礦物藥青礞石對戊四唑點燃癲癇大鼠腸道菌群的影響

袁 鵬，馬瑜璐，劉圣金*，房 方，楊文國，卞 勇，徐晨昱，張志杰，奧?烏力吉，段金廒*

礦物藥青礞石對戊四唑點燃癲癇大鼠腸道菌群的影響

袁 鵬1，馬瑜璐1，劉圣金1*，房 方1，楊文國1，卞 勇1，徐晨昱1，張志杰2，奧?烏力吉3，段金廒1*

1. 南京中醫(yī)藥大學藥學院/江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心/國家中醫(yī)藥管理局中藥資源循環(huán)利用重點研究室，江蘇 南京 210023 2. 中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京 100700 3. 內(nèi)蒙古民族大學，內(nèi)蒙古 通遼 028000

研究青礞石對戊四唑（pentylenetetrazol，PTZ）點燃癲癇大鼠腸道菌群的影響，從腸道微生態(tài)環(huán)境視角探討青礞石治療癲癇疾病可能的作用機制。以青礞石粉末為研究對象，用PTZ點燃法建立大鼠癲癇動物模型，實驗分為對照組、模型組、卡馬西平組和青礞石組（高劑量組為臨床用量的20倍、低劑量組為臨床用量的5倍）。給藥4周后，取各組大鼠結(jié)腸內(nèi)容物，通過16S rRNA測序?qū)Ω鹘M大鼠腸道菌群的多樣性進行分析，利用UPARSE、SPSS 18.0等對結(jié)果進行生物信息學及統(tǒng)計學分析。α多樣性分析可知，模型組大鼠腸道菌群的Chao 1、Ace豐富度指數(shù)與對照組相比沒有顯著性變化；與對照組、模型組相比，青礞石組尤其是高劑量組對細菌群落豐富度有顯著影響（＜0.05）。Shannon、Simpson群落多樣性指數(shù)分析結(jié)果顯示，模型組與對照組無顯著性差異；青礞石組對群落多樣性干預不明顯。青礞石主要干預腸道菌群的豐富度、卡馬西平主要干預腸道菌群的多樣性。β多樣性各組層級聚類均能較好地分開，其中青礞石高劑量組與低劑量組部分樣本不能明顯分開，2組樣本可歸為一類，對照組、模型組可歸為一類，卡馬西平組單獨歸為一類。3D-主成分分析（3D-principal component analysis，3D-PCA）、3D-主坐標分析（3D-principal co-ordinates analysis，3D-PCoA）結(jié)果顯示，各組菌群結(jié)構(gòu)輪廓均能明顯分開，青礞石低劑量組介于對照組和模型組之間，菌群結(jié)構(gòu)輪廓部分與模型組、對照組有重合交叉，且有偏向?qū)φ战M的明顯趨勢。非度量多維尺度（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）分析結(jié)果顯示，對照組、模型組、青礞石組集中在一個區(qū)域，青礞石組與模型組、對照組有重合交叉，青礞石高劑量組、低劑量組對腸道菌群結(jié)構(gòu)有相似的干預效果。物種組成門水平分析可知，各組大鼠的優(yōu)勢菌群主要有厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria），其中厚壁菌門占比最大，其次是擬桿菌門。模型組疣微菌門相對豐度較對照組顯著增加（＜0.01），模型組變形菌門的相對豐度最高；青礞石干預后疣微菌門相對豐度下降，變形菌門相對豐度有不同程度降低。屬水平分析可知，與對照組相比，模型組中norank_f__Muribaculaceae（＜0.05）、菌屬（＜0.01）相對豐度顯著增加，乳桿菌屬顯著減少（＜0.05）；青礞石干預后可降低菌屬、升高乳桿菌屬的相對豐度。另外，線性判別分析效應大?。╨inear discriminant analysis effect size，LEfSe）分析可知厚壁菌門的瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）在模型組中顯著富集，給予青礞石干預后，瘤胃球菌科相對豐度顯著降低。青礞石對PZT點燃癲癇大鼠腸道菌群物種組成的豐富度、多樣性具有明顯的調(diào)節(jié)作用，可有效干預腸道微生態(tài)的重建。

礦物藥；青礞石；癲癇；戊四氮；結(jié)腸；腸道菌群；腦-腸軸；作用機制

青礞石始載于宋《嘉祐補注神農(nóng)本草經(jīng)》（簡稱《嘉祐本草》），屬鎂類礦物藥，系變質(zhì)巖類黑云母片巖（biotite schist）或綠泥石化云母碳酸鹽片巖（mica carbonate by chloritization）。其性平，味甘、咸，歸肺、心、肝經(jīng)；具墜痰下氣、平肝鎮(zhèn)驚之功效，用于頑痰膠結(jié)、咳逆喘急、癲癇發(fā)狂、煩躁胸悶、驚風抽搐[1-3]。

癲癇（epilepsy）是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，是一種反復性、持久性、具有致癇傾向特征的慢性腦部疾病，會帶來嚴重的神經(jīng)、認知、心理和社會后果，影響著全世界各年齡段5000萬人的生活，其發(fā)生與大腦中異常過度或同步的神經(jīng)活動有關(guān)[4-5]。癲癇的病因復雜，包括后天結(jié)構(gòu)損傷、遺傳、感染、代謝、免疫和未知等因素[6]。越來越多的研究表明，腸道菌群可能在癲癇中發(fā)揮著潛在作用，腸道菌群作為人體腸道的重要組成部分，參與宿主營養(yǎng)代謝、維持腸道黏膜屏障結(jié)構(gòu)完整性、免疫調(diào)節(jié)等生理活動[7]。人體內(nèi)存在的腦-腸軸（brain-gut axis）是大腦與胃腸道之間的關(guān)鍵通路，腸道菌群和大腦可以通過中樞和腸道神經(jīng)系統(tǒng)以及內(nèi)分泌、免疫和代謝途徑實現(xiàn)雙向溝通[8-9]。大腦通過迷走神經(jīng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)腸道菌群，腸道菌群產(chǎn)生神經(jīng)遞質(zhì)和調(diào)質(zhì)影響腸神經(jīng)系統(tǒng)，從而調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)[10-11]。腸道菌群通常與腦-腸軸間保持著穩(wěn)態(tài)關(guān)系，如腸道菌群的失調(diào)會引起多種神經(jīng)紊亂，導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，癲癇與腦-腸軸的穩(wěn)態(tài)失衡密切相關(guān)[12]。

在前期研究的基礎(chǔ)上[13-14]，青礞石對癲癇臨床療效可靠，本研究采用16S rDNA高通量測序技術(shù)對大鼠腸道菌群的多樣性進行分析，研究青礞石對PTZ點燃癲癇大鼠腸道微生物的影響，探討青礞石治療癲癇疾病可能的作用機制。

1 材料

1.1 動物

清潔級雄性SD大鼠購于浙江省醫(yī)學科學院，合格證號：SCXK（浙）2019-0002，共40只，體質(zhì)量180～220 g。大鼠購入后適宜條件下適應性喂養(yǎng)1周，自由飲食飲水，動物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中，12 h晝夜交替，室溫20～24 ℃，相對濕度50%左右。動物實驗通過南京中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會的批準，批準文號為201910A029

1.2 藥材與試劑

青礞石藥材由亳州礦石專營店提供（批號20140412），經(jīng)南京中醫(yī)藥大學中藥鑒定學教研室吳德康教授鑒定為青礞石，經(jīng)南京大學地球科學與工程學院孔慶友教授鑒定為變質(zhì)巖類黑云母片巖，樣品留存于南京中醫(yī)藥大學中藥鑒定學教研室?？R西平片（批號X1395，北京諾華制藥有限公司）；戊四唑（pentylenetetrazol，PTZ）（批號1002905179，美國Sigma公司）；E.Z.N.A.?soil DNA試劑盒（Omega Bio-tek，美國）；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit （Axygen Biosciences，美國）；聚乙二醇400（PEG 400，化學純，上海凌峰化學試劑有限公司）。

1.3 主要儀器

ABI GeneAmp?9700型基因擴增儀（ABI，美國）；NanoDrop2000超微量分光光度計（Thermo Fisher Scientific，美國）；DYY-6C電泳儀（北京市六一儀器廠）。

2 方法

2.1 動物模型的建立

采用PTZ點燃法制備癲癇大鼠模型[13-15]，用生理鹽水將PTZ配成質(zhì)量濃度為0.01 g/mL的溶液，每天固定時間ip給予大鼠35 mg/kg PTZ進行造模。持續(xù)給藥4周后，停1周，再以同劑量PTZ進行測試，參照Racine分級標準[16-17]，包括有無驚厥、面部陣攣、節(jié)律性點頭、前肢陣攣及跌倒等特征，以大鼠連續(xù)表現(xiàn)5次II級或II級以上驚厥反應為達到點燃標準。I級標準：面部陣攣；II級標準：面部陣攣并伴節(jié)律性點頭；III級標準：面部陣攣、伴節(jié)律性點頭及前肢陣攣；IV級標準：面部陣攣、伴節(jié)律性點頭、前肢陣攣及后肢站立；V級標準：面部陣攣、伴節(jié)律性點頭、前肢陣攣、后肢站立并跌倒。大鼠若出現(xiàn)Ⅴ級無明顯間歇的癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作，給予7%水合氯醛1 mL緩解發(fā)作。實驗期間，觀察并記錄大鼠的體質(zhì)量變化、精神狀態(tài)、癲癇發(fā)作情況。

2.2 給藥樣品的制備

卡馬西平片溶于生理鹽水，配成質(zhì)量濃度為0.02 g/mL的卡馬西平溶液。青礞石藥材去除石英等雜質(zhì)，置瑪瑙研缽中研磨成細粉，過藥典6號篩，用PEG 400為介質(zhì)配成0.5 g/mL青礞石混懸液，每次給藥前超聲混勻。

2.3 分組、給藥與采樣

實驗動物共分為5組，給予生理鹽水的大鼠（8只）作為對照組；造模成功的大鼠隨機均分為4組，即模型組，卡馬西平陽性對照組，青礞石高、低劑量組。對照組和模型組ig給予5 mL/kg生理鹽水；卡馬西平組按5 mL/kg劑量ig給藥；青礞石高、低劑量組按青礞石臨床用量的20倍、5倍（臨床等效劑量）設(shè)計給藥高、低劑量，高劑量組按4 mL/kg劑量ig給藥，低劑量組按1 mL/kg劑量ig給藥。每天固定時間給藥1次，持續(xù)給藥4周。每周稱體質(zhì)量2次，并根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整劑量。最后1次給藥后次日，異氟烷吸入麻醉后處死各組大鼠取結(jié)腸內(nèi)容物，置于?80 ℃冰箱中待測。

2.4 小腸內(nèi)容物DNA提取和高通量測序

依據(jù)E.Z.N.A.?soil DNA試劑盒說明書進行細菌總DNA提取，DNA濃度和純度利用NanoDrop 2000超微量分光光度計進行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。使用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）擴增細菌16S rRNA的V3-V4可變區(qū)。PCR產(chǎn)物利用2%瓊脂糖凝膠進行回收，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST檢測定量，Illumina Miseq平臺進行測序。本研究的測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

2.5 生物信息學和統(tǒng)計分析

運用UPARSE軟件，根據(jù)97%的相似度對序列進行OTU（operational taxonomic units）聚類，并在聚類的過程中去除單序列和嵌合體。利用RDP classifier（http://rdp.cme.msu.edu/）對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva數(shù)據(jù)庫（SSU123），設(shè)置比對閾值為70%。利用OTU聚類產(chǎn)生的稀釋曲線對取樣深度情況進行分析，并進行α多樣性（α diversity）分析，包括衡量物種豐富度的指數(shù)（chao1、Ace）和衡量樣本多樣性的指數(shù)（Shannon、Simpson）等，比較各組樣品間豐度和多樣性。菌群結(jié)構(gòu)分析，對各組生物樣本腸道菌群進行β多樣性（β diversity）樣本層級聚類分析（hierarchical clustering tree）、主成分分分析（principal component analysis，PCA）、主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）、非度量多維尺度（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）分析等。

2.6 統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況及模型建立

各組大鼠體質(zhì)量隨時間增加，增速相似，無明顯差異。造模大鼠1周左右毛色逐漸發(fā)黃，第2周開始出現(xiàn)Ⅱ級驚厥反應，造模第4周，大鼠出現(xiàn)Ⅱ級及以上驚厥反應；造模測試中，大鼠多出現(xiàn)連續(xù)5次Ⅱ級或Ⅱ級以上驚厥反應，達到PTZ點燃癲癇大鼠模型標準。32只大鼠用于PTZ模型制備，過程中死亡8只，造模成功率為75.0%。

3.2 OTU及稀釋曲線分析

對各組大鼠腸道內(nèi)容物樣品中細菌16S rRNA（V3-V4區(qū)）進行PCR擴增和測序分析，共得到1 360 324條有效序列。物種OTU數(shù)目排序等級與豐度曲線顯示，各組曲線平滑下降，表明各組大鼠內(nèi)容物菌群物種豐富、多樣性程度較高，物種均勻度較好，見圖1-a。Pan物種分析顯示隨著樣本數(shù)目的增加，各組總OTU數(shù)目增加趨勢逐步減緩并趨于恒定（曲線上升趨于平緩），見圖1-b；Core物種分析顯示隨著樣本數(shù)目的增加，各組樣本共有的OTU數(shù)目逐漸下降并趨于恒定（曲線下降趨于平緩），見圖1-c。采用對序列進行隨機抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與其所能代表各分類學水平的數(shù)目構(gòu)建稀釋曲線，結(jié)果物種數(shù)目在2000以上時，Shannon稀釋曲線趨向平坦，說明測序數(shù)據(jù)量合理，提供樣本足夠多，測序深度可靠，見圖1-d。

3.3 腸道菌群α多樣性分析

各組大鼠Chao 1、Ace細菌群落豐富度指數(shù)和Shannon、Simpson群落多樣性指數(shù)，見圖2。結(jié)果顯示，模型組大鼠細菌群落的Chao 1、Ace豐富度指數(shù)與對照組相比沒有顯著性變化；與對照組、模型組相比，青礞石組尤其是高劑量組對群落豐富度有較大影響，卡馬西平組對群落豐富度沒有顯著性影響。Shannon、Simpson群落多樣性結(jié)果顯示，模型組與對照組無顯著性差異；與對照組、模型組相比，卡馬西平組有顯著性影響，青礞石組對群落多樣性干預不明顯。結(jié)果表明，用PTZ點燃法制備癲癇大鼠模型對其腸道菌群的豐富度、多樣性沒有顯著性影響；青礞石主要干預腸道菌群豐富度、卡馬西平主要干預腸道菌群的多樣性。

3.4 腸道菌群結(jié)構(gòu)β多樣性分析

在OTU水平對大鼠腸道菌群進行層級聚類分析及3D-PCA、3D-PCoA、NMDS分析，見圖3。層級聚類結(jié)果顯示，對照組、模型組、卡馬西平組及青礞石組樣本基本能分開歸類，對照組、模型組可歸為一類，青礞石高、低劑量組可歸為一類，卡馬西平組單獨歸為一類，部分模型組樣本與青礞石組歸為一類。說明各組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定程度的變化，且青礞石高、低劑量組對腸道菌群結(jié)構(gòu)有相似的干預效果。

3D-PCA、3D-PCoA分析結(jié)果顯示，對照組、模型組、卡馬西平組、青礞石組菌群結(jié)構(gòu)輪廓均能明顯分開，除少數(shù)樣本外，各組多數(shù)樣本能較為集中分布，大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化。青礞石低劑量組介于對照組和模型組之間，部分與模型組、對照組重合交叉，且有向?qū)φ战M偏離的明顯趨勢。說明青礞石、卡馬西平對大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)均有明顯的干預作用，青礞石低劑量組對腸道菌群結(jié)構(gòu)的干預更趨近于對照組?？R西平組、青礞石高劑量組對大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響差異性更大。NMDS分析結(jié)果顯示，對照組、模型組、青礞石組集中在一個區(qū)域，青礞石低劑量組與高劑量組、模型組、對照組均有交叉重合，說明青礞石高、低劑量組對腸道菌群結(jié)構(gòu)有相似的干預效果，且有利于PTZ癲癇大鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)恢復與重建。以上結(jié)果與聚類分析結(jié)果相一致。

圖1 OTU、稀釋曲線分析

*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

B-對照組 M-模型組 K-卡馬西平組 H-青礞石4 mL·kg ?1組 L-青礞石1 mL·kg ?1組，圖4、5同

3.5 腸道菌群物種組成分析

如圖4所示，在門水平上，組間腸道菌群組成存在一定差異。各組大鼠的優(yōu)勢菌群主要集中于5個門：厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria），其中厚壁菌門在各組中占比最大，其次是擬桿菌門。模型組大鼠腸道內(nèi)容物中檢測到稀有菌群疣微菌門相對豐度較對照組顯著增加（＜0.01），青礞石、卡馬西平干預后，疣微菌門相對豐度均顯著減少（＜0.05）。模型組大鼠中變形菌門的相對豐度最高，在對照組和青礞石、卡馬西平組大鼠體內(nèi)都有不同程度降低。青礞石組大鼠腸道內(nèi)容物的擬桿菌門相對豐度高于對照組和模型組，厚壁菌門與擬桿菌門比值降低。各組間單物種及對照組與模型組比較Post-hoc圖見圖5。

*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001 a-各組菌群平均水平 b-組間多物種比較 c-各組物種Venn圖 d-各組樣本與物種關(guān)系Circos分析

*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

如圖6所示，在屬水平上，各組大鼠中主要優(yōu)勢菌群有28種（圖6-a），其中具有顯著差異的菌群有7種（圖6-b），分別是norank_f_Muribaculaceae、乳桿菌屬、unclassified_f_ Lachnospiraceae、梭菌屬_sensu_stricto_ 1、unclassified_f_Ruminococcaceae、擬桿菌屬、菌屬。與對照組大鼠相比，模型組大鼠中norank_f_Muribaculaceae、相對豐度顯著增加，乳桿菌屬顯著減少（圖7-a）。給予青礞石、卡馬西平干預后，乳桿菌屬相對豐度顯著升高，Akkermansia菌屬相對豐度降低。乳桿菌屬的相對豐度各組存在顯著差異（對照組25.14%，模型組10.00%，卡馬西平組38.06%，青礞石高劑量組15.56%，青礞石低劑量組16.41%，＜0.01）。青礞石對癲癇大鼠中乳桿菌屬、Akkermansia菌屬具有趨向?qū)φ战M的調(diào)節(jié)作用（圖7-b、c）。

3.6 LEfSe多級物種差異判別分析

采用線性判別效應大小LEfSe分析（linear discriminant analysis）方法，比較各組大鼠從門到屬的菌群變化，分析青礞石與癲癇可能相關(guān)的特定菌，見圖8。結(jié)果顯示，各組大鼠腸道菌群差異顯著，不同劑量青礞石干預后大鼠腸內(nèi)的擬桿菌門相對豐度顯著增加。疣微菌門及菌屬在模型組大鼠腸道內(nèi)中顯著富集，疣微菌門和菌屬在對照組大鼠腸道菌群組成中相對豐度非常低，癲癇造模后，這些稀有菌群相對豐度顯著升高，給予不同劑量青礞石后相對豐度顯著降低，接近對照組。厚壁菌門瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）微生物在模型組大鼠腸內(nèi)呈顯著富集，青礞石給藥后富集程度均降低。

*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001 a-各組菌群平均水平 b-組間多物種比較

*P＜0.05 **P＜0.01 a-對照組與模型組比較Post-hoc圖 b-乳桿菌屬組間箱線比較 c-Akkermansia菌屬組間箱線比較

4 討論

4.1 青礞石對PTZ點燃癲癇大鼠腸道菌群的干預

青礞石對PTZ點燃癲癇大鼠腸道菌群的物種組成的豐富度、多樣性具有明顯的調(diào)節(jié)作用，可達到腸道微生態(tài)的重建。3D-PCA、3D-PCoA分析結(jié)果顯示，各組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化，菌群結(jié)構(gòu)輪廓明顯分開，青礞石組對大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)有明顯的干預作用。模型組大鼠腸道內(nèi)容物中檢測的疣微菌門比例較對照組大鼠顯著增加（＜0.01），青礞石、卡馬西平干預后，疣微菌門比例均顯著減少（＜0.05），與相關(guān)研究結(jié)果一致，疣微菌門與神經(jīng)性疾病密切相關(guān)，可能是影響癲癇的發(fā)生、發(fā)展的重要菌門之一，疣微菌門對癲癇的發(fā)生、發(fā)展具有促進作用[18-19]。青礞石能顯著降低癲癇大鼠變形菌門的相對豐度，變形菌門的異常高表達在癲癇大鼠體內(nèi)可引起炎癥反應，主要物種組成的厚壁菌門和擬桿菌門尚可通過產(chǎn)生短鏈脂肪酸對腸道免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生積極的調(diào)節(jié)作用[20]。癲癇大鼠中乳桿菌屬相對豐度顯著降低，菌屬顯著增加，給予不同劑量的青礞石后，乳桿菌屬的相對豐度顯著上升，菌屬顯著降低。乳桿菌能夠增加抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的含量，控制神經(jīng)元的異常放電，從而抑制癲癇的發(fā)作，乳桿菌被認為是一種益生菌，常被用來治療癲癇[21-22]。Bagheri等[23]給予癲癇大鼠益生菌干預后發(fā)現(xiàn)GABA增加，癲癇的發(fā)展程度顯著降低。菌屬與神經(jīng)疾病有關(guān)，對癲癇的發(fā)作、發(fā)展具有重要的影響[18-19]。在Lum等[24]研究中模型組大鼠中瘤胃球菌科相對豐度也顯示出升高趨勢，治療組大鼠中瘤胃球菌科相對豐度有不同程度地降低。本研究LEfSe分析結(jié)果顯示，瘤胃球菌科屬于厚壁菌門，青礞石干預后能降低癲癇大鼠瘤胃球菌科相對豐度。瘤胃球菌科與谷氨酸、谷氨酰胺呈正相關(guān)[25]，谷氨酸作為一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，對癲癇的發(fā)生具有促進作用。癲癇的發(fā)作涉及神經(jīng)元電活動的異常陣發(fā)性變化，并與興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的不平衡有關(guān)[26]。青礞石可能通過對癲癇大鼠免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生了積極的調(diào)節(jié)作用，通過降低體內(nèi)的炎癥反應或調(diào)節(jié)興奮性、抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，最終達到干預癲癇的發(fā)作、發(fā)展過程。

a-LEfSe多級物種層級樹圖 b-LDA判別分析圖

a-LEfSe multilevel species hierarchy tree diagram b-LDA discrimination

圖8 差異物種判別分析

Fig. 8 Differential species discriminant analysis

4.2 礦物元素與腸道菌群密切相關(guān)

青礞石屬于鎂類礦物藥，主要為含K、Mg、Fe、Al的硅酸鹽 [K(Mg·Fe)2(A1Si3O10)(OH,F)2]，主含Si、Fe、Mg、Al、Ca、K、Na，尚含Li、Ba、Ni、Zn、Ti、Sr、Se、Mo、Mn、Co、V、Sn等多種金屬元素[27-29]。研究表明，礦物元素與腸道菌群存在復雜的協(xié)同拮抗作用，對腸道微生態(tài)的重建有重要的影響[30-32]。研究發(fā)現(xiàn)，Wilson病患者腸道內(nèi)厚壁菌門豐度與糞便Cu濃度呈負相關(guān)，擬桿菌門豐度與糞便中Cu濃度呈正相關(guān)[30]。梭菌屬、擬桿菌屬、屬、嗜膽菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、屬、博代氏桿菌屬和屬等腸道微生物具有一定的砷抗性，F(xiàn)e可改變結(jié)腸腸道微生物結(jié)構(gòu)從而影響砷的甲基化和毒性[31]。給予仔豬含過量Fe的飼料，通過檢測其腸道菌群含量的變化，發(fā)現(xiàn)由于存在大量Fe2+仔豬腸道通透性增加，炎癥加劇，增強了細菌的易感性[32]。

4.3 癲癇與“腦-腸軸”

癲癇的發(fā)作常伴有胃腸道功能異常，如惡心、嘔吐、腹瀉等，癲癇患者腦電圖中的點纖薄與腸道蠕動波具有相關(guān)性[33-34]，這些均說明癲癇的發(fā)作、發(fā)展與胃腸道系統(tǒng)密切相關(guān)。腸道菌群不僅通過神經(jīng)系統(tǒng)，而且通過內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和代謝系統(tǒng)對大腦產(chǎn)生影響，這種腸道和大腦之間的雙向通信稱之為“腦-腸軸”[8]?！澳X-腸軸”是通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）和多種腸神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system，ENS）將大腦和腸道功能聯(lián)系起來的雙向應答系統(tǒng)。例如，腸道微生物可產(chǎn)生神經(jīng)遞質(zhì)，通過迷走神經(jīng)影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)；腸道微生物可作用于免疫系統(tǒng)，使血液中促炎細胞因子和抗炎細胞因子水平發(fā)生改變，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，改變腦功能；腸道微生物通過調(diào)節(jié)腸道內(nèi)細胞激素的分泌，如腦腸肽、瘦素等物質(zhì)直接作用于腦，實現(xiàn)腦和腸之間的信息交流[35-36]。有研究對PTZ點燃癲癇大鼠給予益生菌處理，與模型組相比，益生菌處理后的大鼠癲癇發(fā)作程度顯著下降，水迷宮結(jié)果更優(yōu)且具有顯著性，腦組織中GABA濃度顯著提升[22]。黃曉利等[37]研究癲癇兒童腸道微生物、Th17細胞水平和血清中白細胞介素-6（interleukin，IL-6）、IL-17A等含量的變化，結(jié)果顯示模型組較對照組在屬水平上菌群呈顯著差異，模型組雙歧桿菌、擬桿菌、放線菌比例顯著低于對照組，厚壁菌、變形菌比例及阪崎腸桿菌比例顯著高于對照組（＜0.05），其中阪崎腸桿菌感染可導致發(fā)育緩慢及癲癇、腦膜炎等發(fā)生，可能是引發(fā)癲癇的原因之一。與炎癥反應有關(guān)的Th17細胞、IL-6及IL-17A水平在模型組中顯著升高，而雙歧桿菌數(shù)量顯著降低，研究表明雙歧桿菌可降低Th17細胞表達和IL-17A的分泌，雙歧桿菌的減少可促進癲癇的發(fā)展。

大量研究證實，人體內(nèi)存在的“腦-腸軸”是大腦和胃腸道之間關(guān)鍵調(diào)控通路，而腸道菌群為該通路的重要參與者，腸道菌群可通過“腦-腸軸”的3條途徑（免疫、神經(jīng)內(nèi)分泌和迷走神經(jīng)）對大腦發(fā)揮作用，影響大腦發(fā)育、功能和行為。腸道微生物群的變化可影響外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導致腦功能改變，從而參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制[38-39]。青礞石中礦物元素通過對腸道菌群的影響，干預“腦-腸軸”這一關(guān)鍵調(diào)控通路，對大腦發(fā)揮作用。腸道微生物群對外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響，導致腦功能改變，參與癲癇疾病的發(fā)病機制。影響“腦-腸軸”雙向通信途徑產(chǎn)生的神經(jīng)遞質(zhì)、相關(guān)炎癥因子及Na+、K+、Ca2+等離子通道變化減緩神經(jīng)細胞去極化反應及爆發(fā)性放電可能為青礞石治療癲癇、發(fā)揮效應的關(guān)鍵因素。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effects of mineral Chinese medicineon gut microbiota in PTZ- kindled epileptic rats

YUAN Peng1, MA Yu-lu1, LIU Sheng-jin1, FANG Fang1, YANG Wen-guo1, BIAN Yong1, XU Chen-yu1, ZHANG Zhi-jie2, AO·Wuliji3, DUAN Jin-ao1

1. State Administration of Traditional Chinese Medicine Key Laboratory of Chinese Medicinal Resources Recycling Utilization, National and Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine, Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China 3. Inner Mongolia University for Nationalities, Tongliao 028000, China

To study the effect ofon the gut microbiota in pentylenetetrazol (PTZ)-kindled epileptic rats, and explore the possible mechanism ofin the treatment of epilepsy from the perspective of intestinal micro-ecological environment.Takingpowder as the research object, the rat epilepsy animal models were established by the PTZ kindling method. The experiment was divided into blank group, model group, carbamazepine group, andgroup (the high-dose group was 20 times of the clinical drug, the low-dose group was five times). After 4 weeks of treatment, the colon contents of each group of rats were taken, and the diversity of the gut microbiota of each group of rats were analyzed by 16S rRNA sequencing, and the results were analyzed in bioinformatics and statistics using UPARSE, SPSS 18.0, etc.The α-diversity analysis showed that, compared with the blank group, the Chao 1 and Ace richness index of the gut microbiota flora in the model group had no significant change; Compared with the blank group and the model group, thegroup, especially the high-dose group, had a significant impact on the richness of gut microbiota flora (＜0.05). The results of Shannon and Simpson index analysis showed that there was no significant difference between the model group and the blank group.mainly interfered with the richness of gut microbiota flora, and carbamazepine mainly interfered with the diversity of gut flora. The results showed that the hierarchical clustering of each group of β-diversity could be well separated. Some of the samples inhigh-dose group and low-dose group could not be separated obviously, and the two groups of samples could be classified into one group. The blank group and the model group could be classified into one group, and the carbamazepine group could be classified into one group. The results of 3D-PCA and 3D-PCoA analysis showed that the bacterial structure outline of each group could be obviously separated. The low-dosegroup was between the blank group and the model group, and the part of the outline of the bacterial structure diversity outline overlapped with the model group and the blank group, and tended to the blank group. The NMDS analysis results showed that the blank group, the model group and thegroup are located in one region, with thegroup overlapping with the model group and the blank group. The high-dose and low-dose ofs groups had similar intervention effects on the gut microbiota flora diversity. The composition analysis on phylum level showed that Firmicutes, Bacteroidetes, Verrucomicrobia, Proteobacteria, and Actinobacteria were the dominant bacteria in each group. Firmicutes accounted for the largest proportion, followed by Bacteroidetes. The richness ratio of Verrucomicrobia in the model group was significantly higher than that in the blank group (< 0.01), and the relative richness of Proteobacteria in the model group was the highest. Afterintervention, the richness of Verrucomicrobia decreased and the relative richness of Proteobacteria decreased in some degrees. Analysis on genus level showed that compared with the control group, the relative richness of norank_f_Muribaculaceae (< 0.05) and(< 0.01) in epileptic rats was significantly increased, andwas significantly reduced (< 0.05). The intervention ofcould reduce the relative richness ofand increase that of the. In addition, the linear discriminant analysis effect size (LEfSe) analysis showed that the Ruminococcaceae of Firmicutes was significantly enriched in the model group, and the relative richness of that was significantly reduced after the intervention of.has a significant regulatory effect on the richness and diversity structure and composition of the gut microbiota of PTZ-kindled epileptic rats, and can effectively interfere with intervene in the reconstruction of the intestinal micro-ecology.

mineral Chinese medicine;; epilepsy; pentylenetetrazol; colon; gut microbiota; brain-gut axis; mechanism of action

R285

A

0253 - 2670(2021)07 - 2011 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.07.019

2020-09-13

國家自然科學基金項目（81673566）；全國礦物藥資源普查項目（2019）；江蘇省研究生科研與實踐創(chuàng)新計劃項目（KYCX18-1608）；2017年中醫(yī)藥公共衛(wèi)生服務補助專項“全國中藥資源普查項目”（財社〔2017〕66號）

袁 鵬，碩士生，主要從事中藥鑒定、品質(zhì)評價及質(zhì)量標準研究。Tel: (025)85811511 E-mail: xiaoxihu775@163.com

劉圣金，副教授，碩士生導師，主要從事中藥鑒定、品質(zhì)評價及質(zhì)量標準研究。Tel: (025)85811511 E-mail: lsj@njucm.edu.cn

段金廒，教授，博士生導師，主要從事中藥資源化學與資源循環(huán)利用研究。Tel: (025)85811116 E-mail: dja@njucm.edu.cn

[責任編輯 潘明佳]