)行檢測，得到原始數(shù)據(jù)。量取250 mL 水樣，0.45 μm無菌濾膜過濾，將濾膜移至CN 瓊脂培養(yǎng)基上，于（36±1）℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；可疑菌落分別計數(shù)并進(jìn)行確證性實驗，確證標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 確證性實驗表

最后進(jìn)行結(jié)果報告，計算每250 mL 水樣中的銅綠假單胞菌數(shù)量，結(jié)果以CFU/250 mL 計。結(jié)果按式（1）進(jìn)行計算：

式（1）中，P-呈藍(lán)/綠色的菌落數(shù)；F-顯熒光的菌落數(shù)；cF-產(chǎn)氨陽性的顯熒光菌落數(shù)；nF-進(jìn)行產(chǎn)氨測試的顯熒光菌落數(shù)；R-呈紅褐色的菌落數(shù)；cR-產(chǎn)氨、氧化酶、金氏B 培養(yǎng)基上顯熒光測試均呈陽性的紅褐色菌落數(shù)；nR-進(jìn)行產(chǎn)氨、氧化酶、金氏B 培養(yǎng)基上顯熒光測試的紅褐色菌落數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

設(shè)水樣中銅綠假單胞菌檢測結(jié)果為T，檢測結(jié)果為X，則T=XCFU/250 mL。

1.4.1 不確定度的來源

和一般測量相比較，樣品中微生物測量的結(jié)果特點是發(fā)散性極大[10]。在微生物檢驗中，樣品重復(fù)測量帶來的不確定度是影響檢驗結(jié)果準(zhǔn)確度的主要原因[11]。除此之外，微生物分布、環(huán)境條件、樣品稱量、成品培養(yǎng)基批次、樣品過濾和人員因素均能導(dǎo)致不確定度，其中能夠直接影響檢測準(zhǔn)確度并可以進(jìn)行不確定度評價的為樣品稱量方面和樣品重復(fù)測量方面，重復(fù)測量帶來的不確定度占主要部分。

1.4.2 不確定度的評定方法

根據(jù)對銅綠假單胞菌檢測過程中不確定度的來源進(jìn)行的分析，同時結(jié)合微生物檢測的學(xué)科特點，本研究采用B 類不確定度的統(tǒng)計方法評定樣品稱量環(huán)節(jié)產(chǎn)生的不確定度，采用A 類不確定度的統(tǒng)計方法來評定樣品重復(fù)測量環(huán)節(jié)產(chǎn)生的不確定度。

本研究采用人工污染樣品的方式來模擬實際樣品的檢測，從而獲得足夠的檢測數(shù)據(jù)。實際的檢測結(jié)果呈現(xiàn)偏態(tài)分布、分散性強、不易評定的特點，故首先采用指數(shù)法對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，使處理后的數(shù)值符合正態(tài)分布，從而評定銅綠假單胞菌檢測結(jié)果的不確定度。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品稱量過程中產(chǎn)生的不確定度

使用250 mL 無菌玻璃量筒，精度0.1 mL，根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）規(guī)定，量出式250 mL 量筒的容量允差為±2.0 mL，稱量誤差服從矩形分布，包含因子kp=[12]。

樣品稱量引入的不確定度ur為：

2.2 樣品重復(fù)檢測產(chǎn)生的不確定度

在相同條件下，同一名檢測人員對同一包裝飲用水樣品進(jìn)行重復(fù)檢測30 次，得檢測結(jié)果Xi。檢測結(jié)果見表2。

表2 檢測結(jié)果表

得到檢測結(jié)果的原始數(shù)據(jù)（Xi）后，將Xi取對數(shù)得lgXi，計算得對數(shù)值的平均值，再利用貝塞爾公式計算每組數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的平方得計算合并標(biāo)準(zhǔn)偏差得s，最后得樣品重復(fù)檢測合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc。

合并樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差：

樣品重復(fù)檢測合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.3 合成不確定度

將不同來源的不確定度進(jìn)行合成，得包裝飲用水中銅綠假單胞菌檢測結(jié)果的合成不確定度u。

2.4 擴(kuò)展不確定度

取置信區(qū)間P=95%，自由度v=30-1=29，查詢t分布表得包含因子k95（29）=2.05，可得包裝飲用水中銅綠假單胞菌檢測結(jié)果的擴(kuò)展不確定度U。

2.5 報告范圍

根據(jù)得到的擴(kuò)展不確定度U，得到lgX的取值范圍；將lgX取反對數(shù)折算為檢測結(jié)果X，得到X的取值范圍，從而得到包裝飲用水中銅綠假單胞菌的檢測結(jié)果T的報告范圍：

該包裝飲用水中銅綠假單胞菌的檢測結(jié)果為T=23 ～33 CFU/250 mL。

3 結(jié)論與討論

2017 年6 月實施的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 總則》（GB 4789.1—2016）明確要求“檢驗結(jié)果報告后，剩余樣品和同批產(chǎn)品不進(jìn)行微生物項目的復(fù)檢”[13]。微生物項目不得復(fù)檢的特點決定了對其檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性有更嚴(yán)格的質(zhì)量要求，也對其不確定度評價方案的建立提出了更高的要求。

不確定度評價可以定量反映檢測結(jié)果的質(zhì)量好壞，本研究計算得到的報出范圍與樣品的實際檢測結(jié)果較為一致，但是不確定度的評定過程步驟仍然較為繁瑣和不便，中間過程采用了指數(shù)法等統(tǒng)計方法，主要原因在于微生物實驗的原始數(shù)據(jù)普遍呈現(xiàn)偏態(tài)分布，缺少固定規(guī)律、可變性強、重復(fù)性差；這也是微生物檢測項目不易建立規(guī)范的不確定度評價方案的難點所在。只有在檢測結(jié)果＜10 CFU·mL-1的情況下，其才能接近于正態(tài)分布，不需要進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換[14]。本研究采用的為液體樣品且無需進(jìn)行稀釋，如遇其他檢測項目需均質(zhì)、稀釋等過程，不確定度也會隨之變化。

不確定度評價方案的建立首先要分析不確定度產(chǎn)生的來源，微生物實驗有自動化儀器少、人員參與多、檢測周期長和結(jié)果統(tǒng)計主觀性強的特點，由此導(dǎo)致不確定度產(chǎn)生的來源較多，主要有樣品重復(fù)檢測、樣品稱量或吸取、無菌室環(huán)境（風(fēng)力、溫度、濕度等）、樣品種類變化、培養(yǎng)基批次變化、樣品均一性及微生物動態(tài)變化等，其中培養(yǎng)基批次變化、微生物動態(tài)變化等一些微生物實驗特有的不確定度產(chǎn)生來源尚未有完善的測量法或統(tǒng)計學(xué)的評定方法。這些因素造成的不確定度，需要依靠引進(jìn)自動化儀器、嚴(yán)格質(zhì)量控制（實驗室比對、能力驗證、質(zhì)量考核等方式）手段來進(jìn)行減少或評定。

在可評定的因素中，樣品重復(fù)檢測已經(jīng)確定為微生物實驗中的首要不確定度來源，在本研究中其帶來的不確定度為樣品稱量來源的8.1 倍左右。如假設(shè)其他因素均可忽略的話，樣品重復(fù)檢測帶來的不確定度占到全部不確定度的89%左右。目前，我國食品微生物檢測項目逐漸開始使用2 級或3 級的高級別采樣方案（n≥5）進(jìn)行樣品檢測，本文也為其提供了理論依據(jù)。而樣品稱量過程中帶來的不確定度，需要依靠使用優(yōu)良計量器具、開展器具比對、開展人員比對等方式進(jìn)行減少。

在實踐中，微生物實驗進(jìn)行不確定度評定的意義主要在于當(dāng)出現(xiàn)要求限值附近的檢測結(jié)果時，利用擴(kuò)展不確定度對樣品進(jìn)行符合性判定。在95%置信概率下，當(dāng)檢驗結(jié)果延伸擴(kuò)展不確定度半寬度后仍小于（大于）限量標(biāo)準(zhǔn)時。當(dāng)檢驗結(jié)果低于（高于）限量標(biāo)準(zhǔn)的部分小于測量不確定度，則在95%置信概率上不能做出符合（不符合）限量標(biāo)準(zhǔn)的聲明[15]。