不同年限白術(shù)的不同部位葉片光合特性探究

劉文東，曹國璠，李金玲，趙 致，王禮科，汪佳維，張猛

（1.貴州大學(xué)，貴州 貴陽 550025；2.貴州省藥用植物繁育與種植重點(diǎn)（工程）實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025）

2020 版《中華人民共和國藥典》中收錄的白術(shù)為菊科植物白術(shù)（Atraactylodes macrocephala kiodz.）的干燥根莖[1]。白術(shù)有效成分主要為揮發(fā)油、多糖、內(nèi)酯類和其他成分，多用于抗腫瘤、抗炎、胃腸調(diào)節(jié)功能和抗抑郁等[2,3]。白術(shù)主要分布在我國安徽、浙江、湖南和江西等省份[4]。作為大宗藥材之一的白術(shù)，需求量較大，具有很大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

光合作用是植物生長發(fā)育的基礎(chǔ)，作為地球上最大的C 固定生物化學(xué)物理過程，也受到很多因素的影響，除受自身葉綠素含量、葉片厚度和葉片成熟程度影響外，更受光照強(qiáng)度、氣溫、空氣濕度和土壤等因子左右[5,6]。探究弱光條件下的表觀量子效率可以描述光合機(jī)構(gòu)功能運(yùn)轉(zhuǎn)狀態(tài)是否正常，測(cè)定光合作用飽和點(diǎn)范圍可了解植物在飽和光下的光合能力[7]。CO2 作為光合作用的一種基本原料，也是影響光合速率的重要因子，測(cè)定光合作用的CO2 響應(yīng)曲線更是探究植物光合作用的基礎(chǔ)。由于不同植物甚至不同部位有不同的光適應(yīng)特性，研究植物對(duì)光的響應(yīng)有助于探究其光合作用產(chǎn)物積累與環(huán)境的關(guān)系[8]。當(dāng)前研究多集中于白術(shù)連作和脅迫條件下的光合作用探究，但鮮有人探究常規(guī)種植下白術(shù)光合作用特性[9-11]。本文通過人工控制溫度、CO2 濃度和光照強(qiáng)度等條件測(cè)定不同年限白術(shù)不同部位葉綠素含量、光響應(yīng)參數(shù)和CO2 響應(yīng)參數(shù)，應(yīng)用直角雙曲線模型擬合曲線，進(jìn)一步分析白術(shù)不同部位光合作用效率和光合作用能力，闡明白術(shù)不同部位葉片光合作用差異，為提高白術(shù)藥材產(chǎn)量闡明生理機(jī)理，也為探究白術(shù)光合作用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況及材料來源

試驗(yàn)種植白術(shù)的種子和白術(shù)種術(shù)栽（1 年生白術(shù)地下塊莖）選購于安徽省亳州市銳航中藥材種苗銷售公司。種栽與種子分別于2019 年12 月30 日和2020年4 月1 日種植于貴州省貴陽市花溪區(qū)貴州大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)基地（東經(jīng)106°67'～106°67'，北緯26°11'～26°40'），該地平均海拔1 095 m，年平均氣溫14.9 ℃，無霜期246 d，年降雨量1 178.3 mm。白術(shù)生長期間統(tǒng)一采用中藥材生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行田間管理。

對(duì)1 年生、2 年生白術(shù)的上部、中部和下部功能葉片（部位選擇見圖1）進(jìn)行光合作用測(cè)定，選擇長勢(shì)較為一致的5 株進(jìn)行重復(fù)測(cè)定，每個(gè)部位都選擇健康且完全展開葉進(jìn)行測(cè)定。

圖1 白術(shù)不同部位葉片的劃分Fig.1 Blade division of different parts of Atiactylodes

1.2 數(shù)據(jù)測(cè)定

采用便攜式光合儀（LI-6400XT，LI-COR Inc，USA）在2020 年7 月20 日至7 月26 日的9：00～11：00 對(duì)白術(shù)進(jìn)行光響應(yīng)曲線和CO2 響應(yīng)曲線的測(cè)定。測(cè)量光響應(yīng)曲線時(shí)，控制葉室溫度為25℃、流速500mol s-1、CO2采用CO2 Mixer注入系統(tǒng)（濃度控制400mol mol-1）、PAR 強(qiáng)度梯度設(shè)置為1 500、1 200、1 000、800、600、400、200、100、50 和0mol m-2s-1。測(cè)定CO2 響應(yīng)曲線時(shí)，葉室溫度控制為25℃、流速為500mol s-1、PAR為1 000mol m-2s-1、CO2 采用CO2 Mixer 注入系統(tǒng)且濃度梯度控制為400、300、200、100、50、400、600、800、1 000、1 200 和1 500mol mol-1，葉片適應(yīng)時(shí)間為3～5 min，設(shè)定好參數(shù)后由LI-6400XT 內(nèi)置自動(dòng)測(cè)量程序完成光響應(yīng)曲線和CO2 響應(yīng)曲線。

使用便攜式光合儀于2020 年7 月20 日至7 月26 日9：00～11：00 對(duì)不同年限白術(shù)上部、中部和下部進(jìn)行凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Cond）、胞間二氧化碳濃度（Ci）和葉片蒸騰速率（Tr）測(cè)定。測(cè)量時(shí)，控制葉室溫度為25 ℃、流速500mol s-1、CO2 采用CO2 Mixer 注入系統(tǒng)（濃度控制400mol mol-1）、PAR 強(qiáng)度為1 000mol m2s-1。

將上部、中部和下部對(duì)應(yīng)測(cè)定葉片帶回貴州省藥用植物繁育與種植（工程）實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a/b、類胡蘿卜素和葉綠素總量的測(cè)定。稱取0.1 g 不同部位白術(shù)葉片（無葉脈），剪成小塊，用3mL 95%乙醇研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至10 mL離心管（95%乙醇洗滌用量2 mL），暗處理靜置提取12 h，3 000 r/min離心10 min，定容至10 mL，上機(jī)測(cè)定470、649、665 nm3 個(gè)波長處的最大吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用光合作用對(duì)光響應(yīng)的直角雙曲線模型[12]擬合光響應(yīng)曲線，得出最大凈光合速率（maximal photosynthetic rate,Pn-max）、初始量子效率（initial quantum efficiency,）、飽和光強(qiáng)（saturation light intensity,Isat）、光補(bǔ)償點(diǎn)（light compensation point, Ic）和暗呼吸速率（dark respiration rate, Rd）等參數(shù)。CO2 對(duì)光響應(yīng)的直角雙曲線模型[13]擬合CO2 響應(yīng)曲線，得出植株光合能力（photosynthetic capacity, Pmax）、羧化速率（carboxylation efficiency,EC）、飽和CO2 濃度（saturation CO2 concentration，Cisat）、光呼吸速率（photorespiration, Rp）和CO2 補(bǔ)償點(diǎn)（CO2 compensation point）等參數(shù)。利用SPSS 26.0 進(jìn)行模型擬合和參數(shù)之間的差異對(duì)比，采用LSD 法進(jìn)行多重比較。利用Excel 2010 和Power Point2010 進(jìn)行相關(guān)圖表繪制。

2 結(jié)果

2.1 白術(shù)不同部位葉綠素含量差異

白術(shù)不同部位葉綠素含量差異，見表1。

表1 白術(shù)葉片葉綠素含量差異Table 1 The content of chlorophyll in leaves of Atiactylodes

表1 數(shù)據(jù)顯示，白術(shù)不同部位葉片葉綠素含量差異較小。1 年生白術(shù)不同部位葉片葉綠素a 含量和葉綠素總量存在差異，表現(xiàn)為中上部葉片中的葉綠素a和葉綠素總量顯著高于（P ＜0.05）下部葉片，而葉綠素b、類胡蘿卜素和葉綠素a/b 值各個(gè)部位葉片之間的含量沒有顯著差異；2 年生白術(shù)不同部位葉片葉綠素a、葉綠素b 和葉綠素總量的值不存在顯著差異，而類胡蘿卜素含量在不同部位之間差異較大，表現(xiàn)為上部＞中部＞下部；1 年生與2 年生對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，除類胡蘿卜素外，2 年生白術(shù)的其他葉綠素相關(guān)指標(biāo)都遠(yuǎn)大于1 年生。

2.2 白術(shù)不同部位葉片凈光合速率差異

白術(shù)不同部位葉片凈光合速率差異，見表2.

表2 白術(shù)葉片Pn、Ci、Cond 和Tr 的差異Table 2 Differences of Pn,Ci,Cond and Trmmol in leaves of Atiactylodes

2.3 白術(shù)不同部位葉片光合參數(shù)的差異

圖2 1 年生、2 年生白術(shù)不同部位葉片光合作用對(duì)光的響應(yīng)曲線擬合。a：1 年生上部葉片，b：1 年生中部葉片，c：1 年生下部葉片；d：2 年生上部葉片，e：2 年生中部葉片，f：2 年生下部葉片F(xiàn)ig.2 Light response curve fitting of photosynthesis in different parts of annual and biennial atractyloides.a:upper leaves of anaual,b:middle leaves of annual,c:lower leaves of annual；d:Upper leaves of biennial,e:middle leaves of biennial,f:lower leaves of biennial

圖3 1 年生、2 年生白術(shù)不同部位葉片光合作用對(duì)CO2 的響應(yīng)曲線擬合。A：1 年生上部，B：1 年生中部，C：1 年生下部；D：2 年生上部，E：2 年生中部，F(xiàn)：2 年生下部Flg.3 Light response curve fitting of photosynthesis in different parts of annual and biennial atractyloids.A:Upper leaves of annual,B:middle leaves of annual,C:lower leaves of annual；D:Upper leaves of biennial,E:middle leaves of biennial,F:lower leaves of biennial

從圖2 和圖3 曲線擬合情況可知，直角雙曲線模型可以很好地?cái)M合白術(shù)光合作用對(duì)光的響應(yīng)曲線和CO2 對(duì)光的響應(yīng)曲線。1 年生白術(shù)的擬合曲線擬合度為R2a=0.996，R2b=0.993，R2c=0.998，R2d=0.998，R2e=0.999，R2f=0.998；2 年生白術(shù)的為R2A=0.990，R2B=0.987，R2C=0.985，R2D=0.993，R2E=0.987，R2F=0.987。從圖中可知不管是擬合值還是測(cè)量值，Pn都隨著光強(qiáng)和CO2濃度的增加而增大，當(dāng)光強(qiáng)達(dá)到1 000mol m-2s-1和CO2 濃度為800mol mol-1之后增加幅度變小且逐漸下降。曲線無法精確擬合凈光合速率隨著光強(qiáng)或飽和二氧化碳濃度增加至飽和之后的點(diǎn)。

表3 白術(shù)葉片光響應(yīng)參數(shù)差異Table 3 Differences in light response parameters of Atractylodes leaves

由于直角雙曲線無法直接擬合出植物的最大凈光合速率和飽和光強(qiáng)，需要通過再次線性擬合光強(qiáng)小于等于200mol m-2s-1時(shí)的線性方程（a 為≤200mol m-2s-1擬合直線斜率）算出。通過兩次擬合后得出表3 數(shù)據(jù)，分析可知1 年生白術(shù)不同部位葉片各光響應(yīng)參數(shù)存在差異。表現(xiàn)為各部位光補(bǔ)償點(diǎn)（Ic）沒有顯著差異，但下部葉片卻略高于中上部，2 年生白術(shù)與1 年生的一致，說明下部葉片衰老且對(duì)光利用能力下降；葉片的Pn-max為上部＞中部＞下部，分別為21.27、16.8 和11.39mo（l CO2）m-2s-1；各個(gè)部位葉片的暗呼吸速率（Rd）和表觀量子效率（）并沒有太大差異，說明1 年生白術(shù)對(duì)低光強(qiáng)的利用率，各個(gè)部位的葉片并沒有顯著差異；而上部葉片的光飽和點(diǎn)（Isat）顯著高于中下部，為680.89mol m-2s-1。2 年生白術(shù)葉片的Ic、Rd 和Isat 之間沒有顯著差異；而Pn-max 卻表現(xiàn)為上部＞中部＞下部，最大值為21.57mol（CO2）m-2s-1。

表4 白術(shù)葉片CO2 響應(yīng)參數(shù)差異Table 4 Differences of CO2 response parameters in Atractylodes leaves

采用同樣的方法對(duì)白術(shù)葉片CO2 對(duì)光的響應(yīng)曲線進(jìn)行擬合，進(jìn)行兩次擬合后計(jì)算得到表4 參數(shù)（線性方程為Pmax=K*Cisat-Rp，K為CO2 濃度≤200mol mol-1時(shí)擬合直線斜率）。分析參數(shù)可知不同年限白術(shù)不同部位葉片CO2 擬合參數(shù)值存在差異。1 年生白術(shù)的CO2補(bǔ)償點(diǎn)各部位葉片不存在顯著差異，但隨葉位下降而升高；上部葉片的光合作用能力（Pmax）遠(yuǎn)高于中下部葉片，為67.71mol(CO2) m-2s-1，上部相對(duì)于下部高出49.60%；而羧化速率（EC）、光呼吸速率（Rp）和CO2飽和點(diǎn)濃度（Cisat）在不同部位葉片之間沒有顯著差異，說明旺盛生長期的白術(shù)中上部葉片是其光合作用的主要部位，下部逐漸衰退。同樣2 年生白術(shù)不同部位葉片的EC 和Rp 也沒有顯著差異，CO2 補(bǔ)償點(diǎn)和1 年生趨勢(shì)不同，但相同部位較1 年生補(bǔ)償點(diǎn)濃度高；而Pmax 和Cisat 卻隨著葉位的下降而降低，最為顯著的是Pmax，分別為上部[72.02mo（l CO2）m-2s-1]＞中部[45.00mol (CO2) m-2s-1]＞下部[28.75mol（CO2）m-2s-1]；上部葉片Cisat 顯著高于中下部葉片，為1 157.02mol mol-1，說明2 年生白術(shù)上部葉片的活力更強(qiáng)，進(jìn)行光合作用和對(duì)CO2 的固定能力也更強(qiáng)，其原因是出蕾后期的白術(shù)花蕾具有更強(qiáng)的庫強(qiáng)。

3 討論

植物生理生長和生殖生長以及光合作用產(chǎn)物積累與分配都深受光合作用的影響。由于不同植物甚至不同葉位具有不一致的光合作用特性，因此探究植物光合作用一直是植物生理生態(tài)學(xué)的研究熱點(diǎn)。但是植物光合作用不僅受到自身因素的影響，更受到外界環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致了光合反應(yīng)的復(fù)雜性[14-17]，探究光合作用對(duì)光和CO2 的響應(yīng)一直是了解植物光合作用特性的基礎(chǔ)手段之一。為了了解白術(shù)光合作用特性，本文對(duì)不同年限白術(shù)的不同部位的葉片進(jìn)行了光合作用相關(guān)生理指標(biāo)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)白術(shù)上部葉片具有更高的葉綠素含量，這與陳良秋等[18]人的研究相似，因?yàn)橥粫r(shí)期不同葉位的葉片發(fā)育程度不一致，下部和中部葉片較上部具有更高的成熟度，成熟度越高導(dǎo)致葉綠素合成代謝緩慢[19]，所以在葉片葉綠素含量上呈現(xiàn)出上部＞中部＞下部的趨勢(shì)。

通過控制光強(qiáng)、溫度和CO2 濃度等參數(shù)測(cè)定不同年限白術(shù)不同部的位葉片光合速率發(fā)現(xiàn)，中上部葉片的Pn、Cond、Ci、Tr 與葉綠素含量都顯著高于下部，這與切花菊和馬鈴薯不同葉位光合參數(shù)有相似之處，但不同于黃瓜[20-22]，這是由于植物凈光合速率受葉位高低的影響，不同葉位的葉片葉綠素含量、葉綠體超微結(jié)構(gòu)、基粒數(shù)目和片層等隨葉位的上升而增加，光合強(qiáng)度也高于其他葉片[23]。采用直角雙曲線模型擬合發(fā)現(xiàn)，白術(shù)葉片光飽和點(diǎn)在680mol m-2s-1左右且隨葉位下降，二氧化碳飽和點(diǎn)在1 200mol mol-1左右且隨葉位下降。葉位不同導(dǎo)致葉片成熟度和衰老速度等不一致，相應(yīng)的葉綠素含量隨葉位下降而降低，光合作用能力也隨之下降；葉片衰老導(dǎo)致葉片氣孔導(dǎo)度、葉片含水量和二氧化碳擴(kuò)散速率等參數(shù)下降，所以白術(shù)下部葉片光合作用能力下降主要由氣孔因素引起的[24-26]。

此外通過對(duì)擬合后的參數(shù)分析，得到不同年限白術(shù)不同部位葉片的光補(bǔ)償點(diǎn)、表觀量子效率、飽和光強(qiáng)、羧化速率補(bǔ)償點(diǎn)和飽和點(diǎn)等指標(biāo)，由于白術(shù)發(fā)育階段和葉位不同等原因?qū)е虏町惒灰恢拢尸F(xiàn)上部＞中部＞下部趨勢(shì)，這是因?yàn)橹猩喜咳~片屬于白術(shù)的功能葉片，能夠進(jìn)行正常的光合作用；雖然中部葉片可能開始衰老，但不明顯；而下部葉片已經(jīng)開始衰老，導(dǎo)致其各光合參數(shù)較低，且葉片衰老進(jìn)一步導(dǎo)致氣孔導(dǎo)度下降，葉片含水量減少，CO2 擴(kuò)散阻力增大[27-29]。另外從擬合參數(shù)可以看出，補(bǔ)償點(diǎn)偏高而飽和點(diǎn)偏低，這是由于該模型無法擬合Pn 隨光強(qiáng)或CO2 濃度增加而逐漸下降的階段，導(dǎo)致出現(xiàn)擬合飽和點(diǎn)較實(shí)際飽和點(diǎn)偏低，擬合補(bǔ)償點(diǎn)較實(shí)際補(bǔ)償點(diǎn)偏高，而且默認(rèn)光強(qiáng)或CO2 濃度≤200mol mol-1時(shí)Pn 呈線性增加，相關(guān)學(xué)者已經(jīng)證明[30]，所以本文在進(jìn)行凈光合測(cè)定時(shí)選擇飽和光強(qiáng)為1 000mol m-2s-1。

綜上所述，光合作用是白術(shù)生長發(fā)育的基礎(chǔ)，但白術(shù)不同葉位葉片的光合作用大小存在差異。在探究白術(shù)光合作用生理時(shí)發(fā)現(xiàn)白術(shù)中上部葉片光合作用更強(qiáng)，是白術(shù)干物質(zhì)生產(chǎn)的主要部位。