昆蟲miRNA研究進(jìn)展

楊 婕, 謝 苗, 徐雪嬌, 白建林, 尤民生,*

(1. 福建農(nóng)林大學(xué), 閩臺(tái)作物有害生物生態(tài)防控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福州350002; 2. 福建農(nóng)林大學(xué)應(yīng)用生態(tài)研究所, 福州350002;3. 福建農(nóng)林大學(xué), 教育部害蟲生態(tài)防控國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室, 福州350002; 4. 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 福州350002)

微小RNA(microRNA, miRNA)是一類內(nèi)源性的長度約為19～24 nt的單鏈非編碼小RNA，廣泛分布于動(dòng)物、植物以及微生物體內(nèi)，在基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控(post-transcriptional regulation)中起著至關(guān)重要的作用，參與調(diào)控胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、增殖、神經(jīng)發(fā)生、能量代謝、細(xì)胞凋亡以及晝夜節(jié)律等多種生物進(jìn)程(Legeaietal., 2010)。據(jù)估計(jì)，動(dòng)物中約有50%以上編碼蛋白的基因的表達(dá)都受到miRNA的調(diào)控(Kroletal., 2010)。

Lee等(1993)在秀麗隱桿線蟲Caenorhabditiselegans幼蟲中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)由lin-4基因編碼產(chǎn)生的短鏈RNA，該短鏈RNA與lin-14基因3′UTR區(qū)存在的多個(gè)重復(fù)序列反向互補(bǔ)，因而能夠通過負(fù)鏈RNA-RNA互作時(shí)序性抑制lin-14基因的蛋白合成。Reinhart等(2000)在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)了另一種具有時(shí)序調(diào)節(jié)功能的基因，將其命名為let-7。這類參與時(shí)序調(diào)節(jié)的RNA片段一般長度較短，且參與調(diào)控細(xì)胞發(fā)育進(jìn)程，也被稱作小時(shí)序RNA(small temporal RNA, stRNA)，stRNA的發(fā)現(xiàn)掀起了對(duì)非編碼小RNA的鑒定以及對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行研究的熱潮。2001年，美國和德國的3個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)在《Science》報(bào)道了幾十個(gè)來自秀麗隱桿線蟲、黑腹果蠅Drosophilamelanogaster以及人類Homosapiens的小RNA，由于這些基因具有相似的加工過程、結(jié)構(gòu)、生理功能以及作用機(jī)制，科學(xué)家將這一類RNA統(tǒng)一命名為microRNA(miRNA)，這也是對(duì)昆蟲miRNA最早的報(bào)道。

繼miRNA被發(fā)現(xiàn)后，其在昆蟲中的研究工作逐漸開始發(fā)展，在Web of Science上以“microRNA insect”或“miRNA insect”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，可以發(fā)現(xiàn)在21世紀(jì)相關(guān)報(bào)道逐漸增多，迄今為止已超過1 200篇，內(nèi)容涉及miRNA及其靶標(biāo)的鑒定、昆蟲抗藥性、抗病毒機(jī)制、免疫機(jī)制、昆蟲行為和其生長發(fā)育等多個(gè)方面，相關(guān)引文數(shù)量也不斷增加。隨著miRNA相關(guān)研究的不斷深入，其鑒定方法和技術(shù)也得到了大幅改進(jìn)，研究人員相繼在許多物種中鑒定得到了大量已知和新的miRNA，為后續(xù)miRNA的相關(guān)研究建立了堅(jiān)實(shí)的工作基礎(chǔ)。

1 miRNA概述

1.1 miRNA的生物合成

miRNA的生物合成過程較為復(fù)雜，動(dòng)物中成熟miRNA的合成過程主要包括4個(gè)步驟：轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞核內(nèi)加工、細(xì)胞核輸出以及細(xì)胞質(zhì)加工。首先，miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase II)的催化作用下，轉(zhuǎn)錄生成長度可達(dá)1 kb以上的雙鏈miRNA前體，即miRNA初始轉(zhuǎn)錄物(Pri-miRNA)，Pri-miRNA可自發(fā)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Cullen, 2004; Leeetal., 2004)。隨后，Pri-miRNA在細(xì)胞核內(nèi)被RNase Ⅲ家族的雙鏈RNA結(jié)合蛋白Pasha(哺乳動(dòng)物和線蟲中稱為DGCR8)特異識(shí)別，并被其與Drosha內(nèi)切酶所形成的復(fù)合物剪切成為長度約為70～100 nt的miRNA前體(Pre-miRNA)，同時(shí)在其3′末端產(chǎn)生2個(gè)未配對(duì)的核苷酸。核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5可以特異識(shí)別并緊密結(jié)合Pre-miRNA 3′端突出的2個(gè)未配對(duì)核苷酸，將其從細(xì)胞核運(yùn)送至細(xì)胞質(zhì)中。Pre-miRNA在細(xì)胞質(zhì)中被釋放出來并進(jìn)一步被Dicer酶剪切成為miRNA-miRNA*雙鏈分子(Kettingetal., 2001; Knight and Bass, 2011)，即未成熟的miRNA(imperfect miRNA)。miRNA-miRNA*雙鏈分子再與以Argonaute 1(AGO1)為核心的蛋白質(zhì)復(fù)合體相結(jié)合，雙鏈分子打開成為兩條單鏈的miRNA，其中一條鏈即為成熟的miRNA，稱為向?qū)ф?guide strand)，向?qū)ф渽⑴c形成miRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(miRNA-induced silencing complex, miRISC)，遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與靶基因結(jié)合，調(diào)控基因表達(dá)(Bartel, 2004)，另一條miRNA*即為隨從鏈(passenger strand)(圖1: A)。由于沒有相應(yīng)蛋白質(zhì)的保護(hù)，miRNA*容易被迅速降解，因而其豐度遠(yuǎn)低于miRNA(Lagos-QuiIltanaetal., 2002)。但是目前隨著miRNA相關(guān)研究的不斷深入，有一些證據(jù)表明，miRNA*也可與AGO蛋白結(jié)合從而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)(F?rstemannetal., 2007; Tomarietal., 2007; Okamuraetal., 2009)，也可能會(huì)轉(zhuǎn)變成為新的miRNA或有功能的miRNA產(chǎn)物(Okamuraetal., 2008)。

1.2 miRNA的作用方式

目前，對(duì)小鼠Musmusculus、秀麗隱桿線蟲、黑腹果蠅和擬南芥Arabidopsisthaliana等模式生物中的miRNA及其調(diào)控機(jī)制的研究工作已取得一定進(jìn)展(Babiarzetal., 2008; Enderetal., 2008; Ravasietal., 2010)。

成熟miRNA的5′端第2-8位核苷酸被稱為miRNA的“種子序列(seed sequence)”，通常能與靶基因mRNA的3′UTR區(qū)以堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行結(jié)合從而調(diào)控基因表達(dá)(Leeetal., 1993; Wightmanetal., 1993)。除此之外，miRNA也可以作用于靶基因ORF以及5′UTR(Orometal., 2008)。已有研究表明，超半數(shù)的AGO蛋白與miRNA的結(jié)合位點(diǎn)位于ORF區(qū)內(nèi)(Chietal., 2009; Greyetal., 2010; Hafneretal., 2010)。在ORF區(qū)和3′UTR區(qū)均含有靶位點(diǎn)的基因的mRNA和蛋白的表達(dá)水平略低于僅在3′UTR有靶標(biāo)位點(diǎn)的基因，同時(shí)其表達(dá)也會(huì)受到更多調(diào)控(Fang and Rajewsky, 2011)。miRNA一般通過兩種機(jī)制負(fù)向調(diào)控靶基因的表達(dá)：在植物中，miRNA通過與靶基因完全互補(bǔ)導(dǎo)致靶基因mRNA被切割或翻譯抑制；在動(dòng)物中，miRNA則通過與靶基因不完全互補(bǔ)抑制靶基因的翻譯，即翻譯起始后抑制蛋白形成。例如果蠅中某些miRNA的結(jié)合位點(diǎn)位于ORF區(qū)和5′UTR區(qū)，miR-2通過cap-dependent的方式抑制靶標(biāo)mRNA翻譯起始，并且在ORF和5′UTR的結(jié)合位點(diǎn)誘導(dǎo)其去腺苷酸化，進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)，影響胚胎發(fā)育過程中的細(xì)胞凋亡(Ronaldetal., 2003; Leamanetal., 2005)。

miRNA和靶基因的關(guān)系并不是一一對(duì)應(yīng)的，而是“多對(duì)多”的關(guān)系，即一個(gè)miRNA可以調(diào)控多個(gè)靶基因的表達(dá)，一個(gè)靶基因也可能受到多個(gè)miRNA的共同調(diào)控(圖1: B)。各種miRNA和靶基因構(gòu)成了一個(gè)龐大的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，而這種機(jī)制的存在也使得miRNA調(diào)控基因表達(dá)的過程十分復(fù)雜(Brodersen and Voinnet, 2009; Shinetal., 2010)。

1.3 miRNA的研究方法

圖1 miRNA生物合成過程(A)及miRNA介導(dǎo)的基因調(diào)控機(jī)制(B)

1.3.1miRNA及其靶標(biāo)基因的鑒定：miRNA的鑒定主要有3種方法：直接克隆法、生物信息學(xué)預(yù)測以及高通量測序法。其中生物信息學(xué)預(yù)測目前應(yīng)用范圍較廣，利用miRNA前體具有典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和miRNA結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)穩(wěn)定性等固有特征，利用相關(guān)軟件對(duì)miRNA進(jìn)行預(yù)測(Mendesetal., 2009)。高通量測序可直接從分子水平對(duì)細(xì)胞或組織中的miRNA進(jìn)行深度測序并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，無需參考基因組序列，由于其具有靈敏度高、測序通量大且成本較低等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各個(gè)物種中(Schreiberetal., 2011)。第二代測序技術(shù)主要包括：Roche/454焦磷酸測序、Illumina/Solexa聚合酶合成測序及ABI/SOLID連接酶測序，由于這3種二代測序技術(shù)的原理各不相同，其數(shù)據(jù)產(chǎn)出量、數(shù)據(jù)質(zhì)量和單次運(yùn)行成本也不同。其中Roche/454測序技術(shù)序列讀長(reads)較長(600～1 000 bp)，但通量較低；Illumina/Solexa測序技術(shù)reads較短(約100 bp)但測序通量大，適合進(jìn)行miRNA測序(RNA-seq)，此外，該測序技術(shù)產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)格式可以應(yīng)用于多種miRNA分析軟件，不僅可以對(duì)sRNA的基因組信息進(jìn)行注釋，還可以進(jìn)行表達(dá)水平分析和靶基因預(yù)測等；而ABI/SOLID讀長最短，只有50 bp，且應(yīng)用了雙堿基編碼，有效降低了測序的錯(cuò)誤率，尤其適用于具有高質(zhì)量參考基因組的物種的重測序(Luoetal., 2012)。

相較于植物miRNA與其靶標(biāo)基因的高度互補(bǔ)，在動(dòng)物中，miRNA與其靶標(biāo)基因常形成不完全互補(bǔ)的功能雙鏈，結(jié)合區(qū)域常會(huì)出現(xiàn)gaps和堿基錯(cuò)配(Brenneckeetal., 2005)，這為動(dòng)物miRNA靶標(biāo)基因的鑒定帶來較大的不確定性。目前常用的miRNA靶標(biāo)基因預(yù)測軟件雖算法不盡相同，但都遵循以下幾個(gè)原則：(1) miRNA與靶位點(diǎn)在種子區(qū)域互補(bǔ)；(2) miRNA靶位點(diǎn)在不同物種間較為保守；(3) miRNA與靶mRNA雙鏈間熱力學(xué)穩(wěn)定性較高且miRNA靶位點(diǎn)處不存在復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)；(4) miRNA 5′端的結(jié)合能力較3′端強(qiáng)。目前幾種常見的靶標(biāo)基因預(yù)測軟件主要包括：miRanda(http:∥www.miranda.org/), RNAhybrid(https:∥bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid/), TargetScan(http:∥www.targetscan.org/vert_72/)和PicTar(https:∥pictar.mdc-berlin.de/)等。miRanda作為最早的miRNA靶標(biāo)基因預(yù)測軟件，主要以序列匹配度、miRNA-mRNA雙鏈熱穩(wěn)定性和靶標(biāo)位點(diǎn)保守性為篩選依據(jù)，允許G=U錯(cuò)配，同時(shí)強(qiáng)調(diào)miRNA第2-4位堿基與靶標(biāo)基因的精確匹配(Quilletetal., 2019)。RNAhybrid是經(jīng)典的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件的擴(kuò)展，通過分析短鏈RNA和長鏈RNA雜交的最小自由能尋找miRNA的最佳靶位點(diǎn)，該算法不考慮靶標(biāo)基因在物種間的保守性(Rehmsmeieretal., 2004)。TargetScan要求miRNA的種子區(qū)域和靶標(biāo)基因ORF或者3′UTR區(qū)完全互補(bǔ)，以此對(duì)miRNA生物靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，預(yù)測假陽性率較低(Agarwaletal., 2015)。PicTar強(qiáng)調(diào)miRNA種子區(qū)域在靶位點(diǎn)識(shí)別以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的關(guān)鍵作用，把種子區(qū)域分為“完全匹配”和“不完全匹配”，并對(duì)兩類種子序列對(duì)應(yīng)的miRNA和靶標(biāo)基因二聚體間的結(jié)合能進(jìn)行限制，有效降低預(yù)測假陽性(Xuetal., 2014)。由于各個(gè)預(yù)測軟件算法不同，預(yù)測結(jié)果也不盡相同，實(shí)驗(yàn)中還需采用多個(gè)軟件分別進(jìn)行預(yù)測后取交集以提高預(yù)測準(zhǔn)確性。

1.3.2miRNA表達(dá)水平檢測：miRNA表達(dá)水平的檢測方法主要有miRNA基因芯片分析、Northern blot分析以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測。其中基因芯片主要應(yīng)用于初步檢測miRNA表達(dá)模式，但其檢測結(jié)果可能存在一定的假陽性，后續(xù)可采用精確度較高的Northern blot以及RT-qPCR等方法進(jìn)一步驗(yàn)證。Northern blot可以檢測miRNA含量以及miRNA分子量大小，但是靈敏度較低(Valoczietal., 2004)。 由于成熟miRNA的長度僅為19～23 nt，必須要在反轉(zhuǎn)錄時(shí)延長miRNA序列才可以進(jìn)行PCR擴(kuò)增，常用的方法有莖環(huán)法和加尾法(表1)。莖環(huán)法使用特異莖環(huán)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，特異莖環(huán)引物包括一段通用莖環(huán)序列和一段與成熟miRNA 3′端反向互補(bǔ)的6～8個(gè)堿基，得到cDNA后用特異上游引物和通用下游引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，引物既可用于PCR也可用于RT-qPCR；加尾法是在miRNA 3′端加一段Poly(A)尾，然后用帶有Poly(T)和一段接頭(adapter)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，隨后用特異性上游引物和試劑盒帶有的通用下游引物進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。

表1 莖環(huán)法與加尾法比較

1.3.3miRNA研究方法：miRNA的研究方法包括對(duì)miRNA進(jìn)行抑制和過表達(dá)。抑制miRNA的表達(dá)有多種方法，在基因水平上包括：(1)利用CRISPR/Cas9等基因編輯工具將miRNA生物合成途徑中起重要作用的Dicer或AGO進(jìn)行敲除，這將導(dǎo)致個(gè)體中所有成熟miRNA的缺失。Kettles等(2013)利用Dicer1和AGO1的缺失突變體擬南芥飼養(yǎng)桃蚜Myzuspersicae，結(jié)果顯示桃蚜在在突變寄主植物上產(chǎn)卵數(shù)較對(duì)照組明顯減少，表明miRNA能夠參與擬南芥與桃蚜的互作，但這無法確定具體是哪個(gè)miRNA參與了調(diào)控作用。(2)對(duì)miRNA調(diào)控位點(diǎn)進(jìn)行突變，從而抑制miRNA與靶基因的結(jié)合。但由于miRNA和靶基因間并非“一對(duì)一”的調(diào)控關(guān)系，敲除單個(gè)miRNA后，其功能很可能從其他途徑得到補(bǔ)償。在非基因水平上抑制miRNA，目前較常用的是體外合成的miRNA抑制劑(inhibitor)或拮抗劑(antagomir)。antagomir是在inhibitor的基礎(chǔ)上，經(jīng)過化學(xué)修飾的人工合成產(chǎn)品。與inhibitor相比，antagomir在動(dòng)物體外穩(wěn)定性較好，作用時(shí)間更長，且在體外細(xì)胞處理實(shí)驗(yàn)中不需要借助細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑。

對(duì)miRNA進(jìn)行過表達(dá)可以進(jìn)一步揭示miRNA功能。在基因水平上，體內(nèi)構(gòu)建GAL4/UAS轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)已成為過表達(dá)miRNA的有效方法，目前已成功應(yīng)用于果蠅(Vargheseetal., 2010; Chen and Rosbash, 2016)和家蠶Bombyxmori(Liuetal., 2018)等昆蟲中。在植物中，過表達(dá)miR-14的轉(zhuǎn)基因水稻Oryzasativa可以對(duì)二化螟Chilosuppressalis產(chǎn)生高抗性(Heetal., 2019)，過表達(dá)Osa-miR162a可以誘導(dǎo)水稻中相關(guān)防御基因表達(dá)，增強(qiáng)對(duì)稻瘟病菌Magnaportheoryzae的抗性(Lietal., 2020)。在非基因水平，注射miRNA類似物(mimic)或激動(dòng)劑(agomir)是較常用的實(shí)驗(yàn)方法，mimic和agomir的作用與成熟miRNA相同，都可以上調(diào)細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)miRNA的含量。隨著miRNA成為生命科學(xué)領(lǐng)域的新熱點(diǎn)，上述方法也成為了研究miRNA的得力工具。

2 昆蟲miRNA的鑒定

目前已有的報(bào)道主要是利用高通量測序技術(shù)以及生物信息學(xué)等新技術(shù)和新手段對(duì)不同昆蟲中的miRNA進(jìn)行鑒定并分析其個(gè)體表達(dá)模式以及在不同應(yīng)激條件下的表達(dá)情況，為研究miRNA的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。到目前為止，在miRbase數(shù)據(jù)庫中已有從家蠶、果蠅和小菜蛾P(guān)lutellaxylostella等26種昆蟲中鑒定的3 508個(gè)miRNA(表2)。

表2 miRbase數(shù)據(jù)庫注冊(cè)的昆蟲miRNAs統(tǒng)計(jì)

2.1 鱗翅目昆蟲中miRNA的鑒定

Ellango等(2014)鑒定了小菜蛾中8個(gè)miRNA成熟體的同時(shí)預(yù)測了其靶標(biāo)mRNA，并對(duì)這些miRNA的前體序列進(jìn)行分析，通過最小自由能索引(MFEI)對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。Etebari和Asgari(2016)重新注釋了小菜蛾基因組，對(duì)其中高豐度miRNA的5p和3p端特征進(jìn)行更正，并注釋了203個(gè)成熟miRNA，鑒定出其中160個(gè)pxy-miRNA的7 691個(gè)高豐度結(jié)合位點(diǎn)，為研究小菜蛾miRNA的功能提供數(shù)據(jù)支持?；谕葱蛄兴阉饕约癗orthern雜交，He等(2008)鑒定出了家蠶中46個(gè)miRNA、另外21個(gè)潛在的miRNA以及1個(gè)新的miRNA，并根據(jù)這些miRNA找到了12對(duì)miRNA-miRNA*雙鏈分子。Liu等(2010)在家蠶中初步鑒定得到了一些昆蟲變態(tài)相關(guān)的miRNA，并驗(yàn)證了其組織特異性表達(dá)模式，為研究家蠶miRNA的功能提供了理論基礎(chǔ)。Fan等(2017)在滯育和經(jīng)HCl處理后的家蠶的卵中共發(fā)現(xiàn)44個(gè)新的miRNA，其中經(jīng)酸處理的卵中有23個(gè)miRNA表達(dá)量上調(diào)，3個(gè)miRNA表達(dá)量下調(diào)，說明經(jīng)酸性物質(zhì)處理后可能會(huì)影響家蠶卵中與生長發(fā)育相關(guān)的一些miRNA的表達(dá)。Zhang等(2015)在甜菜夜蛾Spodopteraexigua中共鑒定出127個(gè)保守的miRNA，其中Sex-miR-10-1a, Sex-miR-9和Sex-miR-4924在昆蟲不同發(fā)育階段差異表達(dá)。Xu等(2015)在亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis的Cry1Ab敏感和抗性品系幼蟲中鑒定并驗(yàn)證了22個(gè)已知的miRNA和1個(gè)新的miRNA表達(dá)量存在顯著差異。此外，Yu等(2018)對(duì)歐洲玉米螟OstrinianubilalisCry1Ab敏感品系和抗性品系幼蟲的中腸miRNA進(jìn)行建庫測序，共得到248個(gè)已知的和29個(gè)新的miRNA，并驗(yàn)證了抗性品系幼蟲中腸15個(gè)差異表達(dá)miRNA的表達(dá)模式。Zhang Z等(2018)鑒定了核桃舉肢蛾Atrijuglanshetaohei幼蟲期和成蟲期的miRNA，共得到132個(gè)已知的和7個(gè)新的miRNA，其中4個(gè)miRNA在成蟲期特異表達(dá)，17個(gè)在幼蟲期特異表達(dá)，RT-qPCR結(jié)果表明miR-8-3p, miR-305-3p和miR-2766均在幼蟲期高表達(dá)。Jeyaraj等(2017)在物理傷口、茶尺蠖Ectropisobliqua啃食造成的傷口以及正常的茶樹葉片中共鑒定出130個(gè)已知的和512個(gè)新的miRNA，其中36個(gè)已知的和139個(gè)新的miRNA在經(jīng)茶尺蠖啃食葉片中特異表達(dá)，RT-qPCR結(jié)果證實(shí)了其中6個(gè)miRNA的表達(dá)模式，同時(shí)他們也發(fā)現(xiàn)這些miRNA的靶基因編碼了包含乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子以及squamosa基因啟動(dòng)子綁定蛋白在內(nèi)的多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，說明miRNA可能通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)參與昆蟲應(yīng)激反應(yīng)。

2.2 其他昆蟲中miRNA的鑒定

Calla和Geib(2015)在橘小實(shí)蠅Bactroceradorsalis中鑒定了已知miRNA的75個(gè)直系同源miRNA和5個(gè)實(shí)蠅科特有的新miRNA，并構(gòu)建了miRNA的基因表達(dá)譜，同時(shí)也預(yù)測了這些miRNA潛在的靶標(biāo)基因，這為在其他雙翅目物種進(jìn)行比較分析以及為新型害蟲防控策略提供潛在靶標(biāo)奠定了基礎(chǔ)。在東方果實(shí)蠅Grapholitamolesta各個(gè)發(fā)育階段的miRNA中，共鑒定出291個(gè)已知的和245個(gè)新的miRNA，發(fā)現(xiàn)同簇的miRNA具有相關(guān)的表達(dá)譜，并對(duì)17個(gè)在節(jié)肢動(dòng)物中保守的miRNA家族進(jìn)行分析，結(jié)果表明這些miRNA家族在昆蟲中十分保守并具有更近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系(Wang Xetal., 2017)。Lyons等(2016)對(duì)膽蠅Eurostasolidaginis幼蟲中與低溫耐受有關(guān)的miRNA進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度范圍在-15～5℃時(shí)，共有24個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中miR-92a在-15℃條件下時(shí)表達(dá)量明顯提高。在嗜人錐蠅Cochliomyiahominivorax和次生錐蠅Cochliomyiamacellaria的成蟲以及3齡幼蟲中共發(fā)現(xiàn)10個(gè)進(jìn)化保守的miRNA和10個(gè)可能的前體miRNA，其中6個(gè)與生殖相關(guān)的miRNA的相對(duì)表達(dá)模式在這兩個(gè)物種中相似，說明miRNA調(diào)控模式在物種間具有一定的保守性(Pauloetal., 2017)。Seong等(2019)在果蠅DDT敏感和抗性品系中鑒定出10個(gè)差異表達(dá)miRNA，且其靶基因多與解毒代謝有關(guān)，這表明miRNA可能通過調(diào)節(jié)其靶基因的表達(dá)進(jìn)而在DDT解毒通路中發(fā)揮一定的作用。對(duì)喂食血液、糖類和被瘧原蟲感染后的嗜人按蚊Anophelesanthropophagus中腸miRNA進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)與喂食糖類的按蚊相比，喂食血液的嗜人按蚊中腸中有9個(gè)miRNA的表達(dá)量顯著上調(diào)，10個(gè)miRNA顯著下調(diào)，而感染瘧原蟲使按蚊中腸中13個(gè)miRNA表達(dá)量增加，11個(gè)miRNA表達(dá)量下降(Liuetal., 2017)。Chang等(2016)在白背飛虱Sogatellafurcifera中共鑒定得到382個(gè)miRNA，其中有106個(gè)已知的miRNA和276個(gè)新的miRNA，并且半數(shù)以上的保守miRNA家族在六足類中也是高度保守的。Ylla等(2017)對(duì)德國小蠊Blattellagermanica胚胎形成的不同階段差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行測序，并將其與黑果蠅、黑腹果蠅以及赤擬谷盜T.castaneum的進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)了之前未研究過的一些胚胎細(xì)胞miRNA，例如miR-309家族和54個(gè)新的miRNA，這些miRNA可參與調(diào)控不同時(shí)期的胚胎發(fā)育過程。Wang YK等(2017)對(duì)雌性和雄性榕小蜂Ceratosolensolmsi不同齡期的miRNA進(jìn)行鑒定后發(fā)現(xiàn)一些miRNA的表達(dá)具有很高的性別和發(fā)育階段特異性。在暗黑鰓金龜Holotrichiaparallela中鑒定得到了共76個(gè)已知的miRNA和23個(gè)組織特異表達(dá)的新miRNA，對(duì)其靶基因進(jìn)行預(yù)測和功能分析后，發(fā)現(xiàn)其中有13個(gè)miRNA可能與昆蟲嗅覺有關(guān)(Wang Setal., 2017)。分別對(duì)6, 9和12日齡的意大利蜜蜂Apismelliferaligustica咽下腺總miRNA進(jìn)行分析，共得到54個(gè)在日齡間差異表達(dá)的miRNA，其靶基因被注釋到生理節(jié)律信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路、嘌呤代謝通路等，GO聚類主要集中在有機(jī)物質(zhì)運(yùn)輸、離子跨膜運(yùn)輸和系統(tǒng)發(fā)育等，暗示這些差異表達(dá)miRNA可能與咽下腺發(fā)育有關(guān)(張衛(wèi)星, 2020)。在耐寒和正常稻水象蟲Lissorhoptrusoryzophilus中鑒定得到共121個(gè)已知的和14個(gè)新的miRNA，其中36個(gè)miRNA在耐寒種群與正常種群之間差異表達(dá)(Yangetal., 2017)。Jung等(2017)根據(jù)東亞飛蝗Locustamigratoria的棲息地、性別和發(fā)育階段將其分為12組進(jìn)行miRNA測序分析，共鑒定出175個(gè)miRNA簇，GO功能分析表明某些miRNA可以在多種生理過程中調(diào)節(jié)靶標(biāo)mRNA的表達(dá)，從而影響多酚類的分泌。Liu M等(2019)對(duì)蘭州熊蜂Bombuslantschouensis的雄蜂、工蜂和蜂后腦中的miRNA進(jìn)行測序，共鑒定得到了364個(gè)已知的和89個(gè)新的miRNA，并對(duì)差異miRNA進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證和靶基因分析，為進(jìn)一步研究miRNA在蜜蜂腦中的功能提供了基礎(chǔ)。

3 miRNA在昆蟲中的功能

3.1 miRNA與昆蟲生長發(fā)育

昆蟲的生長發(fā)育受蛻皮激素和保幼激素的協(xié)同作用，miRNA通過調(diào)節(jié)蛻皮激素級(jí)聯(lián)基因的表達(dá)影響昆蟲發(fā)育及變態(tài)過程。家蠶中miR-281特異作用于蛻皮激素受體(EcR)的一個(gè)亞型基因BmEcR-B的3′UTR區(qū)，通過抑制BmEcR-B的轉(zhuǎn)錄水平，延緩家蠶發(fā)育過程(Jiangetal., 2013)。miR-2家族作為無脊椎動(dòng)物特有的家族，同時(shí)也在家蠶翅發(fā)育中扮演重要角色，miR-2轉(zhuǎn)基因個(gè)體在成蟲期出現(xiàn)翅畸形的現(xiàn)象，并可以顯著抑制靶基因Bmawd和Bmfng的表達(dá)(凌琳, 2017)。利用GAL4/UAS系統(tǒng)和CRISP/Cas9技術(shù)構(gòu)建的家蠶miR-14轉(zhuǎn)基因過表達(dá)品系和敲除品系表明，當(dāng)miR-14過表達(dá)時(shí)，家蠶產(chǎn)生滯育現(xiàn)象、蟲體重量降低且蛻皮激素滴度降低；miR-14敲除品系的家蠶則發(fā)生早熟行為，miR-14通過調(diào)控蛻皮激素信號(hào)通路上的核心因子ECR-B和E75影響家蠶生長發(fā)育及代謝(Liuetal., 2018)。滯育和經(jīng)HCl處理后的家蠶的卵中差異表達(dá)miRNA的靶基因，多與細(xì)胞新陳代謝、蛋白質(zhì)產(chǎn)生和運(yùn)輸過程有關(guān)，其中Bmo-miR-2761-3p通過負(fù)向調(diào)控靶基因BmSDH的表達(dá)影響家蠶卵的發(fā)育，進(jìn)而影響其生長發(fā)育(Fanetal., 2017)。Liu ZL等(2019)利用CRISPR/Cas9技術(shù)將物種特異的miR-2738敲除后，其性別決定相關(guān)靶基因BmPSI和BmMasc轉(zhuǎn)錄水平有所上升，這表明miR-2738可能是性別決定基因的一個(gè)調(diào)控因子，通過負(fù)向調(diào)控其靶標(biāo)基因在家蠶性別決定過程中發(fā)揮作用。

miR-14作為無脊椎動(dòng)物中的一個(gè)保守miRNA，在果蠅中已被證明可以抑制細(xì)胞凋亡驅(qū)動(dòng)基因rapper,grim,hid及dronc的表達(dá)水平，延緩細(xì)胞凋亡過程(Xuetal., 2003)。miR-14在果蠅成蟲腦中通過調(diào)控一個(gè)鋅指蛋白基因sugarbabe，控制果蠅發(fā)育及代謝(Vargheseetal., 2010)。對(duì)miR-305分別進(jìn)行過表達(dá)和抑制表達(dá)后，果蠅壽命明顯縮短和延長，過表達(dá)時(shí)會(huì)顯著抑制其編碼AMP的靶基因以及類胰島素肽基因dilp6的mRNA表達(dá)水平，表明miR-305不僅與果蠅壽命長短有關(guān)，還可能在果蠅老化中起作用，其異位表達(dá)很可能會(huì)加速果蠅的衰老(Uedaetal., 2018)。miR-252在果蠅蛹期和成蟲期一般呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，在幼蟲脂肪體中過表達(dá)會(huì)使果蠅各組織重量下降，蛹期到成蟲期的發(fā)育歷期延長，將其敲除則使果蠅組織重量上升；同時(shí)過表達(dá)miR-252和靶基因mbt則會(huì)使果蠅的發(fā)育缺陷得到恢復(fù)，這表明miR-252可能通過調(diào)控mbt的表達(dá)參與果蠅的生長發(fā)育過程(Limetal., 2019)。東方果實(shí)蠅各個(gè)發(fā)育階段的miRNA進(jìn)行從頭測序、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析和靶基因預(yù)測表明，由miRNA、時(shí)鐘基因和發(fā)育調(diào)控相關(guān)基因組成的復(fù)合物在調(diào)控東方果實(shí)蠅的生理發(fā)育節(jié)律中起著重要作用(Wang Xetal., 2017)。

埃及伊蚊作為蟲媒病毒的重要傳播載體，研究其生殖調(diào)控機(jī)制對(duì)制定蟲媒控制策略、限制蟲媒疾病的傳播有重要意義。Bryant等(2010)發(fā)現(xiàn)，miR-275在血液消化、流體排泄和卵的發(fā)育中均發(fā)揮重要作用。miR-1174在埃及伊蚊腸道中特異表達(dá)，并靶向絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶基因(SHMT)以控制腸道內(nèi)的血液攝入和消化，進(jìn)而影響卵發(fā)育，miR-1174的缺失會(huì)導(dǎo)致糖吸收和血液攝入的嚴(yán)重缺陷(Liuetal., 2014)。miR-8通過調(diào)節(jié)雌蚊脂肪體內(nèi)Wingless-interactingmolecule(Swim)的表達(dá)影響遠(yuǎn)程Wingless(Wg)信號(hào)的傳導(dǎo)，miR-8/Wg對(duì)于脂肪體適當(dāng)分泌脂激蛋白、卵黃生成素以及卵黃蛋白前體發(fā)育成卵母細(xì)胞后的積累至關(guān)重要(Lucasetal., 2015)。研究表明miR-309在卵巢發(fā)育啟動(dòng)過程中充當(dāng)調(diào)節(jié)開關(guān)的角色，吸食血液能夠刺激其表達(dá)；同時(shí)miR-309也參與介導(dǎo)SIX4周期性降解，使卵巢發(fā)育從卵黃發(fā)生前階段過渡到卵黃發(fā)生后階段，將其敲除會(huì)影響初級(jí)卵泡形成，導(dǎo)致卵巢發(fā)育受損，影響卵發(fā)育成熟(Zhangetal., 2016)。在埃及伊蚊中，miR-277也可以通過微調(diào)insulin-likepeptide7(ILP7)和ILP8的表達(dá)來調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，從而控制促性腺營養(yǎng)周期中卵巢發(fā)育啟動(dòng)所需能量的轉(zhuǎn)移，將miR-277或靶基因ILP7/ILP8敲除后，均可導(dǎo)致昆蟲的脂質(zhì)代謝和卵巢發(fā)育缺陷(Lingetal., 2017)。

發(fā)育同步性是群居動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境的重要策略之一，是群居動(dòng)物群體形成、遷移和性成熟的基礎(chǔ)。對(duì)群居型蝗蟲和寡居型蝗蟲的卵孵化時(shí)間進(jìn)行的研究表明，群居型蝗蟲個(gè)體的性成熟同步性明顯優(yōu)于寡居型蝗蟲，其中miR-276在群居型蝗蟲個(gè)體的卵巢和卵中的表達(dá)量均顯著高于寡居型蝗蟲，miR-276通過正向調(diào)控轉(zhuǎn)錄共激活因子Brahma(Brm)的表達(dá)使昆蟲后代同步孵化，對(duì)其進(jìn)行干擾會(huì)導(dǎo)致昆蟲性成熟同步性的紊亂(Heetal., 2016)。在東亞飛蝗中miR-2/13/71簇(miR-2, miR-13a, miR-13b和miR-71)通過抑制靶基因Notch的表達(dá)，從而降低卵黃原蛋白(Vg)mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，抑制卵母細(xì)胞成熟，影響東亞飛蝗的卵巢發(fā)育和生殖(Songetal., 2019)。

miRNA也與昆蟲幾丁質(zhì)的合成過程有關(guān)。Yang等(2016)發(fā)現(xiàn)miRNA也與昆蟲幾丁質(zhì)的合成過程有關(guān)，miR-71和miR-263通過調(diào)控其靶基因chitinsynthase1(CHS1)和chitinase10(CHT10)的表達(dá)影響蝗蟲蛻皮，注射miR-71和miR-276 agomir可顯著降低CHS1和CHT10的表達(dá)，影響新老角質(zhì)層幾丁質(zhì)的產(chǎn)生，導(dǎo)致蝗蟲的蛻皮缺陷。Chen等(2018)的研究表明在褐飛虱Nilaparvatalugens中，nlu-miR-173通過與轉(zhuǎn)錄因子NlFtz-F1結(jié)合參與20E信號(hào)通路，且Broad Complex (Br-C)可以提升nlu-miR-173的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而在昆蟲蛻皮過程中發(fā)揮作用。miR-2703通過靶向chitinsynthase1a(CHS1a)響應(yīng)20E信號(hào)通路以調(diào)節(jié)幾丁質(zhì)合成，飼喂或注射miR-2703 mimic會(huì)導(dǎo)致昆蟲幾丁質(zhì)合成降低、死亡率增加并出現(xiàn)蛻皮缺陷表型(Chenetal., 2020)。在長期適應(yīng)自然環(huán)境的過程中，褐飛虱進(jìn)化出長翅(LW)和短翅(SW)兩種翅型，其中胰島素受體(lnR)和保幼激素(JH)在調(diào)節(jié)翅多型性中起著重要作用，但是這些調(diào)節(jié)因子之間的相互作用尚未明確。Ye等(2019)發(fā)現(xiàn)，miR-34在短翅褐飛虱中高表達(dá)，通過抑制NllnR1的轉(zhuǎn)錄水平影響昆蟲的翅多型性現(xiàn)象，在長翅褐飛虱中過表達(dá)miR-34可促使其向短翅轉(zhuǎn)變，在短翅褐飛虱中敲除miR-34則會(huì)導(dǎo)致其向長翅轉(zhuǎn)變。該研究團(tuán)隊(duì)還在nlu-miR-34的啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)了Br-C的順式響應(yīng)元件，這表明20E可能參與了翅多型性現(xiàn)象的調(diào)控；此外，JH通過上調(diào)miR-34的表達(dá)水平誘導(dǎo)更多短翅褐飛虱的產(chǎn)生，敲除胰島素/IGF信號(hào)(IIS)通路上的某些基因也會(huì)使JH滴度和miR-34的豐度提高，這表明miR-34是JH， 20E和IIS通路間的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子，使其三者形成一個(gè)正反饋回路，協(xié)同調(diào)控昆蟲翅多型性(Yeetal., 2019)。

Zhang Z等(2018)鑒定了核桃舉肢蛾各個(gè)發(fā)育階段的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-1a-3p, miR-133, let-7, miR-2766, miR-184和miR-34可能與昆蟲背腹軸形成、激素合成以及生理節(jié)律等生長發(fā)育過程有關(guān)。在昆蟲翅形態(tài)發(fā)生、組織死亡及神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)形成相關(guān)的miRNA中發(fā)現(xiàn)miR-2可以控制Kr-h1的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而影響德國小蠊在半變態(tài)過程中的形態(tài)發(fā)育，這也是單個(gè)miRNA作為重要的調(diào)節(jié)因子影響昆蟲整個(gè)生理過程的典型例子(Belles, 2017)。Ylla等(2017)參考了德國小蠊的miRNA文庫，發(fā)現(xiàn)在不完全變態(tài)個(gè)體中，一些miRNA在蛹期和成蟲期會(huì)有多種表達(dá)模式，表明某些miRNA可以參與昆蟲發(fā)育過程，促進(jìn)發(fā)育期的轉(zhuǎn)變，甚至可能影響胚芽帶類型和變態(tài)模式。赤擬谷盜中miR-8-3p與昆蟲的生長發(fā)育和變態(tài)過程密切相關(guān)，在幼蟲晚期抑制其表達(dá)會(huì)導(dǎo)致翅、眼、足及胚胎的發(fā)育缺陷，且靶基因Wingless,Eyg,Fpps和Sema-1a均與機(jī)體發(fā)育相關(guān)，其中Eyp和Wingless作為關(guān)鍵調(diào)控基因參與Notch和Wingless信號(hào)通路，并影響昆蟲變態(tài)(Wu Wetal., 2019)。棉鈴蟲Helicoverpaarmigera的miRNA生物合成途徑中的關(guān)鍵基因Pasha,Drosha,Exportin-5,Dicer-1及Argonaute-1在不同組織和不同齡期中表達(dá)量均有差異，沉默Dicer-1可導(dǎo)致let-7和miR-184表達(dá)量上升，并會(huì)抑制miRNA生物合成途徑的發(fā)生，導(dǎo)致幼蟲死亡、蛹期延長和成蟲翅發(fā)育畸形(Rahimpouretal., 2019)。在斜紋夜蛾Spodopteralitura中，miR-14-3p通過靶向兩個(gè)蛻皮激素級(jí)聯(lián)基因EcR和E75來調(diào)節(jié)昆蟲蛻皮激素信號(hào)通路。此外，EcR,E75和Kr-h1等蛻皮激素級(jí)聯(lián)基因不同轉(zhuǎn)錄本間的3′UTR區(qū)基本相似，表明一個(gè)miRNA也可能調(diào)控一個(gè)蛻皮激素級(jí)聯(lián)基因的多個(gè)轉(zhuǎn)錄本(Luoetal., 2020)。橘小實(shí)蠅的miR-1-3p在雌性性別決定基因Bdtra上存在靶位點(diǎn)，通過抑制其表達(dá)影響橘小實(shí)蠅的性別分化，注射miR-1-3p mimic會(huì)導(dǎo)致87%～92%的雄性表型，注射inhibitor則會(huì)導(dǎo)致67%～77%的雌性表型，敲除miR-1-3p后會(huì)導(dǎo)致Bdtra和Bddsx的雌性特異剪接轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)，并且誘導(dǎo)XY個(gè)體的性別逆轉(zhuǎn)為雌性(Pengetal., 2020)(表3)。

表3 昆蟲生長發(fā)育相關(guān)miRNAs及其靶基因

續(xù)表3 Table 3 continued

3.2 miRNA與昆蟲行為

在東亞飛蝗兩型轉(zhuǎn)變的行為中，miR-133靶向多巴胺合成通路的兩個(gè)關(guān)鍵基因henna和pale，下調(diào)其表達(dá)會(huì)抑制多巴胺合成，促使飛蝗由群居型轉(zhuǎn)變?yōu)楣丫有?Yangetal., 2014)。D1-like dopamine receptor(Dop1)通過阻止La蛋白和pre-miR-9a結(jié)合，抑制成熟miR-9a產(chǎn)生，上調(diào)其靶基因AC2的表達(dá)水平，進(jìn)而誘導(dǎo)東亞飛蝗對(duì)群居性揮發(fā)物的嗅覺偏好(Guoetal., 2018)。Sadd等(2015)通過對(duì)歐洲熊峰Bombusterrestris和美洲東部熊蜂Bombusimpatiens進(jìn)行研究，并將其與蜜蜂以及其他膜翅目昆蟲進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其miRNA的差異表達(dá)很可能與調(diào)控社會(huì)行為或其他行為特征的基因有關(guān)。跳舞作為西方蜜蜂Apismellifera特有的傳輸方向和距離的交流方式，其中也不乏miRNA參與。對(duì)處于不同覓食階段工蜂的研究表明，ame-miR-278和ame-miR-282在跳舞階段的表達(dá)量低于覓食階段，其靶基因均與激酶、神經(jīng)功能以及突觸結(jié)合蛋白等相關(guān)，覓食和舞蹈階段的miRNA差異很可能與蜜蜂的跳舞行為有關(guān)(Lietal., 2012)。果蠅的miR-276a通過抑制重要的時(shí)鐘基因timeless(tim)的表達(dá)調(diào)控其行為節(jié)律，敲除tim中miR-276a的結(jié)合位點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致tim表達(dá)量上升，致使果蠅心律失常(Chen and Rosbash, 2016)。miR-210通過抑制Fasciclin2(Fas2)來決定果蠅的夜間行為，miR-210缺失會(huì)導(dǎo)致果蠅提前2 h出現(xiàn)夜晚的某些行為，敲除Fas2上miR-210的靶位點(diǎn)也會(huì)導(dǎo)致果蠅夜間行為的提前(Niuetal., 2019)。一些miRNA還可能與昆蟲的求偶行為有關(guān)，研究表明黑腹果蠅的求偶行為有時(shí)會(huì)根據(jù)求偶對(duì)象釋放的信號(hào)而改變，這一適應(yīng)性的行為被廣泛認(rèn)為是miRNA和其他因子共同作用的結(jié)果。miR-957突變體果蠅呈現(xiàn)顯著上升的雄-雄求偶行為和雄性群體中互相求偶的鏈?zhǔn)叫袨?，這表明單個(gè)miRNA也可能調(diào)控多種復(fù)雜行為(Iftikharetal., 2019)。在感染W(wǎng)olbachia的果蠅中，dme-miR-92b通過負(fù)向調(diào)節(jié)其靶基因crebA的表達(dá)影響果蠅的神經(jīng)發(fā)育和學(xué)習(xí)記憶能力(Bietal., 2019)。盡管miRNA對(duì)神經(jīng)元可塑性的調(diào)節(jié)作用被認(rèn)為是真核生物中的一種保守機(jī)制，但僅有少量研究表明，miRNA也可以在昆蟲學(xué)習(xí)與記憶方面發(fā)揮作用(Rajasethupathyetal., 2009; Linetal., 2011)。Cristino等(2014)發(fā)現(xiàn)，在蜜蜂中與神經(jīng)蛋白相關(guān)的miR-932可通過調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白基因Act5C的表達(dá)對(duì)蜜蜂的長期記憶產(chǎn)生影響，該miRNA的缺失導(dǎo)致蜜蜂長期記憶的損傷，但并不會(huì)影響其記憶的獲取(表4)。

表4 昆蟲行為相關(guān)miRNAs及其靶基因

3.3 miRNA與昆蟲抗病毒機(jī)制

目前，miRNA與抗病毒機(jī)制的相關(guān)研究主要集在果蠅和家蠶這兩種模式生物中。病毒主要通過調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)和逃避宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別等方法達(dá)到持續(xù)感染宿主細(xì)胞的目的(Stern-Ginossaretal., 2007; Xiaetal., 2008)。在與宿主長期的互作過程中，病毒也進(jìn)化出多種策略逃避宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別，其中利用miRNA對(duì)宿主進(jìn)行干擾有助于病毒的快速傳播(Tangetal., 2019)。對(duì)病毒感染下的miRNA表達(dá)模式進(jìn)行分析已成為尋找宿主昆蟲-病毒互作相關(guān)miRNA的主要方法。

3.3.1病毒編碼的miRNA與宿主昆蟲-病毒互作：病毒可以通過編碼miRNA調(diào)節(jié)宿主基因表達(dá)，從而參與宿主昆蟲與病毒互作的生物過程。病毒編碼的miRNA具有長度短、非抗原性以及靶點(diǎn)特異性等優(yōu)勢，這使其成為病毒對(duì)抗寄主防御機(jī)制的潛在武器。第一個(gè)鑒定得到的昆蟲病毒miRNA是由棉鈴蟲囊泡病毒(Heliothisvirescensascovirus, HvAV)編碼的HvAV-miR-1，其表達(dá)可以引起病毒DNA聚合酶Ⅰ的降解，從而抑制病毒復(fù)制(Hussainetal., 2008)。家蠶核型多角體病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus, BmNPV)是一種天然病原體，侵染后能有效調(diào)控宿主基因表達(dá)并在體內(nèi)產(chǎn)生大量的病毒后代，染病家蠶死亡率極高，對(duì)桑蠶業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。為探究BmNPV與宿主防御系統(tǒng)的互作機(jī)制，Singh等(2010)預(yù)測了部分病毒編碼的miRNA以及其64個(gè)潛在靶點(diǎn)，揭示了miRNA可以通過調(diào)控部分病毒復(fù)制基因和寄主免疫防御通路關(guān)鍵基因的表達(dá)，從而在促進(jìn)病毒侵染宿主昆蟲的過程中發(fā)揮作用。此外，一些病毒miRNA也可能通過抑制宿主miRNA合成途徑中的重要蛋白合成對(duì)昆蟲抗病毒能力產(chǎn)生影響，例如BmNPV可通過編碼一種miRNA(BmNPV-miR-1)，下調(diào)寄主GTP結(jié)合核蛋白R(shí)an的表達(dá)，使Ran與Exportin-5的結(jié)合效率降低，抑制了miRNA前體從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的遷移，從而增加感病家蠶中BmNPV的拷貝數(shù)(Singhetal., 2012)。該研究團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)在BmNPV病毒感染早期，BmNPV-miR-3可以通過負(fù)調(diào)控病毒P6.9和其他晚期基因的表達(dá)來逃避宿主的免疫防御，促進(jìn)BmNPV對(duì)宿主的感染(Singhetal., 2014)。除BmNPV外，家蠶細(xì)胞質(zhì)多角體病毒(Bombyxmoricytoplasmic polyhedrosis virus, BmCPV)也是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)蠶業(yè)的重要病原體。Guo等(2020)研究表明，BmCPV-miR-1通過上調(diào)凋亡蛋白抑制基因BmIAP的表達(dá)抑制感病家蠶的細(xì)胞凋亡，為病毒的復(fù)制提供更好的細(xì)胞環(huán)境。

3.3.2昆蟲編碼的miRNA與宿主昆蟲-病毒互作：有些昆蟲編碼的miRNA在受到病毒感染后會(huì)發(fā)生表達(dá)譜變化，這種變化揭示了昆蟲miRNA在宿主-病毒互作中的潛在作用。Monsanto-Hearne等(2017)通過對(duì)比感染了果蠅C型病毒(DrosophilaC virus, DCV)和未染病果蠅的miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)二者之間miR-956-3p的豐度存在顯著差異，該miRNA通過在DCV感染期間誘導(dǎo)其靶基因Ectoderm-expressed4(Ect4)的表達(dá)，降低病毒聚集率，延緩果蠅死亡，啟動(dòng)染病果蠅體內(nèi)的宿主保護(hù)機(jī)制和抗病毒機(jī)制。Wu P等(2019)發(fā)現(xiàn)在感染BmNPV的家蠶中，bmo-miR-2819的表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)該miRNA后其靶標(biāo)基因BmNPVIE-1的豐度相應(yīng)降低并抑制了病毒的復(fù)制，這表明宿主miRNA可以通過調(diào)控病毒基因的表達(dá)抵御病毒的侵染。

某些病毒也可以利用宿主細(xì)胞miRNA加速自身復(fù)制過程，促使宿主昆蟲染病。Wu等(2016)研究表明，在感染BmCPV的家蠶幼蟲中，過表達(dá)miR-278-3p可以顯著降低其靶基因Insulin-relatedpeptidebindingprotein2(IPB2)的表達(dá)，同時(shí)顯著提高BmCPV的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，加速其復(fù)制。此外在染病幼蟲中，miR-273-3p也能夠通過負(fù)向調(diào)控病毒Nonstructuralprotein5(NS5)基因的表達(dá)，增加BmCPV的拷貝數(shù)，加速家蠶染病過程(Wuetal., 2017)。Campbell等(2014)構(gòu)建了經(jīng)登革熱2型病毒(DENV-2)處理2, 4和9 d后的埃及伊蚊Aedesaegypti深度測序文庫，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過9 d的處理后，起顯著調(diào)節(jié)作用的miRNA數(shù)量由5個(gè)上升為23個(gè)，對(duì)這些miRNA的靶標(biāo)基因進(jìn)行預(yù)測后，發(fā)現(xiàn)其均與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、染色質(zhì)修復(fù)和線粒體功能等病毒復(fù)制傳染過程有關(guān)。蜜蜂作為重要的昆蟲傳粉者，感染病毒后其授粉效率顯著降低，感染緩慢性蜜蜂麻痹病病毒(slow bee paralysis virus, SBPV)和以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus, IAPV)的歐洲熊蜂Bombusterrestris的miRNA合成通路基因以及表達(dá)模式分析顯示，在SBPV侵染后Dicer-1和Ago-1的表達(dá)量有所提高，且有17個(gè)miRNA在SBPV感染群體特異表達(dá)，12個(gè)miRNA在IAPV感染群體中特異表達(dá)，對(duì)這些miRNA的靶基因進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)寄主昆蟲miRNA可能會(huì)靶定調(diào)控病毒基因組RNA(Niuetal., 2017)。在埃及伊蚊中，感染沃爾巴克氏菌Wolbachia可顯著誘導(dǎo)aae-miR-2940和其靶基因metalloprotease(MetP)的表達(dá)，沉默aae-miR-2490和MetP則會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)外Wolbachia密度降低，宿主miRNA可通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)環(huán)境以促進(jìn)Wolbachia內(nèi)共生，與病原菌進(jìn)行互作(Hussainetal., 2011)。Dubey等(2019)發(fā)現(xiàn)，miR-2944b-5p通過與基孔肯雅病毒(Chikungunya virus, CHIKV)的3′UTR結(jié)合影響病毒復(fù)制，注射antagomir抑制miRNA會(huì)導(dǎo)致病毒復(fù)制加快，此外，在病毒復(fù)制過程中，miR-2944b-5p靶向vps-13以維持埃及伊蚊線粒體膜電位。Su等(2019)對(duì)喂食DENV-2污染血液后染病和未染病埃及伊蚊的miRNA分析發(fā)現(xiàn)17個(gè)顯著差異表達(dá)的miRNA, miR-1767和miR-276-3p會(huì)加速病毒復(fù)制，miR-4448則會(huì)減緩病毒復(fù)制(表5)。

表5 與昆蟲-病毒互作相關(guān)的miRNAs及其靶基因

3.4 miRNA與昆蟲免疫機(jī)制

昆蟲作為無脊椎動(dòng)物沒有適應(yīng)性免疫，當(dāng)被外源病原體入侵時(shí)，主要通過Toll途徑和免疫缺陷(IMD)途徑激活體內(nèi)的細(xì)胞免疫和體液免疫，細(xì)胞免疫主要包括淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬、包被和結(jié)節(jié)作用，體液免疫是通過昆蟲脂肪體產(chǎn)生體液反應(yīng)分子，如抗菌肽(antimicrobial peptide, AMP)以及一些抗病毒因子和黑色素等來實(shí)現(xiàn)的(Lemaitre and Hoffmann, 2007)。其中，AMP的產(chǎn)生、黑化以及細(xì)胞吞噬作用是最重要的防御機(jī)制。由于miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，其在昆蟲免疫機(jī)制中也可能發(fā)揮著重要作用。在球孢白僵菌Beauveriabassiana侵染后的斯氏按蚊Anophelesstephensi的研究中發(fā)現(xiàn)，在侵染早期，bba-milR-1可以顯著下調(diào)宿主Spz4的表達(dá)，進(jìn)而抑制Toll介導(dǎo)的蚊蟲免疫；但在侵染晚期，真菌菌絲進(jìn)入昆蟲血腔后，bba-milR-1和靶基因CLIPB9的表達(dá)均顯著降低以避免酚氧化酶原(PPO)轉(zhuǎn)化為酚氧化酶(PO)，進(jìn)而避免蚊蟲黑化反應(yīng)的激活(Cuietal., 2019)。在岡比亞按蚊Anophelesgambiae中，aga-miR-305可以通過免疫效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄后修飾對(duì)抗瘧原蟲的中腸微生物群進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而影響昆蟲的免疫機(jī)制(Dennisonetal., 2015)。通過對(duì)種系缺陷的秀麗隱桿線蟲的壽命和免疫機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，一些miRNA的調(diào)節(jié)因子與昆蟲的壽命延長有關(guān)(Sinha and Rae, 2014)。miR-8是一個(gè)昆蟲中高度保守的miRNA，在調(diào)節(jié)昆蟲發(fā)育、內(nèi)分泌以及先天免疫內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起著重要作用(Karresetal., 2007; Kennelletal., 2008, 2012; Jinetal., 2012)。對(duì)果蠅Toll, IMD和JNK免疫通路上一些保守miRNA分析發(fā)現(xiàn)，miR-8可能通過靶標(biāo)Toll通路上的GNBP3和JNK通路上調(diào)節(jié)因子Pvf來調(diào)控AMP的表達(dá)，進(jìn)而在果蠅先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用(Fullaondo and Lee, 2012)。在小菜蛾中，miR-8可以正向調(diào)控絲氨酸蛋白酶抑制劑基因Serpin27的轉(zhuǎn)錄水平，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中Toll途徑的激活；并且在感染了寄生蟲的彎尾姬蜂Diadegmasemiclausum體內(nèi)，miR-8的下調(diào)會(huì)導(dǎo)致Serpin27的表達(dá)量顯著降低，進(jìn)而導(dǎo)致Toll途徑的激活和AMP的大量產(chǎn)生，同時(shí)也促進(jìn)PO活性的增強(qiáng)以及黑化反應(yīng)的激活(Etebari and Asgari, 2013)。Xiong等(2016)發(fā)現(xiàn)，miR-34通過抑制其靶基因Dlg1和Eip75B的表達(dá)調(diào)節(jié)果蠅先天免疫并參與蛻皮激素信號(hào)通路，是二者復(fù)雜的相互作用中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，過表達(dá)miR-34可以激活天然抗菌免疫信號(hào)，使感染革蘭氏陰性菌的果蠅存活率和病原菌清除率均有所提高。Wei等(2018)在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)感染了滕黃微球菌Micrococcusluteus的果蠅雄成蟲進(jìn)行miRNA和mRNA表達(dá)模式分析，發(fā)現(xiàn)感染后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，miRNA和mRNA的表達(dá)量均有差異，說明一些差異表達(dá)的基因在Toll等信號(hào)通路中起著重要作用，miRNA可能在不同的信號(hào)通路中協(xié)同調(diào)節(jié)基因表達(dá)，促進(jìn)或抑制昆蟲先天免疫反應(yīng)以及維持昆蟲自穩(wěn)態(tài)。果蠅中miR-317可直接靶向Dif基因的一個(gè)轉(zhuǎn)錄本Dif-Rc以下調(diào)Drc的表達(dá)水平，且miR-317僅作用于Dif-Rc，而不作用于Dif-Ra/b/d，表明miR-317可以調(diào)節(jié)一個(gè)可變剪接基因的不同亞型從而負(fù)向調(diào)控果蠅的免疫應(yīng)答；此外，過表達(dá)miR-317會(huì)提高果蠅革蘭氏陽性菌感染死亡率，敲除miR-317則會(huì)降低其死亡率，因此miR-317不僅可以影響果蠅的先天免疫功能，還可以通過干擾免疫系統(tǒng)影響果蠅生存(Li Retal., 2019)。Xu等(2017)建立了感染玫煙色棒束孢Isariafumosorosea的小菜蛾miRNA文庫，并驗(yàn)證了其中23個(gè)差異表達(dá)miRNA的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)miR-2, miR-9a, miR-745和miR-7b均在小菜蛾抵御病原菌的過程中發(fā)揮作用(表6)。

3.5 miRNA與昆蟲抗藥性

傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上對(duì)化學(xué)農(nóng)藥的過度依賴導(dǎo)致了害蟲抗藥性的產(chǎn)生，解決重大農(nóng)業(yè)害蟲的抗藥性問題已成為了目前害蟲防治工作的重中之重。由于miRNA在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中扮演著重要的角色，其通過調(diào)節(jié)昆蟲解毒基因表達(dá)來增強(qiáng)自身抗藥性的分子機(jī)制也引起了廣大害蟲防控工作者的興趣(表7)。Li等(2015)的研究首次表明，小菜蛾可利用miR-7a和miR-8519上調(diào)魚尼丁受體(ryanodine receptor, RyR)的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)對(duì)氯蟲苯甲酰胺的抗性。這證實(shí)了miRNA可以通過調(diào)控宿主靶基因的表達(dá)從而參與其對(duì)殺蟲劑的解毒過程。經(jīng)氯蟲苯甲酰胺處理后，小菜蛾幼蟲體內(nèi)miR-2b-3p和miR-14-5p的豐度顯著降低，其靶基因CYP9F2和CYP307a1在轉(zhuǎn)錄水平上過表達(dá)，并通過飼喂幼蟲miR-2b-3p mimic，發(fā)現(xiàn)溴氰菊酯抗性品系幼蟲死亡率明顯提高，表明miR-2b-3p可以負(fù)向調(diào)節(jié)CYP9F2的表達(dá)，并有效抑制幼蟲解毒代謝通路(Etebarietal., 2018)。隨后Li S等(2019)構(gòu)建了暴露在Bt下不同時(shí)長的小菜蛾miRNA文庫并進(jìn)行了差異miRNA表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)miR-2的表達(dá)量在殺蟲劑暴露后有所上調(diào)，且miR-2b-3p可負(fù)向調(diào)控trypsin的表達(dá)，這表明miR-2b-3p可能在小菜蛾對(duì)蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensis(Bt)的防御機(jī)制中發(fā)揮作用。Zhu等(2019)的研究表明，miR-998-3p通過負(fù)向調(diào)控ABCC2的表達(dá)，參與棉鈴蟲H.armigera、甜菜夜蛾和小菜蛾這3種典型的鱗翅目害蟲對(duì)BtCry1Ac毒素的解毒過程。Zhang Y等(2018)發(fā)現(xiàn)在朱砂葉螨Tetranychuscinnabarinus中，屬于miR-1家族的tci-miR-1-3p在抗性品系幼蟲中的表達(dá)量很低，在tci-miR-1-3p過表達(dá)時(shí)，該miRNA的一個(gè)預(yù)測靶基因TCGSTM的表達(dá)量明顯降低，利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了兩者之間存在明顯的相互作用，這表明tci-miR-1-3p通過調(diào)節(jié)TCGSTM的表達(dá)，進(jìn)而在螨類對(duì)丁氟螨酯的抗性中發(fā)揮重要作用。Morin等(2017)驗(yàn)證了經(jīng)吡蟲啉處理和未經(jīng)處理的馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata中的miRNA的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)miR-282, miR-989和miR-100在昆蟲對(duì)吡蟲啉的解毒中發(fā)揮重要作用，并揭示了響應(yīng)吡蟲啉刺激的馬鈴薯甲蟲miRNA的特征。對(duì)西方蜜蜂的噻蟲嗪抗性品系和敏感品系中的miRNA鑒定發(fā)現(xiàn)，有7個(gè)miRNA在兩個(gè)品系中差異表達(dá)，其靶基因多與昆蟲行為、免疫功能、神經(jīng)功能以及對(duì)殺蟲劑的解毒作用等相關(guān)(Shietal., 2017)。Lei等(2014)發(fā)現(xiàn)，miR-278-3p通過負(fù)向調(diào)控其靶標(biāo)基因CYP6AG11的表達(dá)改變淡色庫蚊C.pipienspallens對(duì)擬除蟲菊酯的敏感性。此外，Guo等(2017)首次對(duì)淡色庫蚊中的miRNA簇進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)miR-2～13～71可通過調(diào)節(jié)其靶基因CYP9J35和CYP325BG3的表達(dá)參與昆蟲對(duì)擬除蟲菊酯的解毒過程。同樣在淡色庫蚊中，miR-932通過負(fù)向調(diào)控其靶基因CpCPR5的表達(dá)改變其對(duì)溴氰菊酯的敏感性(Liuetal., 2016)。Ma等(2017)發(fā)現(xiàn)miR-92a在溴氰菊酯抗性品系中相對(duì)于敏感品系過表達(dá)，進(jìn)一步通過注射抑制劑將miR-92a抑制后可導(dǎo)致其靶基因cpCPR4表達(dá)量增加，同時(shí)抗性品系對(duì)溴氰菊酯的易感性也有所提高。該研究團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)miR-13664在敏感品系中的豐度顯著高于抗性品系，過表達(dá)或抑制其表達(dá)會(huì)顯著影響淡色庫蚊對(duì)溴氰菊酯的敏感性，下調(diào)其靶基因cpCYP314A1的表達(dá)會(huì)降低淡色庫蚊對(duì)溴氰菊酯的抗性(Sunetal., 2019)。上述淡色庫蚊耐藥機(jī)制相關(guān)研究均為防治蚊蟲抗藥性提供了新的科學(xué)依據(jù)。Seong等(2019)的研究表明，DDT處理會(huì)顯著下調(diào)果蠅Canton-S敏感品系中miR-310-3p, miR-311-3p, miR-312-3p, miR-313-3p和miR-92a-3p的表達(dá)，這與其細(xì)胞色素P450相關(guān)靶基因的表達(dá)模式相反，表明這些miRNA可能通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控P450靶基因的表達(dá)從而參與對(duì)DDT的解毒代謝過程。

表6 昆蟲免疫相關(guān)miRNAs及其靶基因

表7 昆蟲抗藥性相關(guān)miRNAs及其靶基因

4 小結(jié)與展望

自20世紀(jì)90年代首次報(bào)道以來，miRNA日漸成為生命科學(xué)領(lǐng)域研究的新熱點(diǎn)。隨著生物信息學(xué)、生物化學(xué)與分子生物學(xué)和遺傳學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域的研究不斷深化以及測序技術(shù)的飛速發(fā)展，研究人員已完成了多個(gè)物種的miRNA的鑒定和功能驗(yàn)證。此外，以生物信息學(xué)為基礎(chǔ)的各種預(yù)測軟件的面世和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的發(fā)展，揭示了miRNA和其靶基因之間潛在的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及miRNA在調(diào)節(jié)各種生物學(xué)過程中的功能可塑性，擴(kuò)展了人們對(duì)基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控進(jìn)程的理解。值得注意的是，miRNA與其靶基因之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能還存在其他重要的調(diào)節(jié)因子，例如一些轉(zhuǎn)錄因子可與啟動(dòng)子結(jié)合激活或抑制基因表達(dá)。在一些情況下，miRNA的缺失或突變不會(huì)引起生物體表型的顯著變化，但轉(zhuǎn)錄因子的突變則可以造成顯著的表型變化。多種生物的全基因組遺傳分析也表明轉(zhuǎn)錄因子在生物體發(fā)育和自穩(wěn)態(tài)等過程中發(fā)揮決定性作用，而miRNA則是通過微調(diào)靶基因的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)生物體的形態(tài)、生理及行為產(chǎn)生影響，此時(shí)轉(zhuǎn)錄因子可作為調(diào)控共同靶基因的“主因子”，miRNA則起輔助作用，二者協(xié)同參與基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(Martinez and Walhout, 2009)。因此，今后在研究miRNA的功能時(shí)可能也需要考慮到其他因子對(duì)靶標(biāo)基因的調(diào)控作用。

昆蟲作為和人類生產(chǎn)生活聯(lián)系較緊密的物種，其miRNA的鑒定及其生物學(xué)功能的研究也越來越受到重視。大量研究表明，miRNA可以通過調(diào)節(jié)靶標(biāo)基因的表達(dá)，參與多種生物學(xué)進(jìn)程，如昆蟲生長發(fā)育、行為、昆蟲-病毒互作、昆蟲免疫和昆蟲抗藥性。其中，大量的miRNA已被證明在昆蟲蛻皮、變態(tài)、卵子發(fā)生、胚胎發(fā)育、翅發(fā)育和性別分化等方面均發(fā)揮著重要的作用，并與昆蟲行為變化有著千絲萬縷的聯(lián)系。在昆蟲-病毒互作關(guān)系中，病毒編碼的miRNA一方面可以提高病毒復(fù)制相關(guān)基因的表達(dá)，加速病毒侵染，另一方面也可以抑制宿主免疫相關(guān)基因的表達(dá)，從而使病毒能夠順利侵染宿主昆蟲。為抵御病毒侵染，昆蟲宿主miRNA可以通過多層次的調(diào)控機(jī)制調(diào)節(jié)自身免疫相關(guān)基因，進(jìn)而激活昆蟲免疫應(yīng)答或抑制病毒復(fù)制。為適應(yīng)殺蟲劑這一重要的環(huán)境應(yīng)激因子，昆蟲miRNA一般通過靶向過表達(dá)或抑制殺蟲劑靶標(biāo)基因或解毒酶基因的表達(dá)來形成或增強(qiáng)殺蟲劑抗性。開展對(duì)昆蟲miRNA的功能研究，有利于提高我們對(duì)昆蟲基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的深入理解，同時(shí)利用特定miRNA調(diào)控昆蟲抗藥性和免疫防御通路上的重要靶基因，也為害蟲生態(tài)防控策略的制定提供了新思路。

此外，miRNA還可用于轉(zhuǎn)基因植物中，抑制害蟲的關(guān)鍵靶標(biāo)基因，阻礙害蟲發(fā)育，或通過干擾害蟲消化系統(tǒng)以阻止它的取食行為，避免造成更大的危害。也可以通過改造家蠶和蜜蜂等經(jīng)濟(jì)昆蟲致命病原體的載體，使其產(chǎn)生抗病毒或抗寄生蟲的miRNA，抑制病毒復(fù)制和寄生蟲繁殖，預(yù)防家蠶和蜜蜂等經(jīng)濟(jì)昆蟲的疾病。

雖然昆蟲miRNA的功能研究已經(jīng)取得了較大進(jìn)展，但依舊存在一些不足之處，如在非模式昆蟲中，對(duì)于CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因敲除和基于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基因敲入相關(guān)研究與應(yīng)用相對(duì)較少，使得目前對(duì)大量新發(fā)現(xiàn)的miRNA的功能驗(yàn)證存在一定難度。

對(duì)于某些在脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物中系統(tǒng)發(fā)育高度保守的miRNA和一些在生長發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞分化、神經(jīng)發(fā)生、凋亡和肌肉發(fā)育調(diào)控途徑這些保守通路上的miRNA來說，一些模式昆蟲可作為理想的研究材料，對(duì)這些昆蟲中的保守miRNA的研究也有利于深入了解癌癥和心臟病等疾病的分子機(jī)制。