肝癌細(xì)胞中叢生蛋白的差異性表達(dá)檢測和啟動子表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

于秋麗，王 峰

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的肝臟惡性腫瘤[1]，肝癌的發(fā)生發(fā)展是環(huán)境、病毒、癌基因激活和抑癌基因突變等多種因素共同作用的結(jié)果。目前其治療以手術(shù)、介入治療、分子靶向治療以及全身系統(tǒng)化療等多種治療手段聯(lián)合應(yīng)用為主。由于肝癌發(fā)病早期缺乏典型特征和特異性生物標(biāo)志物，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，失去了最佳的治療時機(jī)，以致肝癌是所有癌癥相關(guān)死亡的第三大死亡原因[2]。闡明肝癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的分子基礎(chǔ)，找到用于肝癌早期檢測和分子靶點的生物標(biāo)志物，將為肝癌的早期診斷和治療提供新的視角。叢生蛋白(clusterin，CLU)是一種應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)伴侶蛋白，在多種癌癥中過表達(dá)，以應(yīng)對化療、激素消融術(shù)和放射治療等癌癥治療方法，從而產(chǎn)生抵抗性[3,4]。為探究HCC中CLU的表達(dá)，Kang等[5]用組織微陣列方法檢查了100例手術(shù)切除的HCC組織，發(fā)現(xiàn)共有89例HCC組織表現(xiàn)出CLU過表達(dá)，這與腫瘤不良的Edmondson組織學(xué)分級和高TNM分期有關(guān)。另一項研究[4]表明CLU過表達(dá)是肝癌轉(zhuǎn)移的重要因素，這可能與人類軟骨糖蛋白-39在HCC中的轉(zhuǎn)移作用有關(guān)。鑒于CLU在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中的重要作用，本研究對CLU在肝癌細(xì)胞HepG2中的表達(dá)情況進(jìn)行定量并構(gòu)建其啟動子的表達(dá)質(zhì)粒，以期對其在肝癌中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌細(xì)胞株HepG2和人正常肝細(xì)胞L02均是本實驗室保存。上述細(xì)胞分別培養(yǎng)于含有10%胎牛血清(Gibco公司)的DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司)和含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基(Gibco公司)培養(yǎng)液中。培養(yǎng)箱條件設(shè)置為37 ℃、5% CO2。待細(xì)胞匯合度達(dá)到85%以上時用于后續(xù)研究實驗。

1.2RNA的提取及實時熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)

嚴(yán)格按照TaKaRa試劑盒說明書的步驟進(jìn)行L02細(xì)胞和HepG2細(xì)胞RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄，按照SYBR Master Mix試劑盒(Roche公司)說明書配制反應(yīng)體系和設(shè)置反應(yīng)條件，進(jìn)行RT-qPCR檢測。每個樣本至少重復(fù)3次，計算平均Ct值，根據(jù)2-ΔΔCt計算相對表達(dá)量。CLU的引物序列：F：5′-CTACTTCTGGATGAATGGTGACC-3′；R：5′-CGGGTGAAGAACCTGTCCT-3′。內(nèi)參GAPDH的引物序列：F：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′；R：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。

1.3CLU基因的啟動子的分析 CLU基因的啟動子序列通過冷泉港的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/TRED/tred.cgi?process=searchPromForm)分析獲得，序列為-700～+300。該數(shù)據(jù)庫以Genebank中的序列為基礎(chǔ)。見表1。

表1 CLU基因啟動子序列信息

1.4細(xì)胞基因組DNA的提取 按照TaKaRa試劑盒說明書進(jìn)行肝癌細(xì)胞HepG2基因組DNA的提取。檢測DNA的純度為1.91(A260/A280)，符合要求。

1.5HepG2細(xì)胞CLU基因的啟動子序列測序 提取的HepG2基因組送上海生工公司進(jìn)行CLU基因啟動子序列測序，并合成測序后的啟動子序列。

1.6CLU基因啟動子克隆質(zhì)粒構(gòu)建 合成測序后的啟動子序列，并在啟動子序列的兩端加上酶切位點(XmaⅠ/XhoⅠ)序列，用2種限制性內(nèi)切酶對pGL3-Basic質(zhì)粒進(jìn)行酶切，膠回收載體片段，然后通過連接反應(yīng)將目的啟動子序列插入到pGL3-Basic表達(dá)載體中，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，經(jīng)篩選獲得單克隆。

1.7質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、提取及驗證 將含有pGL3-CLU質(zhì)粒的菌種接種到含有氨芐青霉素的(100 mg/L)LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃搖床中培養(yǎng)16 h。提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切(XmaⅠ/XhoⅠ限制性內(nèi)切酶)，酶切后質(zhì)粒通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定。提取的質(zhì)粒進(jìn)一步通過測序鑒定。

2 結(jié)果

2.1HepG2細(xì)胞和L02細(xì)胞的CLU mRNA表達(dá)水平比較 RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞CLU mRNA的表達(dá)水平顯著高于L02細(xì)胞(t=20.670,P=0.002)。HepG2細(xì)胞CLU mRNA的相對表達(dá)量約是L02細(xì)胞的9.38倍。見圖1。

圖1 HepG2細(xì)胞和L02細(xì)胞的CLU mRNA表達(dá)水平比較圖

2.2HepG2細(xì)胞CLU基因啟動子測序結(jié)果與Genebank中的序列比對結(jié)果 測序比對結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞的CLU基因啟動子區(qū)序列與Genebank中的序列一致，未發(fā)現(xiàn)突變。見圖2。

2.3pGL3-CLUP表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 構(gòu)建后的重組pGL3-CLUP質(zhì)粒用XmaⅠ/XhoⅠ酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果顯示pGL3-CLUP質(zhì)粒在雙酶切之后，出現(xiàn)兩條片段，一條在5 000 bp附近，一條在1 000～1 500 bp處。經(jīng)單酶切的原質(zhì)粒pGL3-CLUP電泳條帶在5 000～6 000 bp之間，提示表達(dá)啟動子的重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，見圖3。pGL3-CLUP表達(dá)質(zhì)粒圖譜見圖4。

圖2 HepG2細(xì)胞CLU基因啟動子測序結(jié)果與Genebank中的序列比對結(jié)果圖

條帶1為DNA ladder，條帶2為經(jīng)雙酶切之后的pGL3-CLUP質(zhì)粒，條帶3為經(jīng)單酶切的pGL3-CLUP質(zhì)粒

圖4 pGL3-CLUP質(zhì)粒圖譜

3 討論

3.1肝癌的發(fā)生涉及癌基因及其產(chǎn)物的多個突變，這些突變通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。由于缺乏有效的特異性生物標(biāo)志物，早期肝癌的成功檢測是一個挑戰(zhàn)，以至于發(fā)現(xiàn)癥狀時多數(shù)患者已處于晚期。肝癌的傳統(tǒng)治療以化療、肝臟切除、肝移植和射頻消融為主，但療效均不理想，導(dǎo)致肝癌患者的病死率較高[6]。早期診斷可為肝癌患者盡早接受有效治療提供機(jī)會，改善預(yù)后。

3.2肝癌在發(fā)生發(fā)展過程中會差異性表達(dá)很多基因，這些基因在肝癌中的差異性表達(dá)大多受其啟動子的調(diào)控，有些基因已被作為肝癌的差異性診斷標(biāo)志物，還有一些基因參與了肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。如本研究團(tuán)隊在此前的一項研究[7]中發(fā)現(xiàn)，鈣調(diào)蛋白2(calponin 2，CNN2)在肝癌中高表達(dá)，并對肝癌的發(fā)生發(fā)展起著重要作用；而我們的另一項研究[8]還發(fā)現(xiàn)，蛋白衰老標(biāo)記蛋白30(senescence marker protein 30，SMP30)在肝癌中特異性低表達(dá)，可作為肝癌的潛在預(yù)后指標(biāo)。

3.3CLU基因是一個單拷貝基因，位于8p21-p12染色體上，由9個外顯子、8個內(nèi)含子和一個5′-未翻譯區(qū)域構(gòu)成，它編碼人類的三種不同轉(zhuǎn)錄異型體[9]：亞型1，NM_001831，mRNA(GenBank)；亞型2，NR_038335，非編碼RNA(GenBank)；亞型3，NR_045494，非編碼RNA(GenBank)。GenBank數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)顯示，亞型1編碼功能蛋白，而亞型2和亞型3代表非編碼RNA。在人類中，有兩種由該基因編碼的蛋白質(zhì)：分泌型叢生蛋白(secretory clusterin，sCLU)(75～80 kda)和核CLU蛋白(55 kda)[10]。CLU基因首次在公羊睪丸網(wǎng)液中被檢測到，隨后在許多不同的組織中發(fā)現(xiàn)CLU基因的存在[11,12]。因此，在對該基因的研究之初，它有許多不同的名稱，如SGP-2、SP40-40、TRPM-2和ApoJ。后來經(jīng)過完整的cDNA克隆、測序和比較，證實SGP-2和TRPM-2與CLU完全相同，后來被正式命名為CLU[4]。

3.4熱休克處理HepG2細(xì)胞可以誘導(dǎo)CLU mRNA表達(dá)，且這種熱休克誘導(dǎo)在不同物種的培養(yǎng)細(xì)胞中都可以觀察到。由于臨床上可能存在熱休克與細(xì)胞凋亡的關(guān)聯(lián)，故CLU可能在細(xì)胞凋亡過程中起作用[13,14]。隨著研究的深入，CLU被發(fā)現(xiàn)在許多人類腫瘤中表達(dá)，包括乳腺癌、肺癌、膀胱癌、腎癌和前列腺癌，且其表達(dá)與化療藥物的廣泛耐受有關(guān)。

3.5sCLU是一種80 kda糖蛋白，幾乎存在于所有體液中，對CLU基因的研究使人們對腫瘤耐藥的全新機(jī)制有了新的認(rèn)識。sCLU在多種不同的肝癌組織中表達(dá)水平存在差異，并可能促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移和參與HCC對化療的抵抗。但sCLU在HCC組織中的表達(dá)與HCC患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系仍不清楚，未來需要收集更多的乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染的HCC患者的樣本來研究[15]。越來越多的研究[16]表明，CLU基因在肝癌細(xì)胞中異常高表達(dá)，其有望成為HCC的一種新型生物標(biāo)志物。然而CLU在肝癌組織和血清中表達(dá)的相關(guān)性還不是很清楚，如果能找到CLU在肝癌組織中的表達(dá)與血清中表達(dá)的關(guān)系，了解CLU在HCC耐藥的機(jī)制和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，對于解決HCC多藥耐藥問題及肝癌的個體化治療具有重要意義[4]。

綜上所述，肝癌細(xì)胞CLU基因的表達(dá)量明顯高于正常肝細(xì)胞。pGL3-CLUP質(zhì)粒的成功構(gòu)建為后續(xù)研究CLU基因在肝癌發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。