管氏腫腿蜂毒液絲氨酸蛋白酶同源物SgSPH對(duì)寄主血淋巴酚氧化酶活性的影響

李麗芳, 吳朝妍, 韓開(kāi)健, 吳國(guó)星, 朱家穎,*

(1. 西南林業(yè)大學(xué), 云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 昆明 650224;2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 昆明 650201)

毒液作為寄生蜂的關(guān)鍵寄生因子之一，具有調(diào)控寄主生長(zhǎng)發(fā)育、抑制寄主免疫反應(yīng)、影響寄主營(yíng)養(yǎng)代謝等生理功能，在寄生蜂與寄主互作中起重要作用(Kim-Joetal., 2019)。因寄生蜂毒液具有特殊的生理功能，可作為理想的資源用于發(fā)掘抗蟲(chóng)基因，用于新型殺蟲(chóng)制劑或轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物的研發(fā)(Beckage and Gelman, 2004; Danneelsetal., 2010)。而且，系統(tǒng)研究寄生蜂毒液蛋白功能，有助于深入揭示寄生蜂調(diào)控寄主的機(jī)制。雖然目前已就隸屬繭蜂科(Brcaoindae)、姬蜂科(Ichneumonidae)、金小蜂科(Pteromalidae)等近10個(gè)科的20多種寄生蜂毒液組分進(jìn)行鑒定，獲得了豐富多樣的上百種毒液蛋白，但是僅探明了鈣網(wǎng)蛋白、絲氨酸蛋白酶抑制劑和RhoGAP等少數(shù)毒液蛋白的功能(Poiriéetal., 2014; Moreau and Asgari, 2015; Yanetal., 2017; Liuetal., 2018; Yangetal., 2019; Duetal., 2020)。

為了抵御寄生蜂的寄生，寄主昆蟲(chóng)會(huì)利用高效的免疫系統(tǒng)進(jìn)行防御反應(yīng)。血淋巴黑化作為寄主昆蟲(chóng)重要的體液免疫反應(yīng)，可伴隨黑色素的形成，產(chǎn)生多種對(duì)寄生蜂后代有毒的物質(zhì)(Clark, 2020)。酚氧化酶(phenoloxidase, PO)是昆蟲(chóng)體內(nèi)參與黑化反應(yīng)的關(guān)鍵酶，通常以無(wú)活性的酚氧化酶原(prophenoloxidase, PPO)形式存在于昆蟲(chóng)的血淋巴中(Luetal., 2014)。當(dāng)外源物入侵昆蟲(chóng)時(shí)，會(huì)觸發(fā)蟲(chóng)體內(nèi)以酶原形式存在的絲氨酸蛋白酶(serine protease, SP)被激活，形成具有酶活性的酚氧化酶原激活蛋白酶(prophenoloxidase activating proteinase, PAP)，進(jìn)而切割PPO變?yōu)镻O，迅速激活黑化反應(yīng)(張明明等, 2012; Sugumaran and Barek, 2016; Veillardetal., 2016; Whitten and Coates, 2017)。SP酶活性的發(fā)揮是依靠其氨基酸序列內(nèi)存在的由組氨酸(H)、天冬氨酸(D)和絲氨酸(S)組成的催化三聯(lián)體實(shí)現(xiàn)，如果其中某個(gè)催化三聯(lián)體位點(diǎn)氨基酸殘基發(fā)生缺失或突變，其催化功能受影響，將此類蛋白稱為絲氨酸蛋白酶同源物(serine protease homologue, SPH)(Cao and Jiang, 2018)。在昆蟲(chóng)血淋巴黑化反應(yīng)過(guò)程中，SPH對(duì)PO的級(jí)聯(lián)反應(yīng)起到重要的調(diào)控作用(Kanostetal., 2004; Felf?ldietal., 2011)。為了保證后代的成功發(fā)育，寄生蜂需攻克寄主的血淋巴黑化。有關(guān)寄生蜂毒液表觀生理功能研究表明，它普遍具有抑制寄主血淋巴黑化的作用(Beckage and Gelman, 2004; 劉奎等, 2008; Becchimanzietal., 2017; Cusumanoetal., 2018)。

縱觀有關(guān)寄生蜂毒液蛋白組分鑒定的研究結(jié)果可知，SP/SPH是寄生蜂毒液中普遍存在的蛋白組分，且通常作為高豐度蛋白存在(Poiriéetal., 2014; Zhu, 2016; Yeetal., 2020)?；赟P/SPH在昆蟲(chóng)血淋巴黑化反應(yīng)中的重要作用，提示寄生蜂毒液SP/SPH應(yīng)具有參與調(diào)控寄主昆蟲(chóng)血淋巴黑化的功能。然而，迄今有關(guān)寄生蜂毒液SP/SPH的功能研究甚少，僅探明了微紅盤絨繭蜂Cotesiarubecula毒液Vn50(SPH)以及管氏腫腿蜂Sclerodermaguani毒液Vn7(SPH)具有抑制寄主血淋巴黑化的功能，更多寄生蜂毒液SPH的功能有待被揭示(Asgarietal., 2003; Wuetal., 2020)。有鑒于此，本研究對(duì)另外一個(gè)管氏腫蜂毒液SPH基因SgSPH進(jìn)行克隆表達(dá)，并分析其對(duì)寄主黃粉蟲(chóng)Tenebriomolitor蛹血淋巴酚氧化酶活性的影響。本研究結(jié)果將有助于理解和深入研究揭示管氏腫腿蜂毒液抑制寄主血淋巴黑化的內(nèi)在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

管氏腫腿蜂為實(shí)驗(yàn)室繼代飼養(yǎng)種群，采用黃粉蟲(chóng)蛹為寄主進(jìn)行繁育，不定期采集野外蜂種進(jìn)行復(fù)壯(Zhuetal., 2013)。

1.2 基因克隆和序列分析

利用Trizol試劑(Invitrogen)，參照試劑說(shuō)明書，從約35頭管氏腫腿蜂成蟲(chóng)中提取總RNA?？俁NA經(jīng)分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，質(zhì)量合格后，利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(TaKaRa)將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期從管氏腫腿蜂毒液器官轉(zhuǎn)錄組中獲得的SPH基因序列(Zhu, 2016)，設(shè)計(jì)上游引物5′-ACGCCATATACAGTGCAACGT-3′和下游引物5′-TAGGAACCTCTGTTACCATATCT-3′，克隆毒液SgSPH基因的ORF序列。PCR反應(yīng)體系(25 μL): cDNA 1 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, dNTP Mixture 12.5 μL, 超純水9.5 μL。PCR反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性30 s; 94℃變性30 s, 60℃退火40 s, 72℃延伸1 min, 35個(gè)循環(huán); 72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，利用凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化，克隆到pGEM?-T-easy載體(Promega)，藍(lán)白斑篩選，挑取陽(yáng)性克隆送至上海杰李生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。用SignalP 4.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)對(duì)信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)，氨基酸多序列比對(duì)采用Mafft v7.311軟件的L-INS-i算法(Katoh and Standley, 2013)。

1.3 qPCR檢測(cè)基因表達(dá)

分別收集管氏腫腿蜂不同發(fā)育階段(卵、低齡幼蟲(chóng)、高齡幼蟲(chóng)、老熟幼蟲(chóng)、吐絲幼蟲(chóng)、黃繭蛹、黑繭蛹和羽化后1-5 d成蟲(chóng))和解剖雌成蟲(chóng)不同組織(頭部、胸部、去除毒液器官的腹部和毒液器官)樣品于Trizol試劑中，研磨后保存于-80℃冰箱備用。參照試劑說(shuō)明書，提取各樣品總RNA，經(jīng)DNAase處理去除其中的基因組DNA后，使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板。根據(jù)管氏腫腿蜂毒液SgSPH基因的ORF序列設(shè)計(jì)引物(F: 5′-AATACGCCATATACAGTGCAA CGT-3′和R: 5′-GCAATCAGCAAGAGTCAAAAGAAA-3′)，分別以18S RNA(F: 5′-TGGGCCGGTACGTTTA CTTT-3′和R: 5′-CACCTCTAACGTCGCAATAC-3′)和5.8S RNA(F: 5′-AAGAGCGACGCCAAACC-3′和R: 5′-ATG GGTCACTCGACTGGAT-3′)基因作為不同發(fā)育階段和不同組織樣品中基因表達(dá)量檢測(cè)的內(nèi)參基因，采用兩步法擴(kuò)增檢測(cè)SgSPH基因的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣品生物學(xué)重復(fù)3次，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)至少來(lái)自5頭管氏腫腿蜂。qPCR反應(yīng)體系: SYBR? Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) 12.5 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1.0 μL, cDNA 2 μL, ddH2O 8.5 μL。qPCR反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性30 s; 95℃變性5 s, 58℃退火40 s, 45個(gè)循環(huán)。

1.4 基因原核表達(dá)及Western blot檢測(cè)

在管氏腫腿蜂毒液SgSPH基因ORF框兩側(cè)設(shè)計(jì)帶有StuI和HindIII酶切位點(diǎn)的正向引物5′-AGGCCTACGCCATATACAGTGCAACGT-3′(下劃線為StuI酶切位點(diǎn))和反向引物5′-AAGCTTTA-GGAACCTCTGTTACCATATCT-3′(下劃線為HindIII酶切位點(diǎn))，以1.2節(jié)中合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。純化的PCR產(chǎn)物，采用StuI和HindIII進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后在T4 DNA連接酶的作用下于4℃與帶Sumo標(biāo)簽的質(zhì)粒pSUMO-Mut載體(南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司)連接過(guò)夜，獲得重組質(zhì)粒。隨后，將重組質(zhì)粒傳化至大腸桿菌EscherichiacoliTOP10感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

將驗(yàn)證無(wú)誤的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Arctic Express宿主菌，挑取單克隆接種于含氨芐青霉素(50 μg/mL)的LB(Luria Broth)培養(yǎng)液中，于11℃ 220 r/min下培養(yǎng)，使用IPTG(0.5 mmol/L)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將誘導(dǎo)表達(dá)后的培養(yǎng)菌液于低溫6 000 g離心10 min后棄上清，用20 mL裂解緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl， 1 mmol/L PMSF， pH 8.0)重懸菌體沉淀，并對(duì)沉淀進(jìn)行超聲波破碎后，于4℃ 10 000 g離心20 min后棄上清。然后，用緩沖液(20 mmol/L Tris, 5 mmol/L DTT, 8 mol/L尿素，pH 8.0)溶解包涵體，4℃過(guò)夜后15 000 g離心15 min取沉淀，并用包涵體洗滌液(20 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, 2 mol/L尿素, 1 mol/L NaCl, 1% Triton X-100, pH 8.0)洗滌3次，再進(jìn)行超聲破碎。最后，使用Ni-IDA-Sepharose CL-6B親和層析柱純化復(fù)性的基因表達(dá)產(chǎn)物，使用酶將其SUMO表達(dá)標(biāo)簽切除后，再次進(jìn)行親和純化?；虮磉_(dá)情況和切除標(biāo)簽后的基因表達(dá)產(chǎn)物純度使用12% SDS-PAGE電泳進(jìn)行檢測(cè)。

SDS-PAGE電泳后，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用清洗液(PBS-Tween Buffer)進(jìn)行洗滌之后，用5%的脫脂奶粉溶液于室溫下將PVDF膜封閉2 h，然后37℃條件下與SUMO抗體溶液孵育1 h，再用清洗液漂洗3次。接著放入經(jīng)5%脫脂奶粉溶液稀釋的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育1 h。最后，在洗液中漂洗3次后，用DAB顯色后拍照，進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

1.5 酚氧化酶活性測(cè)定

收集化蛹24 h的黃粉蟲(chóng)蛹血淋巴于無(wú)菌的1.5 mL離心管中，于4℃ 3 000 g離心10 min 去除血細(xì)胞，獲得寄主血漿。迅速取6 μL寄主血漿于離心管中，接著往離心管中加入6 μL PBS，0.25和0.50 μg的純化且切除表達(dá)標(biāo)簽的SgSPH重組蛋白，混勻后室溫反應(yīng)15 min。同時(shí)，分別以磷酸緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)和丙基硫尿嘧啶(propylthiouracil, PTU)作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)處理生物學(xué)重復(fù)3次，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)來(lái)自10頭黃粉蟲(chóng)蛹血淋巴。反應(yīng)結(jié)束后，從各離心管中分別取4 μL混合液加入96孔酶標(biāo)板中，分別加入10 μL PBS和180 μL 0.01 mol/L的L-DOPA(Sigma)作為酶底物混勻，于15 min后490 nm處測(cè)定樣品OD值。

1.6 數(shù)據(jù)分析

qPCR數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進(jìn)行計(jì)算(Livak and Schmittgen, 2001)。 所有統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行，采用Fisher’s least significant difference(LSD)法分析不同樣本中管氏腫腿蜂毒液SgSPH基因的相對(duì)表達(dá)量以及不同處理間寄主黃粉蟲(chóng)蛹血淋巴酚氧化酶活性O(shè)D值的差異顯著性。顯著性水平均為P<0.05。 采用GraphPad Prism 7軟件(GraphPad Software Inc.)制圖。

2 結(jié)果

2.1 SgSPH基因克隆及序列特征

克隆獲得的管氏腫腿蜂毒液SgSPH基因(GenBank登錄號(hào): MT920663)的ORF長(zhǎng)為798 bp，編碼265個(gè)氨基酸，其中第1-20位氨基酸預(yù)測(cè)為信號(hào)肽。該基因編碼氨基酸序列的理論分子量為30.53 kD，等電點(diǎn)為9.59。多序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，SgSPH與蝶蛹金小蜂Pteromaluspuparum、微紅盤絨繭蜂、黃痣黑瘤姬蜂Pimplahypochondriaca、阿爾蚜繭蜂Aphidiuservi以及麗蠅蛹集金小蜂Nasoniavitripennis毒液SP/SPH的氨基酸序列一致性在9%～17%之間。而且，三聯(lián)體酶催化活性中心(Asp, His和Ser)的氨基酸殘基在SgSPH氨基酸序列中發(fā)生了突變，其中組氨酸(His)變?yōu)樘於彼?Asp)，天冬氨酸(Asp)變?yōu)樘於０?Asn)，絲氨酸(Ser)突變?yōu)楫惲涟彼?Ile)，具有由6個(gè)保守的半胱氨酸殘基組成的3對(duì)二硫鍵(圖1)。

2.2 SgSPH基因表達(dá)特征

qPCR結(jié)果顯示，管氏腫腿蜂毒液SgSPH基因在卵、幼蟲(chóng)、蛹中低表達(dá)或幾乎不表達(dá)，成蟲(chóng)羽化后開(kāi)始表達(dá)，表達(dá)量逐漸增加，到羽化5 d時(shí)表達(dá)量最高(圖2: A)，該毒液基因在成蟲(chóng)階段的表達(dá)量，與在其他發(fā)育階段的表達(dá)量相比差異顯著(P<0.05)；在毒液器官中高表達(dá)，在頭部、胸部和去除毒液器官的腹部中表達(dá)量較低(圖2: B)。

圖1 管氏腫腿蜂毒液SgSPH與其他寄生蜂毒液SP/SPH蛋白多序列比對(duì)

圖2 管氏腫腿蜂不同發(fā)育階段(A)和雌成蟲(chóng)不同組織中(B)毒液SgSPH基因的表達(dá)分析

2.3 SgSPH基因原核表達(dá)及純化

利用表達(dá)載體pSUMO-Mut對(duì)管氏腫腿蜂毒液SgSPH基因進(jìn)行原核表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該基因低溫條件下可被IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，且主要在包涵體中表達(dá)(圖3)。對(duì)包涵體中的表達(dá)蛋白進(jìn)行復(fù)性處理、親和純化及SUMO標(biāo)簽酶切，SDS-PAGE電泳和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SUMO標(biāo)簽切除前后純化的基因表達(dá)產(chǎn)物純度均高。SUMO標(biāo)簽切除后的重組表達(dá)蛋白分子量約30 kD，這與預(yù)測(cè)的理論分子量吻合。這些結(jié)果表明，成功表達(dá)并純化獲得了管氏腫腿蜂SgSPH重組蛋白，且其純度滿足后續(xù)功能研究。

圖3 管氏腫腿蜂毒液SgSPH基因的原核表達(dá)及蛋白純化

2.4 SgSPH對(duì)寄主血淋巴酚氧化酶活性的影響

以L-DOPA為底物，測(cè)定分析復(fù)性后的管氏腫腿蜂SgSPH重組蛋白對(duì)寄主黃粉蟲(chóng)蛹血淋巴中的酚氧化酶活性的影響。結(jié)果如圖4所示，經(jīng)酚氧化酶抑制劑PTU處理的血淋巴酚氧化酶活性明顯受到抑制。經(jīng)PBS和0.25 μg SgSPH處理的血淋巴酚氧化酶活性間無(wú)顯著差異(P>0.05)，但經(jīng)0.50 μg SgSPH處理的血淋巴酚氧化酶活性顯著低于經(jīng)PBS和0.25 μg SgSPH處理的(P<0.05)，且與經(jīng)PTU處理的血淋巴酚氧化酶活性間無(wú)顯著差異(P>0.05)，表明較高劑量下的管氏腫腿蜂毒液SgSPH能抑制寄主血淋巴黑化。

圖4 管氏腫腿蜂SgSPH重組蛋白對(duì)寄主黃粉蟲(chóng)蛹血淋巴中酚氧化酶活性的影響

3 討論

本研究基于前期管氏腫腿蜂毒液器官轉(zhuǎn)錄組中鑒定到的基因序列，采用RT-PCR方法克隆獲得了管氏腫腿蜂毒液SgSPH基因的ORF序列。序列分析表明，該基因編碼的氨基酸序列中存在信號(hào)肽序列，說(shuō)明它是可以分泌的毒液蛋白，具備典型毒液蛋白的分泌特征(Moreau and Asgari, 2015)。與其他昆蟲(chóng)SP/SPH具有二硫鍵結(jié)構(gòu)一樣，克隆得到的管氏腫腿蜂毒液SgSPH基因編碼的氨基酸序列內(nèi)也存在形成二硫鍵的保守半胱氨酸殘基(Veillardetal., 2016)。就保守的SP催化三聯(lián)體殘基而言，和已報(bào)道的微紅盤絨繭蜂毒液Vn50和管氏腫腿蜂毒液Vn7(Asgarietal., 2003; Wuetal., 2020)相似，本研究克隆得到的毒液SgSPH基因編碼蛋白氨基酸序列的催化三聯(lián)體氨基酸位點(diǎn)發(fā)生了突變或缺失。序列分析結(jié)果不僅表明此處克隆獲得的毒液基因確實(shí)為SPH成員，而且提示該毒液蛋白不具有蛋白水解酶活性。

有關(guān)寄生蜂毒液蛋白組分的鑒定結(jié)果表明，SP/SPH通常在寄生蜂毒液中大量存在(Poiriéetal., 2014)。如，SP/SPH是麗蠅蛹集金小蜂毒液中最具代表性的成分，并在蝶蛹金小蜂Pteromaluspuparum、中紅側(cè)溝繭蜂Microplitismediator、蠅蛹金小蜂Pachycrepoideusvindemmiae等毒液中大量存在(de Graafetal., 2010; Yanetal., 2017; Linetal., 2019; Yangetal., 2020)。此外，對(duì)管氏腫腿蜂毒液蛋白進(jìn)行鑒定，也證實(shí)SP/SPH為該蜂毒液的高豐度組分(Zhu, 2016)。SP/SPH作為寄生蜂的高豐度毒液蛋白，它們會(huì)在毒液器官中高表達(dá)(Becchimanzietal., 2020)。qPCR分析結(jié)果表明，本研究克隆獲得的管氏腫腿蜂毒液SgSPH基因在毒液器官中高表達(dá)，在雌成蟲(chóng)其他組織中也有表達(dá)(圖2: B)。目前，寄生蜂毒液SPH基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不清楚，在毒液器官中高表達(dá)的調(diào)控機(jī)制值得后續(xù)深入研究。此外，基因表達(dá)特征結(jié)果顯示，在不同發(fā)育階段，管氏腫腿蜂毒液SgSPH基因的轉(zhuǎn)錄水平從黑繭蛹開(kāi)始升高，到羽化后5 d的成蟲(chóng)中表達(dá)量最大(圖2: A)，其表達(dá)模式與寄生蜂毒液器官的發(fā)育相符合，同時(shí)也提示其可能參與蟲(chóng)體變黑和變態(tài)發(fā)育等過(guò)程(Liuetal., 2018; Wuetal., 2020)。

酚氧化酶是昆蟲(chóng)血淋巴黑化中的關(guān)鍵酶，其活性高低可以反映昆蟲(chóng)通過(guò)血淋巴黑化防御外來(lái)物入侵的強(qiáng)度(Whitten and Coates, 2017)。寄生蜂為了保證后代的成功發(fā)育，需要有效地抑制寄主昆蟲(chóng)血淋巴黑化反應(yīng)產(chǎn)生的有害物質(zhì)對(duì)其后代造成傷害(Beckage and Gelman, 2004; Kim-Joetal., 2019)。前期研究發(fā)現(xiàn)，管氏腫腿蜂寄生能抑制寄主黃粉蟲(chóng)蛹血淋巴黑化(Wuetal., 2020)。通過(guò)酶活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，0.50 μg劑量下的重組表達(dá)蛋白SgSPH能抑制寄主黃粉蟲(chóng)蛹血淋巴中的酚氧化酶活性(圖4)，表明SgSPH具有抑制寄主血淋巴黑化的功能。目前，已有數(shù)種具有抑制寄主血淋巴黑化功能的寄生蜂毒液蛋白被鑒定，且它們是通過(guò)干擾酚氧化酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)其生理功能(錢岑等, 2013; Wuetal., 2020)。如，布拉迪小環(huán)腹癭蜂Leptopilinaboulardi毒液中的LbSPNy能明顯地抑制寄主體內(nèi)原酚氧化酶級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的激活(Colinetetal., 2009)；微紅絨繭蜂毒液中的Vn50通過(guò)與寄主酚氧化酶級(jí)聯(lián)系統(tǒng)中的SPH競(jìng)爭(zhēng)，從而抑制寄主血淋巴的黑化(Thomas and Asgari, 2011)；蝶蛹金小蜂毒液中的絲氨酸蛋白酶抑制劑PpS1V通過(guò)以寄主血淋巴中的PAP蛋白酶形成復(fù)合物來(lái)抑制原酚氧化酶的激活，進(jìn)而抑制寄主血淋巴黑化(Yanetal., 2017)。據(jù)此認(rèn)為，本研究報(bào)道的管氏腫腿蜂SgSPH可能與上述其他具有抑制寄主血淋巴黑化功能的寄生蜂毒液蛋白作用機(jī)制相似，是通過(guò)干擾寄主酚氧化酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)發(fā)揮抑制寄主血淋巴黑化的功能，其內(nèi)在機(jī)制有待進(jìn)一步研究。