陸地棉REM 基因家族全基因組鑒定及表達分析

石榮康，張冬梅，孫正文，劉正文，解美霞，張艷，馬峙英，王省芬

（華北作物改良與調(diào)控國家重點實驗室/ 河北省棉花產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心/ 河北省作物種質(zhì)資源重點實驗室/河北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，河北 保定071001）

棉花是重要的纖維作物和油料作物，在全世界廣泛種植。 陸地棉是我國種植最廣泛、產(chǎn)量最高的栽培種，其基因組數(shù)據(jù)也在不斷完善[1]。 B3超家族是植物中特有的一個基因家族，在植物的生長發(fā)育以及應對環(huán)境脅迫中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，該家族編碼一類含有B3 功能域（與DNA 結(jié)合的高度保守結(jié)構(gòu)域）的轉(zhuǎn)錄因子[2]。 B3功能域的最初命名源于玉米中發(fā)現(xiàn)的VIVIPAROUS1（VP1）蛋白的第三個基本結(jié)構(gòu)域，包含90～120 個氨基酸[3]。 按照基因結(jié)構(gòu)和功能特征，B3 超家族進一步分為4 個亞家族，包括LAV（LEAFY COTYLEDON2[LEC2]-ABSCISIC ACID INSENSITIVE3[ABI3]-VAL）、ARF（AUXIN RESPONSE FACTOR）、RAV （RELATED TO ABI3 AND VP1）和REM（REPRODUCTIVE MERISTEM）[4-6]。

目前， 植物中關(guān)于LAV、ARF 2 個亞家族的研究報道較多， 擬南芥LAV 亞家族分為LEC2-ABI3 和VAL 兩 組，LEC2 和FUSCA3（FUS3）促進胚胎發(fā)育[7-8]，ABI3 在種子發(fā)育過程中調(diào)控脫落酸響應基因[9]，這3 種基因都在種子中大量表達， 在種子發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。 擬南芥的ARF 亞家族含有生長素響應元件，參與生長素介導的各種生理過程，AtARF1 和AtARF2 突變導致開花延遲[10]，AtARF6 和AtARF8的雙缺失突變體會導致花器官成熟滯后以及繁殖力降低[11]，AtARF5 和AtARF7 促進極性生長以及細胞擴增[12-13]。 而有關(guān)RAV、REM 2 個亞家族的功能研究報道較少， 擬南芥中RAV 亞家族成員有13 個， 過量表達AtRAV1 的擬南芥表現(xiàn)為側(cè)根少、蓮座葉少以及開花延遲[14]，在煙草中表達大豆的RAV1 基因也產(chǎn)生了相似的表型[15]，表明AtRAV1 在植物生長和開花中作為負調(diào)控因子起作用。擬南芥中REM 亞家族成員只含有B3 功能域， 但是每個成員在結(jié)構(gòu)域的個數(shù)上存在差異，REM 亞家族中最先確定功能的基因是AtVRN1，該基因以非特異性序列的方式結(jié)合到DNA 上，并對維持擬南芥春化反應發(fā)揮作用[16]。 對于其他AtREM 基因， 目前只有一小部分有關(guān)基因表達特性的研究報道， 比如AtREM22 在雄蕊發(fā)育中發(fā)揮作用[17]，AtREM01 和AtREM23 在花芽的分化期發(fā)揮作用[18-19]，REM 家族的AtVDD 可以與MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，在植物胚珠發(fā)育中發(fā)揮作用[20-21]。 椰菜BoREM1 在生殖分生組織表達，在花芽分化期發(fā)揮作用[22]。 同時對番茄、毛竹和玉米等作物REM 基因家族進行了生物信息學分析， 為研究REM 家族在作物中的功能提供了理論基礎(chǔ)[23-25]。

目前， 有關(guān)棉花REM 家族的研究還未見報道。 為深入了解REM 家族基因在棉花生長發(fā)育和逆境中的作用， 本研究基于陸地棉TM-1 基因組測序數(shù)據(jù)，運用生物信息學手段結(jié)合公共數(shù)據(jù)庫中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[26-27]，對陸地棉基因組中的REM 家族成員進行全面系統(tǒng)的鑒定， 并對REM家族基因在基因組中的分布、REM 蛋白的理化性質(zhì)、亞細胞定位、進化以及表達特性進行分析，利用qRT-PCR （Quantitative real-time ploymerase chain reaction， 實時熒光定量聚合酶鏈式反應）對部分基因進行表達驗證， 為后續(xù)研究REM 家族基因的功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 陸地棉REM 基因家族成員鑒定及理化性質(zhì)分析

以基于三代測序組裝的陸地棉TM-1 基因組數(shù)據(jù)作為參考[28]，從CottonFGD （http://www.cottonfgd.org/）下載基因序列和氨基酸序列，利用REM家族特有的B3 結(jié)構(gòu)域（Pfam accession 02362）搜索陸地棉REM 氨基酸序列， 將得到的候選基因在NCBI-CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）數(shù)據(jù)庫中進一步確認。 通過 ExPASy-ProtParam tool （https://web.expasy.org/protparam/）在線軟件，分析REM 家族成員編碼蛋白的氨基酸數(shù)量、相對分子質(zhì)量、理論等電點及不穩(wěn)定指數(shù)等[29]。

1.2 陸地棉REM 基因家族的染色體定位和亞細胞定位

從CottonFGD 獲取陸地棉REM 基因家族成員的染色體位置信息[30]，利用Mapchart 2.32 繪制REM 家族基因的染色體定位圖。使用CELLO v.2.5 （http://cello.life.nctu.edu.tw/） 在 線 網(wǎng) 站 對REM 編碼蛋白進行亞細胞定位預測[32]。

1.3 陸地棉REM 基因家族的保守基序分析和基因結(jié)構(gòu)分析

利用The MEME Suite（http://meme-suite.org/）分析REM 家族氨基酸序列的保守基序， 基序數(shù)量設(shè)置為10， 其他參數(shù)為默認值。 通過軟件TBtoolsv0.66831 繪制REM 家族的基因結(jié)構(gòu)圖[31]。

1.4 REM 基因家族的系統(tǒng)進化分析

從TAIR（https://www.arabidopsis.org/）網(wǎng) 站下載擬南芥REM 家族基因序列。 利用軟件MEGA 7.0 的Muscle 功能對陸地棉與擬南芥REM 家族基因編碼的氨基酸序列進行比對，采用相鄰連接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，其中Bootstrap 值設(shè)定為1 000[33]。

1.5 陸地棉REM 基因的上游順式作用元件分析

從CottonFGD 提取陸地棉REM 家族基因上游2 000 bp DNA 序列，用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線網(wǎng)站預測可能存在的順式作用元件。

1.6 陸地棉REM 基因家族的共線性分析

使用MCScanX[34]軟件檢測陸地棉基因復制事件，Tbtools 軟件提取并展示REM 家族成員復制事件。

1.7 REM 基因家族在棉花不同組織及逆境脅迫下的表達分析

從NCBI sequence read archive（SRA）數(shù)據(jù)庫下載陸地棉REM 基因家族成員的根、莖、葉、雌蕊、雄蕊、花萼、花瓣和花托等8 個組織和胚珠、纖維不同發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（PRJNA 248163），以及4 種逆境脅迫（冷、熱、PEG 和鹽脅迫）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。 棉花材料處理和數(shù)據(jù)獲取過程詳見Zhang 等[35]的研究報道。 以FPKM（Fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped）＞1 作為基因表達的篩選標準，對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行l(wèi)og2（1＋FPKM）標準化處理。 利用TBtools v0.66831 軟件繪制REM 家族成員的表達熱圖[31]。

1.8 部分REM 家族基因在不同發(fā)育時期纖維中的qRT-PCR 分析

按照RNAprep Pure Plant Plus kit 試劑盒說明書提取陸地棉品種農(nóng)大棉13 號開花后5、10、15、20 天（Days post anthesis，DPA）的纖維RNA。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop 2000 分光光度計檢測RNA 樣品的質(zhì)量和濃度后， 使用TransScriptOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。采用TransStartTop Green qPCR SuperMix （＋Dye II）定量試劑盒進行qRT-PCR 分析，GhHis3 作為內(nèi)參[36]。反應體系共20 μL，包括2×SuperMix 10 μL，ddH2O 7 μL，cDNA 1 μL， 正向引物1 μL 以及反向引物1 μL。反應程序為：50 ℃2 min，95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，40 次循環(huán)。 引物信息詳見表1。 每個樣品進行3次重復試驗， 采用2－ΔΔCt法計算基因的相對表達量[37]。 使用GraphPad Prism7 軟 件 對 數(shù) 據(jù) 進 行Tukey 多重比較和繪圖。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 陸地棉REM 基因家族成員全基因組鑒定

基于陸地棉TM-1 基因組測序數(shù)據(jù)， 從陸地棉基因組中共鑒定出79 個GhREM 基因， 至少都含有一個B3 功能域。 根據(jù)其在染色體上的位置信息，依次命名為GhREM01～GhREM79（圖1）。 從基因在染色體上的分布來看，除了A 亞組的第9 染色體沒有REM 家族成員外， 其他每條染色體上至少含有一個GhREM， 其中A 亞組第2 號和第3 號染色體上最多， 每條染色體均包含7 個GhREM。 此外，我們在陸地棉REM 家族成員中發(fā)現(xiàn)了9 對串聯(lián)重復基因， 分布在A、D 亞組，推測這些基因可能在棉花發(fā)生多倍化事件時產(chǎn)生。

圖1 陸地棉REM 基因的染色體定位Fig. 1 Chromosome location of Gossypium hirsutum REM genes

2.2 陸地棉REM 家族成員編碼蛋白的理化性質(zhì)和亞細胞定位分析

對REM 家族成員編碼的蛋白質(zhì)進行理化性質(zhì)分析（表2），其編碼的肽鏈由119～749 個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量介于13.81～83.90 kDa，平均41.04 kDa。理論等電點介于5.54～10.10，平均值為8.50， 多數(shù)偏堿性。 蛋白不穩(wěn)定指數(shù)介于22.10～70.10， 平均值為42.28， 其中有30 個GhREM 成員為穩(wěn)定蛋白（蛋白不穩(wěn)定指數(shù)＜40）；其余的49 個基因為不穩(wěn)定蛋白 （蛋白不穩(wěn)定指數(shù)＞40）。 亞細胞定位預測顯示，REM 家族基因主要定位于細胞核、細胞質(zhì)以及線粒體中，以細胞核中分布最廣泛， 其中有58 個基因定位在細胞核中，25 個定位在細胞質(zhì)中，18 個定位在線粒體，4 個定位在胞外，2 個定位在葉綠體。

表2 陸地棉REM 基因信息Table 2 The information of Gossypium hirsutum REM gene

表2 （續(xù)）Table 2 （Continued）

表2 （續(xù)）Table 2 （Continued）

2.3 陸地棉REM 家族成員的保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析

利用79 條陸地棉REM 家族基因的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，并對家族成員的基因結(jié)構(gòu)和保守基序進行可視化分析。 依據(jù)Motif 的種類與數(shù)量（圖2A），內(nèi)含子與外顯子的數(shù)量和位置（圖2B）， 將陸地棉REM 家族分為6 個亞組，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ。 一些成員含有相同的基序（Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4、Motif 5、Motif 8和Motif 9）， 所有GhREM 基因的外顯子數(shù)量在1～10。 Ⅰ亞組中含有6 個外顯子的基因占多數(shù)，Motif 的個數(shù)在8～13， 是6 個亞組中最多的；Ⅱ亞組含有4 個外顯子的基因居多，Motif 8 只存在于第Ⅱ亞組；Ⅲ亞組外顯子數(shù)目介于1～7，含有2～3 個Motifs；Ⅳ亞組的基因大多含有4 個外顯子，Motif 9 只存在于第Ⅳ亞組； Ⅴ亞組含有1 個外顯子的基因居多， 并且只含有1～2 個Motif；Ⅵ亞組包含4～6 個外顯子，Motif 的個數(shù)在2～8。 所有REM 基因包含1～4 個B3 功能域，其中46 個成員包含1 個B3 功能域，17 個成員和12個成員分別包含2 個和3 個B3 功能域，4 個成員包含4 個B3 功能域。大多數(shù)B3 功能域位于肽鏈的N 端，C 端次之，中部最少。

2.4 陸地棉與擬南芥REM 基因家族的系統(tǒng)進化分析

圖2 陸地棉REM 家族成員的保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析Fig. 2 Conserved motif and gene structure analyses of REM family members in G. hirsutum

圖3 陸地棉REM 基因家族保守基序Fig. 3 Conserved motifs of REM gene family in G. hirsutum

圖4 陸地棉與擬南芥REM 基因家族的系統(tǒng)進化分析Fig. 4 Phylogenetic analysis of REM genes from G. hirsutum and Arabidopsis thaliana

REM 基因家族是功能研究較少的基因家族，擬南芥中含有45 個REM 基因，按功能分為5 個亞組[5]。 將79 個GhREMs 與45 個AtREMs編碼的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖4），所有的陸地棉REM 基因與擬南芥基因并沒有因為物種差異而單獨分成2 類， 陸地棉REM 基因也分為5 個亞組， 即A～E 亞組。 A 亞組包含13 個GhREMs 以及15 個AtREMs， 其中At4G31610、At4G31615 和At4G31620 在花分生組織和花發(fā)育的早期階段中表達并發(fā)揮作用[18]；B 亞組包含12 個GhREMs 和3 個AtREMs；C 亞組包含5 個GhREMs 和3 個AtREMs，其中At3G19184 響應花、葉分生組織的發(fā)育[5]；D 亞組包含41 個陸地棉和 6 個擬南芥成員， 其中 At3G18990（AtVRN1）是擬南芥中發(fā)現(xiàn)最早、功能最先確定的AtREM 基因[16]，維持擬南芥對春化作用的響應；E 亞組包含8 個GhREMs 和18 個AtREMs，其中At3G17010 為雄蕊發(fā)育的標志基因[17]，At2G16210、At2G35310 和At5G09780 在 花 芽 的分化期表達并發(fā)揮作用[18]。 推測與擬南芥REM家族成員親緣關(guān)系較近的陸地棉REMs， 可能具有相似的生物學功能。

2.5 陸地棉REM 基因家族共線性分析

為了進一步探索陸地棉REM 家族基因的進化過程， 本研究分析了REM 家族不同基因間的共線性關(guān)系，共發(fā)現(xiàn)44 對REM 基因存在共線性關(guān)系（圖5），除了A 亞組和D 亞組對應染色體上的REM 基因之間存在共線性關(guān)系外，A 亞組和D 亞組內(nèi)分別有11 對和9 對REM 基因也存在共線性關(guān)系， 而且REM 基因家族存在單個基因?qū)鄠€基因的情況，說明該家族在進化過程中發(fā)生了染色體片段復制事件。

2.6 陸地棉REM 家族啟動子順式作用元件分析

圖5 陸地棉REM 基因共線性分析Fig. 5 Collinearity analysis of REM genes in upland cotton

通過分析陸地棉REM 基因家族上游2 000 bp的序列，發(fā)現(xiàn)數(shù)量不等的順式作用元件（圖6），包括光信號響應元件、激素響應元件、環(huán)境脅迫響應元件等。首先，GhREM 家族每個成員都含有大量 的 光 信 號 響 應 元 件（G-box、GT1-motif、TCT-motif 等）， 說明REM 家族成員的啟動子具有光誘導的特性， 并參與到光周期的調(diào)控途徑。其次，大多數(shù)成員都含有各種激素響應元件以及環(huán)境脅迫響應元件， 例如，ABA 響應元件（ABRE）、GA 響 應 元 件（GARE-motif、P-box、TATC-box）、IAA 響應元件（AuxRR-core、TGAelement）、MeJA 響 應 元 件 （CGTCA-motif、TGACG-motif）、ET 響應元件（ERE）、SA 響應元件（TCA-element）、干旱響應元件（MBS）、低溫響應元件（LTR）、防御與脅迫響應元件（Defense and stress）及抗氧化響應元件（ARE）等，推測陸地棉REM 家族基因可能參與響應激素調(diào)控及抵御干旱、低溫等脅迫過程。 另外，還發(fā)現(xiàn)部分基因含有許多響應調(diào)控晝夜節(jié)律（Circadian）、分生組織表達（CAT-box）、胚乳表達（GCN4-motif）、種 子萌發(fā)（RY-element）等生長發(fā)育相關(guān)元件。 在6 個響應激素的調(diào)控元件中， 每個GhREM 至少含有1個激素調(diào)控元件，其中52 個基因含有ABA 調(diào)控元件，67 個基因含有ET 調(diào)控元件，40 個含有MeJA 調(diào)控元件，如GhREM08 含有11 個響應乙烯調(diào)控元件，GhREM10 含有12 個響應MeJA 調(diào)控元件，GhREM50 含有6 個ABA、6 個MeJA 調(diào)控元件；此外，63 個基因還含有響應干旱、低溫等逆境脅迫的調(diào)控元件。 以上結(jié)果表明， 陸地棉REM 家族成員通過不同的信號通路參與棉花生長發(fā)育以及環(huán)境脅迫。

圖6 GhREM 順式作用元件分析Fig. 6 Cis-acting element analysis of GhREM genes

2.7 陸地棉REM 家族的組織表達特性分析

根據(jù)陸地棉TM-1 的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)， 分析了GhREM 家族成員在棉花根、莖、葉、雌蕊、雄蕊、花萼、花瓣和花托等8 個組織以及胚珠和纖維不同發(fā)育時期中的表達模式。 以FPKM＞1 作為基因表達的篩選標準， 發(fā)現(xiàn)其中25 個基因在所有組織中的FPKM 數(shù)值均小于1，可以認為它們在組織中不表達或者表達量極少； 剩下的54 個基因具有組織表達特異性，并可分為5 種表達模式（圖7）。 模式Ⅰ包括12 個GhREM 成員，它們在各種組織中均表達， 且胚珠及纖維中表達量高，GhREM02、GhREM24、GhREM41、GhREM60 和GhREM76 在5 DPA 胚珠中的表達量較其他組織更高，GhREM13、GhREM17 和GhREM37 在5 DPA 和10 DPA 纖維中表達量更高。 模式Ⅱ包括16 個成員， 這些基因在不同發(fā)育時期的胚珠和纖維中的表達量較模式Ⅰ低，部分成員在一些組織中不表達。 模式Ⅲ僅包括3 個成員：GhREM74、GhREM06 和GhREM35，主要在花瓣等花器官中表達量較高，在其他組織中表達量較低或不表達。 模式Ⅳ包括12 個成員，在各組織中的表達量都較低。 模式Ⅴ包括11 個成員，在大部分組織中的表達量都較低，但在1 DPA 或5 DPA的胚珠中均有較高表達， 且GhREM08、GhREM20 和GhREM57 在雌蕊中表達量較高，GhREM27、GhREM62、GhREM63 在5 DPA 或10 DPA 的纖維中表達量較高。

2.8 陸地棉REM 家族響應逆境脅迫的表達分析

進一步分析所有GhREMs 在冷、熱、鹽和干旱4 種逆境脅迫下的表達規(guī)律， 發(fā)現(xiàn)50 個基因在所有逆境脅迫下均不表達， 其余29 個基因在不同逆境條件下表現(xiàn)出不同的表達規(guī)律。

冷脅迫處理后（圖8A），與相應時間點的對照比，28 個GhREMs 的表達發(fā)生了變化。 處理后1 h，13 個GhREMs（GhREM06、GhREM21 等）表達 下 調(diào)，GhREM43、GhREM46 和GhREM74 表達上調(diào)；處理后3 h，GhREM13 和GhREM41 表達上 調(diào)；GhREM18、GhREM21 等8 個 基 因 在 處 理后6 h 表達上調(diào)。 處理后4 個時間點表達量均下調(diào)的有10 個基因，包括GhREM02、GhREM24 等。

熱脅迫處理后（圖8B），28 個GhREMs 的表達發(fā)生了變化。 處理后1 h，GhREM18、GhREM19、GhREM41 和GhREM43 上 調(diào) 表 達，13 個 基 因下 調(diào) 表 達；GhREM06、GhREM18、GhREM24、GhREM31、GhREM43 和GhREM60 在處理后6 h和12 h 表達量明顯上調(diào)；GhREM18、GhREM24、GhREM41 和GhREM43 在4 個時間點均上調(diào)表達。

鹽脅迫處理后（圖8C），27 個基因的表達發(fā)生 了 改 變， 其 中 GhREM32、GhREM41 和GhREM46 在鹽處理后1 h 表達上調(diào)，8 個基因表達 下 調(diào)；GhREM31、GhREM43 和GhREM58 在處理后6 h 表達上調(diào)，GhREM24 和GhREM50在處理后12 h 表達上調(diào)；GhREM41、GhREM60和GhREM76 在4 個時間點表達量均上調(diào)。

聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）模擬干旱脅迫處理后（圖8D），有27 個基因的表達發(fā)生變化。處理后1 h，7 個GhREMs 的表達上調(diào)，包括GhREM02、GhREM17 等，GhREM21、GhREM36、GhREM68 和GhREM77 下調(diào)表達； 處理后6 h，GhREM24、GhREM31、GhREM43、GhREM44 和GhREM58 上調(diào)表達量；GhREM17 在4 個時間點的表達均表現(xiàn)為上調(diào)。

以上分析結(jié)果顯示，REM 家族成員在棉花應對逆境脅迫時可能發(fā)揮著重要作用。

2.9 部分REM 家族基因在不同發(fā)育時期纖維中的qRT-PCR 分析

從陸地棉REM 家族中選擇有代表性的6 個基因， 利用不同發(fā)育時期的纖維RNA 進行qRT-PCR 驗證，結(jié)果顯示，GhREM03、GhREM36和GhREM78 在10 DPA 的棉纖維中顯著高表達， 之后表達量明顯下降；GhREM13 和GhREM27 在5 DPA 和10 DPA 的纖維中表達量最高，之后表達量顯著下降；GhREM50 在纖維發(fā)育到20 DPA 時表達量最高（圖9），這與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)反映的基因表達模式一致，也預示著這些基因在棉纖維發(fā)育過程中可能具有重要作用。

3 討論

本研究運用生物信息學的手段首次從陸地棉TM-1 基因組中鑒定到79 個GhREM 成員，不均勻地分布在除了A 亞組第9 號染色體外的其他染色體上。 REM 家族成員含有的氨基酸殘基的數(shù)量介于119～749， 氨基酸數(shù)量的較大差別，與其他作物如毛竹、 番茄和擬南芥報道的REM家族成員一致[6,23-24]。 B3 超家族中的LAV、ARF和RAV 亞家族除了含有特有的B3 功能域外，還包括AP2 結(jié)構(gòu)域、 生長素響應結(jié)構(gòu)域以及CW鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域。然而REM 亞家族只包含B3 功能域[2,5]，通過對陸地棉REM 家族基因進行分析，成員都含有特有的B3 功能域， 與已報道的描述一致。 此外，部分成員含有一些未知功能域（Domains of unknown function，DUF），這些結(jié)構(gòu)域可能在棉花生長發(fā)育中發(fā)揮特定的作用。 對該家族成員進行亞細胞定位預測，58 個基因定位在細胞核中，部分基因定位在其他部位，與其轉(zhuǎn)錄因子家族的特征相符[2]。 根據(jù)79 個GhREM 成員基因結(jié)構(gòu)及保守基序的相似性，將所有基因分成6 個亞組，部分成員有相同的結(jié)構(gòu)，但整體差異較大，某些保守基序只存在于其中某一亞組。 例如，Motif 8 只存在于第Ⅱ亞組，Motif 9 只存在于第Ⅳ亞組。 基因片段復制往往促進了基因家族的擴大[38]，通過對陸地棉REM 家族基因進行共線性分析，發(fā)現(xiàn)該家族也同樣發(fā)生了一些染色體片段復制事件，一共包含44 對共線性關(guān)系，存在著單個基因?qū)鄠€基因的情況，說明該家族在進化中發(fā)生了擴張。

圖8 陸地棉REMs 在4 個逆境脅迫下的表達Fig. 8 Profile of GhREMs expression under four stresses

圖9 陸地棉REM 基因纖維發(fā)育時期的表達分析Fig. 9 The expression analysis of REM genes during fiber development in G. hirsutum

通過對陸地棉與擬南芥REM 家族基因進行系統(tǒng)進化分析，按照擬南芥REM 基因的功能，將棉花REM 家族基因分成A～E 5 個小家族，D 亞組GhREM 成員最多，其中AtVRN1 在春化反應中發(fā)揮作用，過量表達該基因可以引起休眠的抑制，甚至致死[16]。 A 和E 亞組中的AtREM23 和AtREM01 在花芽分化中發(fā)揮作用[18-19]，AtREM22是雄蕊發(fā)育的標志基因[17]，和它們屬于同一組的GhREMs 可能發(fā)揮著同樣的作用。 本研究發(fā)現(xiàn)，在79 個REM 基因中， 有25 個基因在不同組織中低表達或不表達，54 個基因在不同組織中的表達呈現(xiàn)出差異，大部分成員在胚珠和纖維中表達量較高， 而GhREM02、GhREM60、GhREM76 等在所有組織中均表達，說明這些基因可能在棉花整個生長發(fā)育中都發(fā)揮作用。 植物在生長發(fā)育過程中需要各種激素的調(diào)控，也常常會遇到逆境脅迫的不利因素， 本研究通過分析REM 家族基因上游2 000 bp 的序列， 發(fā)現(xiàn)了很多響應激素、逆境脅迫的順式調(diào)控元件， 說明REM 家族成員可能通過參與不同的信號通路在植物生長發(fā)育和應對逆境脅迫中發(fā)揮作用。 本研究發(fā)現(xiàn)GhREM36、GhREM50 和GhREM78 上游含有響應IAA、ET 和GA 等參與棉花纖維發(fā)育的激素調(diào)控元件， 而轉(zhuǎn)錄組和qRT-PCR 的分析顯示它們在纖維發(fā)育不同時期的表達量不同，預示著這些基因可能在棉纖維發(fā)育中行使著重要的功能。此外， 對REM 家族在逆境脅迫下的表達分析發(fā)現(xiàn)， 部分基因如GhREM41 等在響應棉花熱、鹽脅迫，GhREM43 等在響應干旱脅迫時表達上調(diào)，說明這些基因能快速地參與抗逆反應。 關(guān)于上述基因在棉花中的功能和作用機制還有待今后進一步研究。

4 結(jié)論

本研究從陸地棉基因組中鑒定出79 個REM 基因家族成員， 明確了基因在染色體上的分布特征、基因結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)以及系統(tǒng)進化特征，在轉(zhuǎn)錄水平上初步揭示了其在生長發(fā)育和抗逆中的功能， 為后續(xù)REM 家族基因的功能研究提供了理論依據(jù)。