中華按蚊氣味結(jié)合蛋白AsinOBP2的基因克隆、表達(dá)譜及與人體氣味物質(zhì)的結(jié)合特性分析

張嘉俊, 何興菲, 張婷婷, 司風(fēng)玲, 陳 斌, 何正波

(重慶師范大學(xué)昆蟲與分子生物學(xué)研究所, 媒介昆蟲重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 401331)

吸食人血及傳播疾病的蚊蟲主要是按蚊屬Anopheles、伊蚊屬Aedes、曼蚊屬M(fèi)ansonia和庫蚊屬Culex的部分種類(陸寶麟, 2000)。蚊蟲的吸血行為不僅騷擾、叮咬人畜，還傳播多種疾病，包括瘧疾、登革熱、西尼羅河病毒、基孔肯亞熱、黃熱病等，嚴(yán)重威脅著人類的健康(Caraballo and King, 2014)。感知和定位宿主是蚊蟲吸血行為中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，已有研究表明蚊蟲通過嗅覺、視覺、濕度和溫度等刺激來追尋宿主(Bar-Zeevetal., 1977; Bidlingmayer, 1994; Bernieretal., 1999, 2000; Chenetal., 2019)。其中，通過嗅系統(tǒng)覺感知宿主散發(fā)出的氣味物質(zhì)，進(jìn)而順著氣味源搜尋宿主，是蚊蟲定位宿主的主要方式(Bernieretal., 1999)。蚊蟲的嗅覺系統(tǒng)包含多種與嗅覺相關(guān)的功能蛋白，如氣味結(jié)合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)、化學(xué)感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)、氣味受體(odorant receptors, ORs)和離子型受體(ionotropic receptors, IRs)等(Leal, 2013)。氣味結(jié)合蛋白是昆蟲感知外界環(huán)境的基礎(chǔ)(Pelosietal., 2006)，能夠選擇性地結(jié)合并將環(huán)境中的氣味分子通過感器淋巴液運(yùn)輸至位于嗅覺感覺神經(jīng)元(olfactory sensory neurons, OSNs)膜上的ORs(王桂榮等, 2004)。

在長期的進(jìn)化過程中，蚊蟲對宿主的偏好有明顯的分化，比如岡比亞按蚊Anophelesgambiae、埃及伊蚊Aedesaegypti嗜吸人血，而中華按蚊Anophelessinensis則兼吸人、畜血液。已有研究表明，宿主氣味物質(zhì)的種類和含量差異是造成蚊蟲宿主偏好的重要原因之一(Patesetal., 2001; Qiuetal., 2006a; Omranietal., 2010; Verhulstetal., 2016)。通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC/MS)鑒定人體氣味物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)人體不同部位氣味物質(zhì)的數(shù)量和種類存在差異(吳德華等, 2003a, 2003b; 代勇等, 2009)。Bernier等(2000)采用GC/MS對人體皮膚氣味物質(zhì)進(jìn)行分析，共鑒定出277種成分，包括羧酸類、醇類、醛類、酰胺/胺類、酯類、鹵化物類、酮類、硫化物、鹵化物、硫酯類、雜環(huán)類、脂肪族化合物和芳香族類化合物等。通過行為和電生理測定，這些人體氣味物質(zhì)中的一些組分在一定的劑量下能夠引起蚊蟲產(chǎn)生較強(qiáng)的電生理反應(yīng)，并表現(xiàn)出引誘或驅(qū)避的效果(Mboeraetal., 1998; Purietal., 2006; Cooperbandetal., 2008; Seenivasaganetal., 2013; Guhaetal., 2014; Chenetal., 2019)。比如，在Y型管引誘實(shí)驗(yàn)中，乳酸顯著吸引埃及伊蚊(Geier and Boeckh, 1999)，3-甲基-1-丁醇會顯著吸引岡比亞按蚊(Verhulstetal., 2011; Zohdyetal., 2015)，辛酸和吲哚在一定濃度下也呈現(xiàn)出對蚊蟲的引誘作用(余靜等, 2012)。致倦庫蚊Culexquinquefasciatus雌蚊對人體皮膚揮發(fā)物質(zhì)的觸角電位和行為反應(yīng)測定發(fā)現(xiàn)，C3-C13的羧酸均會在一定劑量下引起致倦庫蚊產(chǎn)生EAG反應(yīng)，而C14-C18的羧酸不能引起EAG反應(yīng)，C3, C6, C7, C8, C9, C11, C13和C14的羧酸能對雌蚊有吸引作用；丙三醇、乙二醇、苯甲醇、膽固醇、苯酚、正癸醇、苯甲醛、正庚醛、正丙醛和正壬醛均能引起顯著的EAG反應(yīng)，其中乙二醇、苯甲醇、膽固醇、正癸醇、正庚醛、正丙醛和正壬醛均有吸引作用(Purietal., 2006)。通過這些研究，證實(shí)人體氣味物質(zhì)通過蚊蟲的嗅覺系統(tǒng)影響蚊蟲的宿主搜尋行為。有些人體氣味物質(zhì)，例如辛醇還被進(jìn)一步開發(fā)成引誘劑，用于蚊蟲種群監(jiān)測或防治(Bonvechio, 1991; Bernieretal., 1999, 2000; Smallegangeetal., 2010)。因此，深入研究宿主氣味物質(zhì)與蚊蟲的互作關(guān)系有助于揭示蚊蟲追尋宿主的機(jī)制，開發(fā)新型蚊蟲引誘劑或驅(qū)避劑。

中華按蚊隸屬于雙翅目(Diptera)蚊科(Culicidae)，是中國廣大平原地區(qū)傳播瘧疾的重要媒介，也是中國和亞洲東南部其他國家傳播絲蟲病的媒介之一(Zmuanpuiietal., 2014)。對于中華按蚊嗅覺系統(tǒng)的研究，有助于減少蚊蟲與人類宿主的接觸，防止傳染病的傳播，也可為基于嗅覺的行為調(diào)控提供理論依據(jù)。在前期研究中，從中華按蚊基因組數(shù)據(jù)中共鑒定了64個氣味結(jié)合蛋白基因，分屬于Classic, Plus-C和Atypical 3個亞家族(Heetal., 2016)；從中華按蚊不同組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，AsinOBP1,AsinOBP2,AsinOBP7,AsinOBP66等基因在雌蚊觸角中富集表達(dá)，通過CRISPR/Cas9技術(shù)突變AsinOBP1基因，蚊蟲對宿主的追尋能力下降，吸血受到影響(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。這些前期的研究結(jié)果暗示這些在雌蚊觸角高表達(dá)的OBP基因可能在追尋宿主中起著重要的作用。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，利用qPCR研究了AsinOBP2基因在中華按蚊不同發(fā)育時期、成蟲不同組織及吸血前后的表達(dá)水平，通過構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)、Ni離子親和層析技術(shù)獲得了較高純度的重組蛋白，利用熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)測試了重組蛋白與39種人體氣味物質(zhì)的結(jié)合特性，為進(jìn)一步探究AsinOBP2在中華按蚊嗅覺系統(tǒng)和追尋宿主中的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

實(shí)驗(yàn)用中華按蚊種群飼養(yǎng)于重慶師范大學(xué)昆蟲與分子生物學(xué)研究所，自交保種已超過30代。幼蟲用魚飼料飼養(yǎng)于清水中，待其化蛹后挑出放于塑料小桶中等待羽化。成蚊用10%葡萄糖水飼養(yǎng)，羽化后第3天用麻醉的小鼠喂血，供繁殖傳代。蚊蟲飼養(yǎng)條件：溫度27±1℃，相對濕度75%±5%，光周期12L∶12D。

1.2 試劑

Trizol購自Ambion公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Thermo公司，3′RACE試劑盒3′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends購自Invitrogen公司，2×Pro Taq Master Mix、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和DNA提取試劑盒購自康維世紀(jì)生物科技有限公司，SYBR Premix ExTaq、限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶、ExTaq DNA聚合酶購自TaKaRa公司，克隆試劑盒pEASY?-Blunt Zero Cloning Kit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，表達(dá)感受態(tài)Rosetta(DE3)菌株購自上海唯地生物科技有限公司，1-NPN熒光探針購自Sigma公司，氣味標(biāo)樣購自Macklin公司。

1.3 總RNA提取及cDNA合成

收集中華按蚊3日齡雌、雄成蟲觸角(各100頭，約200根觸角)、喙(各100根)和下顎須(各100頭，約200根下顎須)；收集中華按蚊雌雄蛹、剛羽化成蚊以及羽化后第1, 2, 3, 6和9天成蚊各3頭；收集取吸血前和吸血后12, 24和48 h的3日齡雌成蚊以及同時期未吸血雌成蚊(對照)各3頭。以上為各種樣品的一個生物學(xué)重復(fù)。參照RNA提取試劑說明書提取總RNA，用核酸蛋白濃度測定儀(NanoDrop ND-1000)檢測總RNA濃度及純度，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。利用DNase I除去總RNA中的基因組DNA后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 AsinOBP2基因克隆和生物信息學(xué)分析

根據(jù)已鑒定的AsinOBP2基因序列(Heetal., 2016)，設(shè)計特異性引物用于AsinOBP2基因編碼序列的驗(yàn)證和3′端非編碼序列的克隆，引物序列見表1。 以中華按蚊雌蟲觸角cDNA為模板擴(kuò)增AsinOBP2基因編碼序列。PCR反應(yīng)體系(25 μL): cDNA模板1 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1 μL, 2×Pro Taq Master Mix 12.5 μL, 去離子水9.5 μL。PCR反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性5 min; 95℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 30 s, 35個循環(huán); 72℃延申5 min, 12℃保存。3′端非編碼序列的擴(kuò)增參照RACE試劑盒說明書，進(jìn)行兩輪巢式PCR，反應(yīng)體系: 中華按蚊雌蟲觸角cDNA模板1 μL, 引物各1 μL, ExTaq酶12.5 μL, 去離子水9.5 μL，混勻離心后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，首輪PCR產(chǎn)物稀釋20倍取1 μL作為第二輪PCR的模板。反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性5 min; 95℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 30 s, 35個循環(huán); 72℃延伸2 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，將符合預(yù)期大小的DNA片段切膠回收，克隆后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

表1 本研究所用引物

用DNAMAN 4.0軟件拼接AsinOBP2基因的測序片段，組裝成為全長的cDNA序列。 用AsinOBP2基因cDNA序列在VectorBase進(jìn)行在線比對(https:∥www.vectorbase.org/blast)，提取中華按蚊基因組序列，用GENSCAN預(yù)測基因，分析內(nèi)含子、外顯子結(jié)構(gòu)(https:∥genes.mit. edu/ GENSCAN.html)。用在線軟件(http:∥www.Expasy.org/compute_pi/)對蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)等基本物理形狀進(jìn)行分析預(yù)測，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域采用SAMART軟件進(jìn)行分析(http:∥ smart.embl-heidelberg.de/)，信號肽分析采用SignalP 5.0 Server軟件(http:∥www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/)。分別以AsinOBP2基因的核酸和蛋白質(zhì)序列為詢問序列，在VectorBase搜索同源序列，使用MEGA4.0軟件中的鄰接(neighbor-joining, NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分支節(jié)點(diǎn)支持率采用1 000次重復(fù)抽樣進(jìn)行氨基酸序列聚類分析。

1.5 AsinOBP2基因在中華按蚊不同發(fā)育時期、不同組織及吸血前后雌成蚊中的表達(dá)分析

以中華按蚊RibosomalproteinS7(Rps7)基因(Unigene23940_5，見中華按蚊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)GBEO01000000)為內(nèi)參基因，利用CFX-96實(shí)時熒光定量PCR儀(Bio-Rad)檢測AsinOBP2基因的表達(dá)量，定量PCR引物見表1，反應(yīng)體系(20 μL): SYBR Premix ExTaq 10 μL, cDNA模板 1 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各0.8 μL, ddH2O 7.4 μL。反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性3 min; 95℃ 10 s, 60℃ 30 s, 72℃30 s, 共40個循環(huán)；最后在60℃～95℃記錄熔解曲線。各時期個體或組織樣品以1.3節(jié)合成的cDNA作cDNA模板。每種樣品設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，每樣品重復(fù)測定3次。利用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。

1.6 AsinOBP2基因的原核表達(dá)與純化

以中華按蚊雌蟲觸角cDNA為模板，利用帶有酶切位點(diǎn)的特異性引物(表1)擴(kuò)增AsinOBP2基因的全長編碼序列，將擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后連接至克隆載體(pEASY?-Blunt Zero Cloning Vector)并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆，震蕩培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA測序驗(yàn)證。 將AsinOBP2克隆載體和pET-28a(+)質(zhì)粒DNA用限制性內(nèi)切酶BamH I和HindⅢ在37℃酶切4 h，純化回收后在T4 DNA連接酶的作用下將目的片段連接到表達(dá)載體pET-28a(+)上。最后將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂板培養(yǎng)后，挑單菌落接種于LB培養(yǎng)液中過夜震蕩培養(yǎng)(37℃ 200 r/min)。將小量培養(yǎng)后的菌液按1∶100(v/v)接種至500 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 220 r/min震蕩培養(yǎng)至OD600=0.4～0.6時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，30℃誘導(dǎo)表達(dá)2.5～3 h，收集菌體后用超聲波進(jìn)行破碎處理(500 W，45次，每次10 s，間隔10 s)，4℃ 12 000×g離心30 min后分別收集上清和沉淀，SDS-PAGE檢測蛋白的表達(dá)情況。參照Ni-Agarose His 標(biāo)簽蛋白純化說明書進(jìn)行親和層析純化蛋白，純化后的重組蛋白置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)

采用熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)測定AsinOBP2與39種人體氣味物質(zhì)(表2)的結(jié)合能力。熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)使用HITACHI公司的F-2500型熒光分光光度計進(jìn)行，所用容器為1 cm寬的石英杯，狹縫寬度為10 nm。將熒光探針1-NPN溶于甲醇，終濃度為1 mmol/L。在測定熒光探針與AsinOBP2的結(jié)合常數(shù)時，設(shè)定激發(fā)光波長為337 nm，掃描的發(fā)射光波長為390～500 nm。向石英杯中加入50 mmol/L的Tris Buffer(pH 7.4)，然后加入AsinOBP2蛋白，使其終濃度為2 μmol /L，充分混勻并靜置2 min后掃描并記錄發(fā)射光譜。隨后加入1-NPN溶液，使1-NPN終濃度依次從2～16 μmol /L，濃度梯度每次增加2 μmol /L。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，利用Scatchard方程計算AsinOBP2 /1-NPN的結(jié)合常數(shù)。測定氣味物質(zhì)與AsinOBP2的結(jié)合常數(shù)時，首先配制氣味標(biāo)樣，將各種氣味標(biāo)樣溶于甲醇溶液，使其終濃度為1 mmol/L，放在4℃冰箱備用，然后在石英杯中加入50 mmol/L的Tris Buffer(pH 7.4)，然后加入熒光探針1-NPN及AsinOBP2蛋白，使其終濃度為2 μmol/L。隨后加入1 mmol/L的氣味物質(zhì)，氣味物質(zhì)終濃度為10, 20, 30, 40, 50, 60和70 μmol/L的梯度加入到熒光探針1-NPN與AsinOBP2蛋白混合溶液中，記錄最大的熒光強(qiáng)度值，每個樣品3次重復(fù)。假設(shè)蛋白活性為100%，在飽和情況下蛋白和配基結(jié)合的比例為1∶1，根據(jù)公式Ki=[IC50]/(1+[1-NPN]/K1-NPN)計算蛋白與氣味配體的解離常數(shù)Ki，其中IC50為氣味配體使熒光值降低到初始熒光值一半時的濃度(配基能替換50% 的1-NPN時的濃度)，[1-NPN]為未結(jié)合的1-NPN濃度，K1-NPN為AsinOBP2與1-NPN的解離常數(shù)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

目的基因在成蟲不同部位和不同時期的表達(dá)量差異用單因素方差分析(Turkey氏檢驗(yàn))進(jìn)行檢驗(yàn)，在雌雄間及吸血與未吸血間的表達(dá)量差異用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(independent samplest-test)進(jìn)行檢驗(yàn)，以P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 AsinOBP2基因克隆與序列特征

AsinOBP2的編碼序列擴(kuò)增和3′RACE擴(kuò)增均得到一個單一的條帶。測序后進(jìn)行序列拼接，獲得AsinOBP2基因全長的cDNA序列，其開放閱讀框長492 bp，編碼163個氨基酸，3′端非編碼區(qū)186 bp，預(yù)測等電點(diǎn)為5.18，分子量為18.8 kD。將AsinOBP2基因cDNA序列比回到基因組序列，得到AsinOBP2的基因結(jié)構(gòu)(GenBank登錄號: MT700441)，包含2個外顯子和1個內(nèi)含子，外顯子1長474 bp，外顯子2長204 bp，內(nèi)含子長80 bp。利用SignalP 5.0 Server進(jìn)行信號肽預(yù)測，N端疏水區(qū)包含由起始位置開始的30個氨基酸組成的信號肽，推測AsinOBP2為分泌型蛋白。序列比對分析發(fā)現(xiàn)AsinOBP2有一個保守的PhBP結(jié)構(gòu)域(第59-156位氨基酸，E=4.77e-20)。

將AsinOBP2氨基酸序列與其他按蚊屬蚊蟲的OBP2進(jìn)行多序列比對發(fā)現(xiàn)，AsinOBP2具有氣味結(jié)合蛋白的典型特征，含有6個高度保守的半胱氨酸殘基， 屬于Classic亞家族(圖1)。同源性分析顯示AsinOBP2與與岡比亞按蚊OBP2、黑小按蚊AnophelesatroparvusOBP2、白魔按蚊An.albimanusOBP2和致倦庫蚊OBP2的氨基酸序列一致性分別為70.2%, 63.6%, 59.7%和51.7%。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，AsinOBP2與白魔按蚊和黑小按蚊的OBP2聚類到獨(dú)立的Classic OBP進(jìn)化枝(圖2)，表明它們在進(jìn)化上關(guān)系更密切。

圖1 中華按蚊AsinOBP2與其他蚊蟲OBP2蛋白的氨基酸序列比對

圖2 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的中華按蚊AsinOBP2與其他昆蟲OBPs的系統(tǒng)發(fā)育樹(1 000次重復(fù))

2.2 AsinOBP2的時空表達(dá)譜

qPCR結(jié)果顯示，AsinOBP2在雌、雄蛹中幾乎沒有表達(dá)；在雄成蟲中始終維持較低的表達(dá)水平，而在雌成蟲中的表達(dá)水平逐漸增強(qiáng)，羽化后第6天達(dá)到最高，隨后下降；在剛羽化和羽化后第1天的雌、雄成蟲之間表達(dá)差異不顯著(P>0.05)，羽化第2-6天在雌成蟲中的表達(dá)水平顯著高于在雄成蟲中的(P<0.05)(圖3: A)，羽化后第2, 3和6天雌蟲的表達(dá)量分別是雄成蟲的6.45, 3.49和6.61倍。AsinOBP2主要在3日齡成蟲觸角中表達(dá)，在雌、雄成蟲觸角中的表達(dá)水平均顯著高于在下顎須和喙中的(P<0.05)(圖3: B)；AsinOBP2在雌成蟲觸角中的表達(dá)量分別是在喙和下顎須中的43.1倍和155.1倍，在雄成蟲觸角中的表達(dá)量分別是在喙和下顎須中的4.1和142倍。AsinOBP2在吸血后的表達(dá)水平顯著下調(diào)(圖4)，吸血后12, 24和48 h時對照組的表達(dá)量分別是吸血組的4.67, 7.53和65倍。

2.3 AsinOBP2的原核表達(dá)與純化

將成功構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET-28a(+)/AsinOBP2轉(zhuǎn)入宿主菌Rosetta(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出目的蛋白。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示目的蛋白主要以包涵體形式表達(dá)(圖5: A)，通過變性，純化，透析復(fù)性后在21 kD左右處出現(xiàn)預(yù)期的單一條帶(圖5: B)。

2.4 AsinOBP2重組蛋白與人氣味配體的結(jié)合能力

圖3 AsinOBP2在中華按蚊不同發(fā)育時期(A)及3日齡成蟲不同嗅覺組織中(B)的相對表達(dá)量

圖4 AsinOBP2在中華按蚊羽化后3 d雌成蟲吸血前后的相對表達(dá)量

圖5 AsinOBP2的表達(dá)(A)和純化(B)的SDS-PAGE分析

重組蛋白AsinOBP2在337 nm激發(fā)光波長下自身無明顯的內(nèi)源熒光信號。向AsinOBP2重組蛋白中以2 μmol/L的濃度梯度加入1-NPN溶液，在410 nm進(jìn)行掃描，熒光強(qiáng)度的增幅隨加入1-NPN的濃度增加而逐漸增強(qiáng)，最終蛋白和1-NPN的結(jié)合達(dá)到飽和，通過Scachard方程對AsinOBP2與1-NPN的結(jié)合曲線進(jìn)行線性化，計算出該蛋白與1-NPN的解離常數(shù)為8.310 μmol /L(圖6)。AsinOBP2與人體氣味物質(zhì)的熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在測定的39種氣味物質(zhì)中，僅有12種能將熒光探針1-NPN從重組AsinOBP2蛋白溶液中替換50%以上，說明AsinOBP2的氣味結(jié)合譜較窄，具有選擇性識別人體氣味物質(zhì)的特性(圖7)。AsinOBP2與部分醛、醇、酸和雜環(huán)族化合物有結(jié)合活性，與吲哚結(jié)合能力最強(qiáng)，解離常數(shù)Ki=27.15 μmol/L；與正丙胺、2-甲基丁醛、葵醛具有一定結(jié)合能力，其解離常數(shù)Ki分別為42.49, 48.33和47.90 μmol /L；與3-甲基吲哚、己醛、正庚醛、正戊醛、正癸酸、對二甲苯、乙基苯和反式-2-己烯醇結(jié)合能力較弱(Ki>50 μmol /L)，與其他28種氣味分子不能結(jié)合(表2)。

圖6 AsinOBP2重組蛋白與1-NPN的結(jié)合曲線及斯卡查德方程

3 討論

本研究qPCR分析發(fā)現(xiàn)，AsinOBP2在雌成蟲觸角中高表達(dá)(圖3: B)，與嗅覺組織的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致(數(shù)據(jù)未提供)；不同發(fā)育時期的定量分析顯示，AsinOBP2在雌成蟲中的表達(dá)水平顯著高于雄成蟲的，而且在羽化后呈上升表達(dá)趨勢，在雄成蟲中則始終維持在較低的表達(dá)水平(圖3: A)。 與AsinOBP2直系同源的岡比亞按蚊OBP2基因(AgamOBP2)在雌成成蟲中的表達(dá)水平高于雄成蟲，主要在雌成蟲頭部高表達(dá)(Marinottietal., 2006)；雌成蟲AgamOBP2的表達(dá)水平在羽化后呈現(xiàn)上升趨勢， 而在雄成蟲中則維持穩(wěn)定的低水平表達(dá)(Cook and Sinkins 2010)，與AsinOBP2的表達(dá)模式一致。觸角是昆蟲最重要的嗅覺器官，AsinOBP2在雌成蟲的觸角中高表達(dá)，推測其與雌成蟲的特異性行為有關(guān)，比如追尋宿主、吸血和尋找產(chǎn)卵場所等。AsinOBP2基因的表達(dá)水平在雌成蟲吸血后顯著下降(圖4)，與AsinOBP2基因直系同源的岡比亞按蚊AgamOBP2和致倦庫蚊CquiOBP2在吸血后表達(dá)水平均顯著下降 (Pintoetal., 2009; Tapariaetal., 2017)，與蚊蟲吸血后進(jìn)入靜息狀態(tài)的行為相契合，說明AsinOBP2基因可能與追尋宿主有關(guān)。

圖7 人體氣味物質(zhì)分子和1-NPN與重組蛋白AsinOBP2的競爭結(jié)合

表2 重組蛋白AsinOBP2與人體氣味物質(zhì)的結(jié)合能力

為了進(jìn)一步驗(yàn)證AsinOBP2基因的功能，對其進(jìn)行了原核表達(dá)和與人體氣味物質(zhì)的結(jié)合特性分析。蚊蟲通過嗅覺感知人體揮發(fā)物，進(jìn)而逆向追蹤。Bernier等(2000)采用GC/MS對人體皮膚揮發(fā)物進(jìn)行分析，檢測到了346個峰，鑒定出277種化合物。采用單感記錄儀測定其中103種氣味物質(zhì)引起埃及伊蚊的電生理反應(yīng)，結(jié)果顯示89種物質(zhì)能夠引起明顯的刺激或抑制反應(yīng)(Chenetal., 2019)。根據(jù)Chen等(2019)的結(jié)果，選取了反應(yīng)較強(qiáng)的39種人體氣味物質(zhì)，通過熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)測定了AsinOBP2與這些物質(zhì)的結(jié)合能力，結(jié)果顯示12種氣味物質(zhì)能夠?qū)sinOBP2/1-NPN復(fù)合體中的1-NPN競爭至50%以下(表2)。在12種結(jié)合的物質(zhì)中，與吲哚的結(jié)合能力最強(qiáng)(Ki=27.15 μmol/L)，與其余物質(zhì)的結(jié)合能力較弱(Ki>40 μmol/L)，說明AsinOBP2能夠選擇性地結(jié)合人體揮發(fā)物中的一些組分，在中華按蚊追尋宿主的過程中起著作用。本研究中人體氣味物質(zhì)的選擇是依據(jù)埃及伊蚊電生理的結(jié)果，有可能導(dǎo)致與AsinOBP2親和力更強(qiáng)的氣味物質(zhì)被人為地遺漏。因此，吲哚是不是人體揮發(fā)物中與AsinOBP2親和力最強(qiáng)的天然配體，還有待進(jìn)一步研究。擴(kuò)大人體氣味物質(zhì)篩選的數(shù)量，將有可能篩選到與AsinOBP2親和力更強(qiáng)的人體氣體物質(zhì)。

吲哚屬于芳香族雜環(huán)有機(jī)化合物，人體表某些種類的細(xì)菌能夠分解色氨酸產(chǎn)生吲哚，是人體揮發(fā)物中的主要組分(Elgaalietal., 2002)，甚至可以占到汗液揮發(fā)物的30%以上。除AsinOBP2外，中華按蚊AsinOBP1(未發(fā)表數(shù)據(jù))和岡比亞按蚊AgamOBP1也能結(jié)合吲哚(Biessmannetal., 2010; Dimitratosetal., 2019)，說明吲哚可與多種氣味結(jié)合蛋白結(jié)合。吲哚能引起岡比亞按蚊雌成蚊觸角毛狀感器的強(qiáng)烈電生理反應(yīng)(Blackwell and Johnson 2000; Meijerinketal., 2000; Qiuetal., 2006b)，并可以激活埃及伊蚊(Sijuetal., 2010)、致倦庫蚊(Hilletal., 2009; Syed and Leal, 2009)和環(huán)跗庫蚊Culextarsalis(Du and Millar, 1999)的嗅覺受體神經(jīng)元。用RNAi方法抑制AgamOBP1基因的表達(dá)，岡比亞按蚊對吲哚的觸角電位反應(yīng)明顯減弱(Biessmannetal., 2010)；抑制致倦庫蚊CquiOBP1表達(dá)，對吲哚的觸角電位反應(yīng)也顯著減弱(Pelletieretal., 2010)。由此可見，蚊蟲能夠通過嗅覺系統(tǒng)感知人體揮發(fā)物中的吲哚，進(jìn)而感知宿主；AsinOBP2基因可能是通過識別人體揮發(fā)物中的吲哚等氣味物質(zhì)，感知和追尋宿主。

致倦庫蚊CquiOBP2蛋白的結(jié)合特性研究發(fā)現(xiàn)，CquiOBP2能結(jié)合3-甲基吲哚(skatole)，不能結(jié)合吲哚(Yinetal., 2015)。AsinOBP2與CquiOBP2為直系同源基因，氨基酸序列一致性為51.7%，但AsinOBP2的結(jié)合特性與CquiOBP2相反，能夠結(jié)合吲哚，而與3-甲基吲哚結(jié)合能力很弱(表2)。通過同源建模、分子對接和定點(diǎn)突變等方法比較研究這兩個蛋白的結(jié)合特性和結(jié)構(gòu)差異，將有助于揭示AsinOBP2結(jié)合配體的機(jī)制。除此之外，吲哚和3-甲基吲哚既是人體揮發(fā)物的主要組分，又是岡比亞按蚊和致倦庫蚊典型的產(chǎn)卵刺激劑(Millaretal., 1992; Blackwell and Johnson, 2000)。AsinOBP2能夠結(jié)合吲哚，是否說明AsinOBP2與雌蚊尋找產(chǎn)卵場所有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。

本研究通過表達(dá)分析證實(shí)AsinOBP2在中華按蚊雌成蟲觸角中富集表達(dá)，在羽化后的雌成蟲中表達(dá)水平逐漸增強(qiáng)，吸食血液后表達(dá)水平顯著下降，而且AsinOBP2能夠結(jié)合吲哚等人體氣味物質(zhì)，說明AsinOBP2在中華按蚊的嗅覺系統(tǒng)中起著重要的作用，可能與雌成蟲追尋宿主有關(guān)。還需要通過RNAi或基因編輯、電生理、行為學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)等方法進(jìn)一步研究該基因的功能，為基于AsinOBP2蛋白篩選引誘或驅(qū)避劑、或進(jìn)行行為調(diào)控以減少蚊蟲與人類接觸的機(jī)會奠定基礎(chǔ)。