耐低溫對硝基苯酚降解菌的降解動力學研究

李超凡，溫玉娟，曹楠，孫東，宋曉明，楊悅鎖，2

（1 沈陽大學區(qū)域污染環(huán)境生態(tài)修復教育部重點實驗室，遼寧沈陽110044； 2 吉林大學新能源與環(huán)境學院，吉林長春130021； 3 四川省環(huán)境保護地下水污染防治工程技術中心，四川成都610000）

引 言

對硝基苯酚（PNP）常用于燃料、殺蟲劑、塑化劑以及農(nóng)藥等化工行業(yè)的產(chǎn)品制備過程[1]，因其在環(huán)境中物-化性質(zhì)較穩(wěn)定、溶解度較高（16 g·L-1，辛醇水分配系數(shù)為lgKow=1.91）、遷移能力強且半衰期較長，因此能夠在水生生物體內(nèi)傳遞和富集[2]，并長期積累殘留在土壤和水體中，對動物和人體的皮膚、血液、眼睛、腎臟、肝臟等產(chǎn)生更加深遠的危害。美國環(huán)保署將對硝基苯酚規(guī)定為環(huán)境優(yōu)先控制污染物之一，且在飲用水中的質(zhì)量濃度限值要低于10 ng·L-1[3]。

水環(huán)境中對硝基苯酚污染的處理方法可分為物理吸附法[4-6]（吸附樹脂、生物炭、活性炭等）、化學催化還原法[7-8]及微生物降解法。對硝基苯酚的酚羥基對位為硝基，對稱的苯環(huán)結(jié)構(gòu)使得該物質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，加之硝基的存在使得電子被吸附至其周圍，進而導致該物質(zhì)更加難以微生物降解。目前，分離篩選的對硝基苯酚降解菌主要有Pseudomonas[9-12]、Rhodococcus[13-15]、Arthrobacter[16-17]、Methylobacterium[18]、Rhodobacter[19]等。Lei等[10]從對硝基苯酚污染的垃圾場中分離得到Pseudomonas putida JS444 降解菌株，對其進行基因編輯，利用冰晶核蛋白質(zhì)(INP)將有機磷水解酶定位到Pseudomonas putida JS444 上，使其可同時降解對硝基苯酚和有機磷農(nóng)藥，具有一定的土壤農(nóng)藥污染修復的應用潛力。Zhang 等[13]從制備農(nóng)藥的工業(yè)廢水產(chǎn)生的底泥中分離出菌株Rhodococcus sp. CN6，在30℃條件下，12 h 內(nèi)能夠完全降解100 mg·L-1的對硝基苯酚，62 h 可完全降解300 mg·L-1的對硝基苯酚。Subashchandrabose 等[14]從含硝基苯酚和三氯乙烯污染的地下水中分離到Rhodococcus wratislaviensis strain 9，在23℃、pH 為7.5條件下，14 h 內(nèi)有效地修復了含有900 μmol·L-1對硝基苯酚的實驗室廢水（廢水中總氮、總有機碳、總磷酸鹽濃度分別為2.32、4.5、0.12 mg·L-1），證實了其在對硝基苯酚污染水體生物修復方面的巨大潛力。Labana 等[16]分 離 得 到Arthrobacter protophormiae RKJ100，在pH 為7.5、20～40℃范圍內(nèi)能夠降解1.4 ～210 mg·L-1的對硝基苯酚，在對硝基苯酚污染的原位生物修復中具有一定的應用潛力。Zohar 等[17]從農(nóng)業(yè)土壤中分離到菌株Arthrobacter sp.4Hβ，在24 h內(nèi)對400 mg·L-1和800 mg·L-1對硝基苯酚的降解率分別為100%和17%，且對高濃度對硝基苯酚具有較強的耐受性。目前，對硝基酚降解菌株的分離篩選工作主要為20～40℃之間，而耐低溫對硝基酚降解菌的相關研究較少。

眾所周知，溫度為調(diào)控微生物降解過程的重要因素，對細胞蛋白的表達及酶和微生物的活性影響顯著[20]。研究表明在7～35℃之間，微生物生物量和降解能力與環(huán)境溫度呈負相關[21]。地下水常年溫度為13℃左右，微生物活性往往受到抑制且降解能力降低，使得在地下水污染修復過程中，低溫降解菌的降解作用權重較高。低溫降解菌可以分為嗜冷菌和耐冷菌[22]，嗜冷菌（psychorphile）是嗜冷細菌或古菌，其生存溫度須在20℃以下，最適溫度為-15～20℃[23]；在0℃以 下 可 生 長 繁 殖。 耐 冷 菌（psychrotrophs）是一種耐寒細菌或古菌，它們能在5℃下生長，但最佳生長溫度在20～25℃之間[24]。耐低溫降解菌具有較寬的溫度耐受性且在低溫條件下依舊保持較高活性和降解特性。目前，針對耐低溫對硝基酚降解菌的相關研究較少。Zhang 等[25]研究了低溫條件下土壤含水層的生物強化修復技術，實驗結(jié)果表明HEPD-bacterium 能夠在15℃條件下降解對硝基苯酚，其最高耐受濃度為200 mg·L-1，強化修復實驗結(jié)果表明，該菌株能夠有效地提高寒冷地區(qū)的土壤含水層處理技術的處理效率。

由于對硝基苯酚具有一定的細胞毒性，對菌株生長產(chǎn)生抑制作用，為深入了解菌株的降解特性，探討污染物濃度與降解菌作用的相關關系，多數(shù)研究由降解動力學向抑制降解動力學方向延伸[26-29]。Sahoo 等[26]研 究 了Arthrobacter chlorophenolicus A6 在30℃條件下對硝基苯酚的降解動力學模型，結(jié)果表明其降解過程符合Webb 動力學模型，比生長速率（μ）為0.161 h-1，半飽和系數(shù)（KS）為0.15 mg·L-1，底物抑制系數(shù)（Ki）為128 mg·L-1，模型擬合參數(shù)（K）為100 mg·L-1，說明該降解菌株降解的抑制濃度為128 mg·L-1。截止目前，尚未發(fā)現(xiàn)針對低溫條件下對硝基苯酚降解動力學研究。因此，分離篩選耐低溫對硝基苯酚降解菌株并研究其降解動力學特征對研發(fā)原位高效低耗的地下水污染修復技術具有顯著的科學意義與實際意義。

綜上，本研究分離篩選了一株對硝基苯酚低溫高效降解菌Pseudomonas sp. ZL，利用單因素實驗、細胞疏水性實驗、細胞膜通透性等實驗研究，結(jié)合低溫降解動力學模型的擬合，對該菌株的低溫降解特性進行綜合表征。該研究成果有望解決菌株在低溫環(huán)境（土壤及地下水）下對硝基苯酚去除效率較低這一問題，同時為地下水與土壤中對硝基苯酚污染修復提供一株新型耐低溫菌株。進一步通過降解動力學模型的研究為菌株在實際污染修復工程及其優(yōu)化運行等方面提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 實驗材料與方法

1.1 主要材料

實驗菌株（保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，CGMCC No：17078）。對硝基苯酚（PNP），分析純，上海麥克林試劑公司。氯化鈉，分析純，天津市恒興化學試劑制造有限公司。氯化鉀，分析純，天津市瑞金特化學品有限公司。磷酸氫二鈉、七水合硫酸鎂，分析純，天津市化學試劑廠。磷酸二氫鉀，分析純，西隴化工股份有限公司。蛋白胨、瓊脂粉、牛肉膏，生物試劑，solarbio 公司。乙腈，99.97%，賽默飛世爾（中國）有限公司。

1.2 培養(yǎng)基及緩沖溶液配制方法

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏0.5 g，蛋白胨1 g，NaCl 0.5 g，瓊脂2.5 g，超純水100 ml。無機鹽液體 培 養(yǎng) 基：Na2HPO43.8 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，KCl 3.0 g，超純水1000 ml。LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨1 g，NaCl 1 g，酵母粉0.5 g，超純水100 ml，pH 調(diào)至7。乳糖誘導培養(yǎng)基：KH2PO40.3 g，Na2HPO4·7H2O 1.28 g，乳 糖0.5 g，NaCl 0.05 g，NH4Cl 0.1 g，MgSO40.05 g，CaCl20.001 g，乳糖0.5 g，超純水100 ml。β-半乳糖緩沖液：KH2PO40.024 g，Na2HPO4·12H2O 0.29 g，NaCl 0.8 g，KCl 0.02 g，MgSO4·7H2O 0.025 g，β-巰基乙醇0.39 ml，超純水100 ml。磷酸鹽緩沖液：KH2PO47.26 g，K2HPO422.2 g，超純水1000 ml，pH調(diào)至7。

1.3 對硝基苯酚分析及OD600測試方法

對硝基苯酚的檢測采用高效液相色譜法，利用賽默飛檢測系統(tǒng)，C18 柱（4.6 mm×150 mm,5 μm），柱溫為30℃，流動相為乙腈和水（乙腈∶水=70∶30），流速為1.0 ml·min-1，進樣量為10 μl，317.1 nm 為最大吸收波長，采集時間為14 min，該方法在0.96～79.22 mg·L-1的線性范圍良好，樣品加標回收率為60.0%～93.0%。OD600采用紫外-可見分光光度計法，于波長為600 nm 測試其吸光度，以滅菌的無機鹽培養(yǎng)基為空白，以OD600表示細菌生物量。

1.4 對硝基苯酚對Pseudomonas sp. ZL 疏水性及細胞膜通透性影響

1.4.1 細胞膜通透性 將菌懸液調(diào)節(jié)OD600值至0.700，按照1%(體積)的比例接種到100 ml 的LB 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h 后離心收集全部菌體，重懸于滅菌后0.9%的氯化鈉溶液中，接入到100 ml的乳糖誘導培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將乳糖誘導培養(yǎng)基中的菌株在8700 r·min-1的條件下，高速離心20 min收集菌體，無菌水洗滌3 次后重懸于β-半乳糖緩沖液中，取1 ml 分別接入到對硝基苯酚濃度為0～300.44 mg·L-1的100 ml 無機鹽培養(yǎng)基中，每個濃度設置4個平行樣品。為了考察低溫和常溫下污染物對細胞的通透性影響，分別將樣品置于10℃和30℃進行培養(yǎng)，120 r·min-1，待底物全部降解后，加入5 mg 鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷，培養(yǎng)1 h，用紫外-可見分光光度計測試OD504值（波長為504 nm），繪制對硝基苯酚濃度與OD504的關系圖，判斷對硝基苯酚濃度對菌株細胞膜通透性的影響[30]。

1.4.2 細胞的疏水性 制備OD600值為0.700的菌懸液，按照1%(體積)的比例將菌懸液分別接種到對硝基苯酚濃度0～200.58 mg·L-1的100 ml 無機鹽培養(yǎng)基中，每個濃度3個平行樣品，分別置于10℃和30℃的搖床中，待樣品完全褪色后離心濃縮，用滅菌后的磷酸鹽緩沖液混勻離心洗滌2 次，用磷酸鹽緩沖液將樣品OD600值調(diào)節(jié)到0.6～0.7 范圍內(nèi)，計為A0，取3 ml 放入玻璃試管內(nèi)，加入1 ml 二甲苯劇烈晃蕩2 min 后，靜止40 min，抽取下層有機相測定其OD600值，計為Ai。利用式（1）計算每個濃度的CSH 值，判斷細胞的疏水性[31]。

CSH ＞55%：高度疏水性

54% ＞CSH ＞30%：中等疏水性

29% ＞CSH ＞10%：中等親水性

CSH ＜10%：高度親水性

1.5 Pseudomonas sp.ZL菌株低溫降解性能研究

1.5.1 pH對菌株ZL降解的影響 將菌株調(diào)節(jié)OD600值為0.600 的菌懸液，按照1%(體積)的比例接種到pH 分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、11.0 的對硝基苯酚濃度為100.48 mg·L-1的無機鹽培養(yǎng)基中，在10℃、120 r·min-1條件下培養(yǎng)76 h，測定對硝基苯酚濃度及OD600。

1.5.2 鹽度對菌株ZL 降解的影響 將OD600值為0.600 的菌懸液按照體積比1%接種到鹽度分別為0.01%、0.5%、1.0%、3.0%、3.5%的無機鹽培養(yǎng)基中，對硝基苯酚濃度為100.36 mg·L-1，在10℃、120 r·min-1、最佳pH 條件下培養(yǎng)56 h，測定對硝基苯酚濃度及OD600值。

1.5.3 外加氮源對菌株ZL 的影響 為了考察外加氮源種類及濃度對其降解的影響，將菌株按照上述方法制備菌懸液并分別接種到0.5 g·L-1和1.0 g·L-1的NaNO3、0.5 g·L-1和1.0 g·L-1的NH4NO3及0.5 g·L-1和1.0 g·L-1的(NH4)2SO4的無機鹽培養(yǎng)基中，在10℃、120 r·min-1、對硝基苯酚濃度為100.11 mg·L-1、最佳pH及鹽度條件下培養(yǎng)，間隔4 h取樣，分別測定對硝基苯酚濃度和OD600值。

1.5.4 接種量對菌株ZL 降解特性的影響 將OD600值為0.196、0.299、0.450、0.504、0.706、0.903 的菌懸液按照體積比1%接種到無機鹽培養(yǎng)基中，在10℃、120 r·min-1、對硝基苯酚濃度為100.34 mg·L-1以及最佳pH、氮源及鹽度的條件下培養(yǎng)83 h，測定對硝基苯酚濃度和OD600。經(jīng)式（2）計算的菌株接種濃度分別為54.08、95.68、144.00、161.28、225.92、288.96 mg·L-1。式（2）為Pseudomonas sp.ZL 菌株OD600值與其濃度的線性關系式，相關系數(shù)R2為0.995，擬合情況良好。

1.5.5 對硝基苯酚初始濃度對菌株ZL降解的影響 為了考察底物濃度對菌株降解的影響，按照最佳接種量將ZL 分別接種到對硝基苯酚濃度為11.23、16.57、22.11、28.31、47.27、55.46、82.31、108.87、145.31 mg·L-1的無機鹽培養(yǎng)基中。在10℃、120 r·min-1以及最佳pH、氮源及鹽度的條件下培養(yǎng)，隔段時間取樣，測定對硝基苯酚濃度和OD600值，分析不同對硝基苯酚濃度對其降解的影響。

1.6 Pseudomonas sp. ZL 低溫降解對硝基苯酚動力學研究

為了探討Pseudomonas sp. ZL 的低溫降解動力學模型，分別配制濃度為6.65～303.71 mg·L-1的對硝基苯酚新鮮培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基的pH、氮源、鹽度以及接種量調(diào)節(jié)至最佳。每個濃度3 個平行樣品，10℃、120 r·min-1條件下培養(yǎng)，定時取樣，實時監(jiān)測OD600值和對硝基苯酚濃度，繪制OD600和濃度隨時間的變化曲 線，采 用Haldane model[32]、Aiba model[33]、Yano model 和Webb model[34]進行擬合，探討Pseudomonas sp. ZL 的抑制動力學模型，考察低溫條件下菌株的降解特性。

式中，μ 為比生長速率，h-1；μmax為模型中的最大比生長速率，h-1；K 為Yano、Webb 模型擬合參數(shù)，mg·L-1；Ks為半飽和系數(shù)，mg·L-1；Ki為底物抑制系數(shù)，mg·L-1；S為對硝基苯酚的濃度，mg·L-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 對硝基苯酚對菌株疏水性和細胞膜通透性的影響

2.1.1 菌體形態(tài) Pseudomonas sp. ZL 透射電鏡照片如圖1 所示，該菌為革蘭陰性菌，呈橢圓狀，無鞭毛，無芽孢，表面透明，邊緣光滑整齊。菌落呈白色，不透明且圓潤。

2.1.2 菌株ZL 的細胞膜通透性 當細胞的外界條件改變（污染物、濃度和溫度等）而導致細胞通透性增加，乳糖誘導培養(yǎng)基誘導細胞內(nèi)部產(chǎn)生大分子β-半乳糖苷酶，在加入鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷后，還原產(chǎn)生的鄰硝基苯酚濃度增加。由于細胞膜通透性的改變，鄰硝基苯酚被釋放到細胞外，溶液由無色變成亮黃色，通過測定鄰硝基苯酚濃度（OD504）來判斷細胞通透性的改變[30]。由圖2 可知，在溫度分別為10℃和30℃，低溫條件下細胞通透性略高于常溫條件。而在相同溫度條件下，細胞膜通透性隨著對硝基苯酚濃度的增加而呈現(xiàn)先升高后降低的特性，該結(jié)論與前人的研究結(jié)果一致。

圖1 菌株透射電鏡圖Fig.1 Transmission electron microscopy of the strain

圖2 菌株ZL的細胞膜通透性Fig.2 Cell membrane permeability of ZL strain

2.1.3 菌株ZL 的細胞疏水性 研究表明細菌對有機物的吸附能力與其表面疏水性相關[35]。細胞的疏水性會受外界的刺激產(chǎn)生變化，同時細胞的疏水性可以表示細胞對底物毒性的反應[36]，底物毒性會增加對細胞的刺激性，導致細胞疏水性增強。由圖3可知，30℃下細胞的總體疏水性略低于低溫10℃的細胞疏水性，10℃條件下的菌株CSH 值在30%～54%階段，呈現(xiàn)中等疏水性，而30℃條件下的菌株呈現(xiàn)親水性，表明低溫培養(yǎng)會提高細胞疏水性[37]。由于其低溫條件下，疏水性處于中等程度，該菌株對底物的吸附能力增強，從而促進菌株對污染物質(zhì)的降解。而此時細胞的通透性也較強，對硝基苯酚更容易進入到細胞中，因此該菌株在低溫修復過程具有很大應用的潛力。

圖3 菌株ZL的細胞疏水性Fig.3 Cell hydrophobicity of ZL strain

2.2 Pseudomonas sp.ZL菌株降解性能的研究

2.2.1 初始pH 對菌株ZL 的影響 pH 會影響微生物的表面電荷[38]、離子有機化合物的電離[39]，從而影響微生物的降解特性。由圖4 可知，在10℃條件下對硝基苯酚降解率和生物量隨pH 的升高呈先上升后下降的趨勢。pH 為5.0 時，對硝基苯酚降解率僅為20.52%。當pH 為7.0 和9.0 時，對硝基苯酚降解率分別為61.82%和52.92%，且pH 為8.0 時對硝基苯酚降解率最高，為63.94%。由圖中OD600值隨pH的變化可知，在酸性條件下菌株的生長受到抑制，pH 為5.0 時OD600值為0.008；pH 為8.0 時OD600值為0.071，而pH達到11.0時，OD600值下降明顯。研究結(jié)果表明，菌株ZL 最佳降解pH 為8.0。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的主要原因是微生物降解過程中pH 會改變底物和酶的帶電狀態(tài)，從而影響酶促反應[13]。

2.2.2 鹽度對菌株ZL 的影響 鹽度對菌株的生長繁殖影響很大，菌株能承受的滲透壓不同，鹽度過高導致菌株脫水死亡，鹽度過低導致細胞吸水漲破死亡。由圖5 可知，當鹽度超過0.5%后對硝基苯酚降解率和OD600值均呈下降趨勢。當鹽度達到3.0%，對硝基苯酚降解率低于20%，菌株死亡率升高。相比對照組（0%），高鹽度條件下菌株降解能力和細胞生長均受到抑制，產(chǎn)生此現(xiàn)象的主要原因是當鹽度變化，細胞與外界滲透壓失衡，細胞內(nèi)水分流失，菌株生長受到抑制[40]。添加0.5%的NaCl的降解率和OD600值比對照組分別高出39.4%和0.01，因此菌株最適鹽度為0.5%的NaCl。

圖4 不同pH下對硝基苯酚降解率及其OD600Fig.4 The degradation rate of p-nitrophenol and OD600 in different pH

圖5 不同鹽度下對硝基苯酚降解率及其OD600值隨時間的變化情況Fig.5 Degradation rate of p-nitrophenol and OD600value with time at different salinity

2.2.3 外加氮源對菌株ZL 的影響 氮源是微生物生長不可或缺的營養(yǎng)物質(zhì)，外加氮源可為菌株降解過程補充氮元素用于合成蛋白質(zhì)[41]。為了給后續(xù)污染場地修復提供有效的修復藥劑，本文探討了三種不同種類的氮源對菌株降解的影響。圖6為不同外加氮源及濃度對底物降解率的影響，結(jié)果表明在相同時間下，氮源的添加均促進了菌株的降解和生長。且1.0 g·L-1的NH4NO3和0.5 g·L-1的(NH4)2SO4對對硝基苯酚降解率的影響較為明顯，58 h 后可完全降解100.11 mg·L-1的對硝基苯酚，大大縮短了反應的遲滯時間。由圖7 可知，外加氮源NH4NO3比(NH4)2SO4更能夠促進菌株的生長，而NaNO3對其降解未產(chǎn)生促進作用，添加1.0 g·L-1的NH4NO3菌株在72 h后OD600值依舊呈上升趨勢，96 h后OD600值可達0.111。由此可知，菌株的最適外加氮源為1.0 g·L-1的NH4NO3。

圖6 不同氮源對硝基苯酚降解率的影響Fig.6 Effects of different nitrogen sources on the degradation rate of p-nitrophenol

圖7 不同氮源下菌株的生長曲線Fig.7 Growth curves of strain at different nitrogen sources

2.2.4 接種量對菌株ZL 的影響 由圖8 可知，對硝基苯酚降解率與接種量呈現(xiàn)正相關的趨勢；當接種菌株濃度為225.92 mg·L-1、對硝基苯酚濃度為100.34 mg·L-1，低溫培養(yǎng)83 h后，對硝基苯酚降解率和OD600值分別達到99.94%和0.068。當接種菌株濃度超過225.92 mg·L-1后，對硝基苯酚降解率和OD600值均有略微下降趨勢。由此可知，菌株的最適菌株接種濃度為225.92 mg·L-1。

2.2.5 對硝基苯酚初始濃度對菌株降解的影響 污染物質(zhì)的濃度對于菌株的降解具有一定的計量效應。由圖9、圖10可知，對硝基苯酚的初始濃度對菌株的降解影響較大。對硝基苯酚初始濃度越小其降解時間越短，當對硝基苯酚濃度為108.87 mg·L-1時，降解時間為106 h。由于對硝基苯酚對于微生物具有一定的生物毒性，因此當?shù)孜餄舛仍黾?，降解的遲滯期增加。

圖8 不同接種量下對硝基苯酚降解率及其OD600Fig.8 Degradation rate of p-nitrophenol and OD600 at different inoculations

圖9 不同對硝基苯酚濃度下菌株對對硝基苯酚降解的影響Fig.9 Influence on degradation at different p-nitrophenol concentrations

2.3 Pseudomonas sp.ZL低溫降解動力學研究

為了研究10℃條件下Pseudomonas sp. ZL 降解特性并計算其動力學參數(shù)，在菌株的最佳降解條件下，分別配制了不同濃度的對硝基苯酚溶液，低溫培養(yǎng)并全程采樣。圖11、圖12 為菌株Pseudomonas sp.ZL的降解曲線。由圖11可知，菌株可在108 h內(nèi)降解106.98 mg·L-1對硝基苯酚，降解率為99.34%，且對106.98～303.71 mg·L-1的對硝基苯酚依然有降解趨勢。當對硝基苯酚濃度為139.44 mg·L-1時，抑制作用較為明顯，菌株生長速率緩慢，遲緩期延長。當初始濃度為346.31 mg·L-1，菌株未發(fā)生降解。由此可知，該菌株在低溫條件下，菌株ZL 能夠耐受并降解的對硝基苯酚濃度為303.71 mg·L-1。

圖10 不同對硝基苯酚濃度下菌株OD600值隨時間的變化Fig.10 The variation of OD600 value with time under different p-nitrophenol concentration

由于對硝基苯酚的劑量效應產(chǎn)生的抑制作用，菌株的比生長速率會受到影響。由圖13可知，通過對Haldane 模型、Aiba 模型、Yano 模型和Webb 模型的擬合，菌株的比生長速率均呈現(xiàn)隨著對硝基苯酚濃度的升高先上升后下降的趨勢。其中Ks為最大速率一半時的底物濃度[42]。Ki表示底物對菌株的抑制作用，Ki值越高，底物的抑制濃度越小，菌株耐受對硝基苯酚能力越強[43]。表1為菌株ZL在10℃條件下的模型擬合參數(shù)，Aiba 模型擬合的R2值為0.988，擬合情況良好，μmax和Ks值分別為0.205 h-1和3.40 mg·L-1，Ki為166.86 mg·L-1。由擬合結(jié)果可知，當對硝基苯酚濃度高于166.86 mg·L-1時比生長速率下降，因此166.86 mg·L-1即為該條件下菌株的抑制濃度。目前，針對對硝基苯酚降解菌動力學研究均在25～30℃之間，而10℃條件下的抑制降解動力學的研究尚未發(fā)現(xiàn)。表2為不同對硝苯酚降解菌的抑制降解動力學模型參數(shù)比較結(jié)果，模型中μmax/Ks值為低濃度的對硝基苯酚的一級降解速率常數(shù)[27]。在10℃條件下，菌株ZL 的一級降解速率常數(shù)為0.060，明顯高于大多數(shù)30℃下對硝基苯酚降解菌株，由此可知在10℃條件下，菌株ZL對對硝基苯酚的降解能力優(yōu)于其他對硝基苯酚降解菌。此外，模型中Ks/Ki值可表示菌株受到的抑制作用大小[28]，由此可知菌株ZL受到的抑制作用相對于其他菌株更小，而能夠耐受的對硝基苯酚濃度和污染物的有效利用率相對于其他菌株來說更高，因此該菌株在修復低溫地下水及土壤污染方面具有一定的應用潛力。

圖11 對硝基苯酚降解隨時間變化情況Fig.11 Degradation of p-nitrophenol changes with time

圖12 生物量隨時間變化情況Fig.12 The variation of biomass with time

圖13 低溫降解動力學模型擬合Fig.13 Fitting of degradation kinetic model at low temperature

表1 不同模型擬合菌株ZL降解對硝基苯酚動力學參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of degradation of pnitrophenol by ZL strain fitted by different models

3 結(jié) 論

（1）在10℃條件下菌株Pseudomonas sp.ZL 的細胞通透性略高于30℃，而疏水性處于中等程度，說明該菌株在低溫條件下對對硝基苯酚的吸附能力較強，因此對污染物質(zhì)的降解能力也較強。

（2）在10℃條件下菌株Pseudomonas sp.ZL 能夠耐受并降解303.71 mg·L-1的對硝基苯酚，該菌株的最 佳 降 解 條 件 為pH=8.0，0.5% NaCl，1 g·L-1NH4NO3，最適初始菌株的接種濃度為225.92 mg·L-1，該條件能夠有效促進對硝基苯酚的降解速率并大大縮短降解的延遲時間。

（3）在10℃、最佳單因素條件下，菌株ZL的抑制降解動力學模型符合Aiba 模型，菌株ZL 的最大比生長速率為0.205 h-1，半飽和系數(shù)為3.40 mg·L-1，抑制系數(shù)為166.86 mg·L-1，即為該條件下菌株的抑制濃度。此外，模型中Ks/Ki值可表示菌株受到的抑制作用大小，由此可知菌株ZL受到的抑制作用相對于其他菌株更小，而能夠耐受的對硝基苯酚濃度和物質(zhì)的有效利用率相對于其他菌株來說更高，因此該菌株在修復低溫地下水及土壤污染方面具有較高的應用潛力。

表2 不同對硝基苯酚降解菌降解動力學模型及參數(shù)Table 2 Degradation kinetic model parameters of different p-nitrophenol degrading bacteria