氟苯尼考粉中非法添加乙酰甲喹的檢測(cè)方法研究

文英會(huì)，邱天寶，劉占通，吳慧豪

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.河南省獸藥飼料監(jiān)察所，河南 鄭州 450008)

氟苯尼考粉是一種動(dòng)物專用的酰胺醇類廣譜抗生素[1]，對(duì)呼吸道和消化道疾病治療效果明顯。乙酰甲喹又稱痢菌凈[2]，具有廣譜抗菌活性，主要用于雛雞白痢、禽巴氏桿菌病的防治。獸藥中非法添加現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，其中就包括氟苯尼考粉中存在非法添加物的現(xiàn)象[3]。個(gè)別生產(chǎn)企業(yè)為了提高防治疾病的效果或者減少不良反應(yīng)，在氟苯尼考粉中非法添加乙酰甲喹，隱藏了乙酰甲喹的使用，可能在動(dòng)物源性食品中造成乙酰甲喹殘留的嚴(yán)重后果[4]，這類不合規(guī)獸藥給畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成安全隱患，并對(duì)人類食品安全帶來威脅。

目前，對(duì)氟苯尼考粉中非法添加乙酰甲喹的檢測(cè)暫無標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定?；诋?dāng)前的市場環(huán)境，建立一種相應(yīng)的檢測(cè)方法很有必要。本研究建立了高效液相色譜法對(duì)氟苯尼考粉中非法添加乙酰甲喹的檢測(cè)，可望對(duì)控制乙酰甲喹的非法添加起到作用。

1 材料

1.1 儀器

Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀(美國Waters公司)，配置UPLC PDA光電二極管陣列檢測(cè)器/UPLC TUV紫外檢測(cè)器；超純水機(jī)(美國Millipore公司)；XS205電子天平(瑞士Mettler TOLEDO公司)。

1.2 試劑與材料

乙腈、甲醇、磷酸、三乙胺等；乙酰甲喹對(duì)照品：批號(hào)H0111505，含量99.6%，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 供試品

氟苯尼考粉樣品，由河南某制藥有限公司提供，規(guī)格100 g∶10 g，質(zhì)量符合《中國獸藥典》2020版一部質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)檢測(cè)不含乙酰甲喹，即為陰性樣品。

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液的制備

取乙酰甲喹對(duì)照品約10 mg于50 mL容量瓶中，加乙腈適量，超聲10 min使其溶解，放冷至室溫后用乙腈定容至刻度，搖勻，制成0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。

2.2 供試品溶液的制備

取陰性樣品約1 g于50 mL容量瓶中，加乙腈適量，超聲15 min使其大部分溶解，放冷至室溫后用乙腈定容至刻度，搖勻?yàn)V過，濾液作為供試品溶液。

2.3 色譜條件

流動(dòng)相為乙腈-水(40∶60)；色譜柱：Waters XBridge C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測(cè)波長256 nm；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫30 ℃。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別精密量取2.1、2.2項(xiàng)下的溶液各1 mL于10 mL容量瓶中，加乙腈稀釋至刻度搖勻，量取10 μL注入高效液相色譜儀，再精密量取2.1項(xiàng)下的溶液1 mL于10 mL容量瓶中，加乙腈稀釋至刻度搖勻，量取10 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。

2.5 線性關(guān)系考察

精密量取2.1項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液適量，用乙腈稀釋成0.002、0.004、0.01、0.02、0.04 mg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，從低濃度到高濃度依次進(jìn)樣，按2.3項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得其線性回歸方程。

2.6 添加回收試驗(yàn)

取2.2項(xiàng)下的供試品溶液，精密量取1 mL，加入10 mL容量瓶平行6份實(shí)驗(yàn)，在容量瓶中精密加入乙酰甲喹對(duì)照品溶液1 mL(相當(dāng)于約0.2197 mg的乙酰甲喹)，用乙腈定容，精密吸取10 μL，按上述方法測(cè)定，計(jì)算其回收率。

2.7 檢測(cè)限

將2.1項(xiàng)下的對(duì)照品溶液進(jìn)行梯度稀釋后添加到陰性氟苯尼考粉中，按2.3項(xiàng)下的方法進(jìn)行檢測(cè)，以乙酰甲喹光譜圖不失真的最低添加含量作為檢測(cè)限。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，于制備后2 h、4 h、8 h、12 h、24 h注入高效液相色譜儀，在上述高效液相色譜條件下分別進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算乙酰甲喹峰面積的RSD值。

3 結(jié)果

3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

在該色譜條件下，提取256 nm處的色譜圖，按出峰時(shí)間的先后順序依次為乙酰甲喹、氟苯尼考，理論塔板數(shù)高，相鄰色譜峰的分離度符合要求，結(jié)果見表1，有關(guān)色譜圖如圖1，相應(yīng)對(duì)照品的色譜圖如圖2。

表1 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

圖1 乙酰甲喹和氟苯尼考混合溶液在256 nm的色譜圖

圖2 乙酰甲喹對(duì)照品溶液在256 nm的色譜圖

3.2 線性關(guān)系考察

上機(jī)后不同的對(duì)照品濃度與相應(yīng)的色譜峰面積如表2所示。

表2 不同對(duì)照品濃度與峰面積

以稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，如圖3所示，求得線性回歸方程為Y=3.76×108X-8130及相關(guān)系數(shù)r=0.9999。結(jié)果表明，在該實(shí)驗(yàn)條件下，乙酰甲喹的濃度在0.002～0.04 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

圖3 乙酰甲喹對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3 添加回收試驗(yàn)

結(jié)果如表3所示，乙酰甲喹的回收率在99.0%～99.8%范圍內(nèi)，平均回收率在99.0%，RSD值為0.4%，符合回收率的范圍，說明該法具有良好的回收率。

表3 乙酰甲喹回收率

3.4 檢測(cè)限

將乙酰甲喹溶液進(jìn)行梯度稀釋后，記錄乙酰甲喹的色譜圖及光譜圖，結(jié)果如圖4、圖5、圖6、圖7所示：當(dāng)乙酰甲喹含量在0.2 mg/g、2 mg/g時(shí)，乙酰甲喹的色譜圖以及紫外吸收光譜圖均在理論范圍之內(nèi)，說明可以清楚地檢測(cè)到乙酰甲喹。如圖8、圖9所示：當(dāng)乙酰甲喹含量在0.02 mg/g時(shí)，乙酰甲喹的峰值、吸收波長均不符合標(biāo)準(zhǔn)，說明基本檢測(cè)不到乙酰甲喹。故得出結(jié)論：本方法的檢測(cè)限為0.2 mg/g。

圖4 乙酰甲喹添加量為2 mg/g的乙酰甲喹色譜圖

圖5 乙酰甲喹添加量為2 mg/g的乙酰甲喹紫外吸收光譜圖

圖6 乙酰甲喹添加量為0.2 mg/g的乙酰甲喹色譜圖

圖7 乙酰甲喹添加量為0.2 mg/g的乙酰甲喹紫外吸收光譜圖

圖8 乙酰甲喹添加量為0.02 mg/g的乙酰甲喹色譜圖

圖9 乙酰甲喹添加量為0.02 mg/g的乙酰甲喹紫外吸收光譜圖

3.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

上機(jī)進(jìn)樣量均為10 μL，觀察色譜圖成峰效果，見表4。乙酰甲喹峰面積的RSD值為0.1%。這表明樣品溶液在24 h內(nèi)非常穩(wěn)定。

表4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

4 討論與小結(jié)

4.1 色譜條件、提取溶劑以及提取波長的選擇

色譜條件的選擇是參考了乙酰甲喹含量檢測(cè)以及氟苯尼考粉中非法添加檢測(cè)的相關(guān)文獻(xiàn)[5-6]，再通過多次篩選，最后確立了合適的色譜條件；參考乙酰甲喹含量檢測(cè)的相關(guān)文獻(xiàn)，表明乙酰甲喹在波長為256 nm處有最大吸收峰值，通過實(shí)驗(yàn)選擇檢測(cè)波長為256 nm。由乙酰甲喹的性質(zhì)得知，乙酰甲喹溶于甲醇，且甲醇又是流動(dòng)相，所以選擇甲醇為提取溶劑。

4.2 檢測(cè)限的確立

方法采用PDA檢測(cè)器，對(duì)乙酰甲喹定性定量的同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，節(jié)約了時(shí)間。由于需要對(duì)乙酰甲喹先進(jìn)行定性檢測(cè)，所以與傳統(tǒng)含量測(cè)定方法(信號(hào)和噪聲的比例為3∶1)不同，方法以光譜圖未失真時(shí)的乙酰甲喹含量作為檢測(cè)限。

4.3 方法評(píng)價(jià)

本研究建立了氟苯尼考粉中非法添加乙酰甲喹測(cè)定的高效液相色譜方法。該方法簡便快捷，靈敏度高，準(zhǔn)確性強(qiáng)，可以有效檢測(cè)氟苯尼考粉中非法添加的乙酰甲喹，為氟苯尼考粉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂提供了參考。