防治煙薊馬的生物源農(nóng)藥篩選及其對解毒酶活性影響

王愛玉，艾合買提·買買提，楊媛雪，李卓，薛超，段愛玲，趙鳴*

（1.山東棉花研究中心，濟(jì)南250100；2.山東棉花研究中心試驗(yàn)站，山東臨清252600；3.新疆維吾爾自治區(qū)農(nóng)藥檢定所，烏魯木齊830049）

薊馬屬昆蟲綱纓翅目害蟲，其種類多，寄主范圍廣，僅我國記錄的已有570 余種[1]。 棉田薊馬主要有2 種：煙薊馬（Thrips tabaci Lindeman）和花薊馬（Frankliniella intonsa Trybom），在我國各大棉區(qū)均有分布，其中煙薊馬是北方棉區(qū)的優(yōu)勢種[2-3]。 煙薊馬又叫蔥薊馬、棉薊馬，為害后可使子葉期棉苗生長點(diǎn)受害枯死，形成只有2 片肥厚子葉的公棉花；也可使受害嫩棉葉變厚變脆，變成畸形爛葉。 煙薊馬還會傳播番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）、 鳶尾花黃斑病毒（Iris yellow spot virus，IYSV）、煙草條紋病毒（Tobacco streak virus，TSV）等多種病毒[4-5]。 據(jù)統(tǒng)計(jì)，2014－2018 年我國煙薊馬年均發(fā)生67.31萬公頃次，造成蟲害產(chǎn)量損失的7.12%[6]。 可見，煙薊馬已成為影響棉花生產(chǎn)的重要害蟲之一。

目前防治薊馬主要依賴化學(xué)農(nóng)藥。 化學(xué)農(nóng)藥高效快速，但也帶來環(huán)境污染加劇、害蟲抗藥性增強(qiáng)等負(fù)面影響。 相較傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥，生物源農(nóng)藥具有低毒、高效、低殘留、對哺乳動(dòng)物友好等優(yōu)點(diǎn)，且能迅速分解，極大程度地減輕環(huán)境污染。 近幾年， 生物源農(nóng)藥防治茶棍薊馬（Dendrothrips minowai）、茶黃薊馬（Scirtothrips dorsalis）[7]、松麗毒 蛾（Dasychira axutha）[8]、煙 薊 馬[9]、棕 櫚 薊 馬（Thrips palmi）[10]、西花薊馬（Frankliniella occidentalis）[11-12]及花薊馬[13]等均有報(bào)道，針對植物源農(nóng)藥活性物質(zhì)對花薊馬的作用機(jī)理也有探索[14]。 在棉田薊馬的防治上，新疆報(bào)道了3 種生物源農(nóng)藥對煙薊馬的防效[15]，但針對黃河流域特別是山東棉田煙薊馬生物源農(nóng)藥的防效尚未見報(bào)道。

殺蟲劑使用不當(dāng)可導(dǎo)致害蟲抗藥性風(fēng)險(xiǎn)增加，而抗藥性的分子機(jī)制分為2 個(gè)方面，即靶標(biāo)敏感性降低和解毒代謝作用增強(qiáng)。 代謝抗性的增強(qiáng)主要是因?yàn)榫幋a細(xì)胞色素P450 單加氧酶（Cytochrome P450 monooxygenase，P450）、 谷胱甘肽S- 轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-transferase，GST）和羧酸酯酶 （Carboxylesterase，CarE） 的基因的序列擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)以及突變等[16-18]。 P450 可通過羥基化、環(huán)氧化等作用代謝有機(jī)磷類、擬除蟲菊酯類、新煙堿類等多種殺蟲劑， 從而使昆蟲產(chǎn)生抗藥性[19]。 CarE 通過催化羧酸酯水解產(chǎn)生酸和醇，將有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類及擬除蟲菊酯類殺蟲劑轉(zhuǎn)化為低毒或無毒化合物[20]。 GST 通過催化谷胱甘肽巰基與化合物中親電子基團(tuán)結(jié)合來代謝有機(jī)磷類、有機(jī)氯類及擬除蟲菊酯類殺蟲劑[21]。目前關(guān)于西花薊馬和普通大薊馬（Megalurothrips usitatus）的抗藥性機(jī)理已有研究。 在低水平抗性下西花薊馬對多殺霉素的抗性可能主要是由解毒酶活性升高引起的[22]。 相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)普通大薊馬對多殺霉素的抗性與超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD） 和 過 氧 化 氫 酶（Catalase，CAT）的活性無關(guān)，而與GST 的活性相關(guān)[23]。然而針對棉田煙薊馬的抗藥性機(jī)理還未見報(bào)道。

本研究以棉田采集并室內(nèi)穩(wěn)定飼養(yǎng)的煙薊馬為試蟲，選擇魚藤酮、藜蘆堿、印楝素、除蟲菊素、苦參堿、多殺霉素和乙基多殺菌素7 種生物源農(nóng)藥，測定其對煙薊馬的毒力，選擇3 種殺蟲活性好的藥劑進(jìn)行田間藥效試驗(yàn)，并分析這3 種藥劑對煙薊馬GST、P450 和CarE 活性的影響，以期篩選出能高效防治棉田煙薊馬的生物源農(nóng)藥，并為抗藥性機(jī)理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑

原藥：5.00%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)， 下同） 苦參堿母藥（內(nèi)蒙古清源保生物科技有限公司生產(chǎn)）；95.00%魚藤酮原藥（河北天順生物工程有限公司生產(chǎn)）；92.30%多殺霉素原藥（齊魯制藥內(nèi)蒙古有限公司生產(chǎn)）；85.80%乙基多殺菌素原藥（美國科迪華公司生產(chǎn)）；40.13%印楝素母藥（成都綠金生物科技有限責(zé)任公司生產(chǎn)）；1.00%藜蘆堿原藥 （西安德生元生物科技有限公司生產(chǎn)）；50.00%除蟲菊素原藥 （西安德生元生物科技有限公司生產(chǎn)）；95.00%噻蟲嗪原藥（山東魯抗生物農(nóng)藥有限公司贈送）。

制劑：1.3%苦參堿水劑（簡稱“苦參堿AS”），由天津市恒源偉業(yè)生物科技有限公司生產(chǎn)；5%多殺霉素懸浮劑（簡稱“多殺霉素SC”），由河南三浦百草生物工程有限公司生產(chǎn)；60 g·L－1乙基多殺菌素懸浮劑（簡稱“乙基多殺菌素SC”），由美國陶氏益農(nóng)公司生產(chǎn)；30%噻蟲嗪懸浮劑 （簡稱“噻蟲嗪SC”），由山東綠德地生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 供試蟲源

自山東棉花研究中心試驗(yàn)站棉田采集煙薊馬成蟲，分批在室內(nèi)人工氣候箱繼代培養(yǎng)。 在溫度（25±1）℃、相對濕度70%～80%、光照16 h/黑暗8 h 的條件下，每30 頭左右煙薊馬置于1 個(gè)養(yǎng)蟲玻璃管培養(yǎng)。 以新鮮潔凈、無藥的棉花嫩葉飼喂，3 d 后轉(zhuǎn)移至另一管， 并更換新鮮葉片，如此反復(fù)直至產(chǎn)卵孵化出若蟲。 選取同一批生長一致的2 齡健康若蟲用于毒力測定。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 室內(nèi)毒力測定。 將各原藥用二甲基亞砜溶解后，用含0.05%（體積分?jǐn)?shù)）TritonX-100 的溶液稀釋成5 個(gè)質(zhì)量濃度。 蒸餾水中加入體積分?jǐn)?shù)0.05%TritonX-100 和1%二甲基亞砜， 作空白對照。采用浸葉法進(jìn)行毒力測定[24]，將棉花葉片于藥液中浸漬10 s，取出后于吸水濾紙上陰干，放置在養(yǎng)蟲盒中。 每盒接入煙薊馬40 頭，設(shè)3 次重復(fù)，于溫度（25±1）℃、相對濕度70%～80%、光照16 h/ 黑暗8 h 的人工氣候箱中飼養(yǎng)。 48 h后檢查試蟲死亡情況， 分別記錄總蟲數(shù)和死蟲數(shù)。 試蟲完全不動(dòng)視為死亡，以對照死亡率＜10%為有效測定。

1.3.2 田間藥效評價(jià)。 根據(jù)毒力測定的結(jié)果，選擇苦參堿、多殺霉素和乙基多殺菌素，以噻蟲嗪為對照藥劑， 參考國家農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則[25]進(jìn)行田間藥效評價(jià)。 參考藥劑毒力測定結(jié)果分別設(shè)置低、中、高3 個(gè)劑量，另加清水對照，共13 個(gè)處理。 每個(gè)處理20 m2，重復(fù)4 次，隨機(jī)區(qū)組排列。2020 年6 月18 日調(diào)查蟲口基數(shù)（小區(qū)蟲口基數(shù)大于300 頭），然后采用達(dá)遠(yuǎn)牌5 L 小型電動(dòng)噴霧器對全株均勻噴霧，噴液量675 kg·hm－2。 試驗(yàn)期間天氣晴朗，無極端天氣發(fā)生，能夠保證數(shù)據(jù)有效性。 施藥后1 d、3 d、7 d 分別調(diào)查并記載活蟲數(shù)，每小區(qū)隨機(jī)選定5 個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)連續(xù)調(diào)查5 株，計(jì)算蟲口減退率（r）、防治效果（防效，E）。 計(jì)算公式：r＝（N0－N1）/N0×100%，式中N0為藥前蟲口數(shù)，N1為藥后蟲口數(shù)；E＝（r1－rCK）/（1－rCK）×100%，式中r1為防治區(qū)蟲口減退率，rCK為對照區(qū)蟲口減退率。

1.3.3 酶活性測定。 田間采集個(gè)體大小一致的煙薊馬成蟲，利用苦參堿、多殺霉素、乙基多殺菌素和噻蟲嗪的LC25劑量對煙薊馬進(jìn)行處理，并設(shè)清水對照。 48 h 后將活蟲取出，用液氮速凍，存放于－80 ℃冰箱。每種解毒酶活性測定均設(shè)置3 次重復(fù)，每重復(fù)準(zhǔn)備煙薊馬20～30 頭。

（1）粗酶液提取。 取煙薊馬20～30 頭，加入提取試劑，進(jìn)行冰浴勻漿，于轉(zhuǎn)速8 000×g、4 ℃離心10 min，取上清液置于冰上，用于GST 活性測定；于轉(zhuǎn)速15 000 r·min－1、4 ℃離心30 min，取上清液置于冰上，用于CarE 活性測定。 取煙薊馬20～30 頭， 加入P450 研磨液研磨后， 于轉(zhuǎn)速10 000×g、4 ℃離心30 min， 取上清液， 于轉(zhuǎn)速100 000×g、4 ℃離心60 min，沉淀物用含體積分?jǐn)?shù)20%的甘油研磨液重懸浮，用于P450 活性測定。

（2）上清液蛋白含量測定。 采用考馬斯亮藍(lán)法[26]。

（3）酶活性測定。 GST 活性測定：1 mL 石英比色皿中加入待測酶液和各試劑迅速混勻后于10 s 和300 s 測定340 nm 處的吸光度值。 37 ℃下，每毫克蛋白每分鐘催化1 μmol 1- 氯-2,4- 二硝基苯（1-chloro-2,4-dinitrobenzene，CDNB）與谷胱甘肽（Glutathione，GSH）結(jié)合為1 個(gè)酶活力單位[27]。

CarE 活性測定：取1 mL 石英比色皿，加入待測酶液和各試劑迅速混勻后于450 nm 測定10 s和190 s 處的吸光度值。 37 ℃下，每毫升反應(yīng)體系每毫克組織蛋白每分鐘催化吸光值增加1 為1個(gè)酶活力單位[27]。

P450 活性測定：取450μL 酶液，加入1mmol·L－1還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）和0.4 mmol·L－1的7-乙氧基香豆素各25 μL，于30 ℃下反應(yīng)30 min。然后加入0.03 mol·L－1氧化型谷胱甘肽35 μL，0.5 U 的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶35 μL，室溫下靜置10 min。加入含體積分?jǐn)?shù)50%乙腈Tris 溶液570 μL 終止反應(yīng)。檢測熒光值，激發(fā)波長為390 nm，發(fā)射波長為465 nm。 酶活力的計(jì)算方法參考Kwon 等[28]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用MS Excel 2013 和IBM SPSS Statistics 26 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。根據(jù)死亡概率值和質(zhì)量濃度對數(shù)值， 計(jì)算致死濃度指標(biāo) （LC25、LC50和LC90）及其95%置信區(qū)間[29]。 對田間防治效果、解毒酶活性進(jìn)行單因素方差分析，用鄧肯多重范圍檢驗(yàn)法分析差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 室內(nèi)毒力

根據(jù)室內(nèi)毒力測定結(jié)果（表1），按照LC50將毒力從高到低排列依次為乙基多殺菌素、多殺霉素、苦參堿、印楝素、除蟲菊素、魚藤酮、藜蘆堿、噻蟲嗪。 其中乙基多殺菌素、多殺霉素、苦參堿毒力較高，LC50分別為0.011 mg·L－1、0.274 mg·L－1、1.479 mg·L－1。

2.2 田間藥效

選擇殺蟲活性較好的3 種生物源農(nóng)藥以及噻蟲嗪（對照藥劑）進(jìn)行田間藥效評價(jià)，結(jié)果見表2。 施藥后1 d，除苦參堿AS 低劑量處理外，3 種生物源農(nóng)藥其他劑量處理防效均顯著高于噻蟲嗪SC 處理， 防效最好的是乙基多殺菌素SC，其次是多殺霉素SC 和苦參堿AS，其中乙基多殺菌素SC 高、中劑量處理的防效均在80%以上。施藥后3 d，防效最好的是乙基多殺菌素SC 高劑量處理，其次是多殺霉素SC 高劑量處理，然后依次是乙基多殺菌素SC 中劑量處理， 多殺霉素SC 中劑量處理，乙基多殺菌素SC 的低劑量處理，苦參堿AS 的高、中劑量處理，且這些處理的防效與噻蟲嗪SC 處理差異均達(dá)到顯著水平。 施藥后7 d，防效最好的依然是乙基多殺菌素SC， 其3 個(gè)劑量處理與多殺霉素SC 高、 中劑量處理的防效均顯著高于噻蟲嗪SC 處理； 苦參堿AS 的3 個(gè)劑量處理，防效相對于施藥后3 d 均有所下降，但其高劑量處理仍然達(dá)81.04%。

表1 藥劑對棉田煙薊馬室內(nèi)毒力測定結(jié)果Table 1 The toxicity of insecticides against Thrips tabaci of cotton

2.3 解毒酶活性

苦參堿和多殺霉素處理后，煙薊馬體內(nèi)CarE活性極顯著升高，GST 和P450 活性與對照均無顯著差異；乙基多殺菌素處理后，GST、CarE 和P450活性均顯著升高；噻蟲嗪處理后，CarE 和P450 活性均顯著升高，GST 活性明顯降低（表3）。

3 討論

3.1 生物源農(nóng)藥對煙薊馬的室內(nèi)毒力和田間藥效評價(jià)

前人研究顯示，乙基多殺菌素對香蕉黃胸薊馬（Thrips hawaiiensis）2 齡若蟲[30]、四季豆西花薊馬[12]有 很 高 毒 力（LC50分 別 為0.19、0.196 mg·L－1），利用其防治其他作物薊馬[9,31-33]均取得了不錯(cuò)的效果。 本研究結(jié)果表明，乙基多殺菌素毒力最高（LC50為0.011 mg·L－1），60 g·L－1乙基多殺菌素SC 3 個(gè)劑量處理對煙薊馬均有很好的速效性和持效性，施藥后3～7 d 防效大于90%。 多殺霉素毒力較高（LC50為0.274 mg·L－1），5%多殺霉素SC 高劑量處理對棉田煙薊馬防效較好， 施藥后1～7 d 達(dá)79.41%～95.10%。白小軍等[9]也曾報(bào)道10%多殺霉素懸乳劑防治辣椒煙薊馬的速效性和持效性較好，施藥后1～7 d 的防效為88.5%～93.8%。本研究中苦參堿的毒力（LC50為1.479 mg·L－1） 略低于以上2 個(gè)藥劑，1.3%苦參堿AS 高劑量處理對棉田煙薊馬施藥后3 d 防效達(dá)84.91%，施藥后7 d 有所下降，但仍達(dá)到81.04%。 在張潔等[31]利用其防治煙田薊馬試驗(yàn)中也有類似表現(xiàn)，即1.3%苦參堿AS 速效性較好而持效性稍差。對照藥劑噻蟲嗪對棉田煙薊馬的室內(nèi)毒力（LC50為64.935 mg·L－1）和田間防效均低于3 種生物源農(nóng)藥，30%噻蟲嗪SC 施藥后1 ～7 d 防效僅為56.26%～79.05%，侯文杰[34]在研究西花薊馬的抗性機(jī)理時(shí)也發(fā)現(xiàn)25%噻蟲嗪SC 對西花薊馬4 個(gè)種群的毒力均較低。

表3 不同藥劑LC25 劑量處理后煙薊馬中的解毒酶活性Table 3 The detoxifying enzymes activity in Thrips tabaci after LC25 dose treatment with different agents

3.2 生物源農(nóng)藥對煙薊馬體內(nèi)解毒酶活性的影響

為探討乙基多殺菌素、多殺霉素、苦參堿及噻蟲嗪的抗藥性機(jī)制，本研究利用各藥劑的LC25劑量處理棉田煙薊馬，并對其體內(nèi)主要解毒酶活性進(jìn)行分析。

郝德君等[35]在對懸鈴木方翅網(wǎng)蝽（Corythucha ciliate） 的研究中發(fā)現(xiàn)苦參堿對其解毒酶活性增強(qiáng)作用不明顯。本研究中苦參堿LC25劑量處理煙薊馬48 h 后，P450 和GST 活性沒有明顯變化，而CarE 活性顯著升高， 據(jù)此推測煙薊馬對苦參堿的抗藥性與P450 和GST 無關(guān)， 而與CarE 有關(guān)，這可能是不同昆蟲間抗藥性差異造成。

前人研究發(fā)現(xiàn)多殺霉素對煙粉虱（Bemisia tabaci）體內(nèi)的CarE 具有明顯的激活作用[36-37]，對甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）的GST 活性沒有顯著影響[38]，對西花薊馬抗性品系的P450 和GST活性無顯著影響[34]。 王東[39]發(fā)現(xiàn)增效劑磷酸三苯酯能夠顯著降低棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）對多殺霉素的抗性，而順丁烯二酸二乙酯對棉鈴蟲的抗藥性沒有顯著影響，推測棉鈴蟲對多殺霉素的抗藥性可能與CarE 有關(guān)，而與GST 無關(guān)。 本研究中多殺霉素LC25劑量處理煙薊馬48 h 后，其體內(nèi)CarE 活性顯著升高， 而P450 和GST 活性無顯著變化。 結(jié)合上述研究結(jié)果推測，煙薊馬對多殺霉素的抗藥性可能與CarE 有關(guān)， 而與P450、GST 無關(guān)。

已有研究發(fā)現(xiàn)乙基多殺菌素能引起棉鈴蟲體內(nèi)多功能氧化酶 （Mixed-functional oxidase，MFO） 活性升高[40]， 使草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）幼蟲體內(nèi)CarE、MFO 活性增高[41]，處理伊米果蠅（Drosophila immigrans）24 h 后CarE活性顯著高于對照[27]，也有研究推測GST、CarE可能參與乙基多殺菌素在小菜蛾 （Plutella xylostella）體內(nèi)的代謝[42-43]。 本研究以乙基多殺菌素處理煙薊馬后， 其體內(nèi)P450、CarE 和GST 活性均顯著提高，因此推測這3 種解毒酶可能都參與了煙薊馬對乙基多殺菌素的解毒代謝。

前人研究[44-47]發(fā)現(xiàn)，噻蟲嗪對灰飛虱（Laodelphgax striatellus）抗性品系、Q 型煙粉虱抗性品系及玉米螟赤眼蜂（Thichogramma Ostriniae）成蜂的P450 活性具有增強(qiáng)作用，能使灰飛虱和月季長管蚜（Macrosiphum rosuomm）的CarE 活性顯著增強(qiáng)， 對灰飛虱和玉米螟赤眼蜂成蜂的GST 有抑制作用。 本研究以噻蟲嗪LC25劑量處理煙薊馬后， 其體內(nèi)CarE 和P450 活性顯著提高，GST 活性明顯降低。 綜合前人研究，推測這3 種解毒酶可能均參與了煙薊馬對噻蟲嗪的解毒代謝。

3.3 研究的不足

本研究僅分析了LC25劑量處理48 h 后，煙薊馬體內(nèi)3 種解毒酶P450、CarE 和GST 活性的變化， 未涉及不同亞致死劑量和不同處理時(shí)間，因此，應(yīng)當(dāng)在這2 個(gè)方面繼續(xù)開展工作，以深入研究煙薊馬的抗藥性機(jī)制。

4 結(jié)論

以棉田中數(shù)量較多的煙薊馬為試蟲，對7 種生物源農(nóng)藥進(jìn)行了毒力測定，并對殺蟲活性好的乙基多殺菌素、多殺霉素和苦參堿進(jìn)行了田間藥效試驗(yàn)。 結(jié)果表明：乙基多殺菌素和多殺霉素毒力高、藥效好，可以作為目前棉花生產(chǎn)上防治煙薊馬的主要藥劑；苦參堿防效稍低，可以用于輪用或復(fù)配，以減緩抗藥性的產(chǎn)生。 從生態(tài)、安全和成本角度綜合考慮，60 g·L－1乙基多殺菌素懸浮劑、5%多殺霉素懸浮劑和1.3%苦參堿水劑的棉田推薦用量分別為每666.7 m22 g、10 g 和340 g。此外，根據(jù)解毒酶活性測定結(jié)果推斷，CarE、P450和GST 在煙薊馬對乙基多殺菌素的抗藥性中發(fā)揮一定作用，CarE 在煙薊馬對苦參堿和多殺霉素的抗藥性中發(fā)揮作用。