施旺細(xì)胞去分化在糖尿病周圍神經(jīng)病變中的作用探討

王家歡 王曉藝 勞國娟 王川 楊川 嚴(yán)勵(lì) 任萌

糖尿病周圍神經(jīng)病變是糖尿病最常見的一種并發(fā)癥，超過一半的糖尿病患者可能發(fā)生糖尿病周圍神經(jīng)病變［1］。神經(jīng)痛、麻木等癥狀嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，且糖尿病周圍神經(jīng)病變也是導(dǎo)致糖尿病足截肢率升高的主要原因［2］。髓鞘由施旺細(xì)胞包繞軸突形成，髓鞘的絕緣性可介導(dǎo)神經(jīng)沖動(dòng)準(zhǔn)確而快速的傳導(dǎo)，并且在維持軸突的生理特性如軸突運(yùn)輸和軸突直徑大小中起重要作用［3］。施旺細(xì)胞在病理情況下可以重編程即去分化，參與神經(jīng)功能的修復(fù)再生及病理過程［4］。KROX20是髓鞘蛋白的主要調(diào)控因子，KROX20的敲除可引起極速的脫髓鞘及施旺細(xì)胞去分化。C?JUN及其磷酸化分子是施旺細(xì)胞成髓分化的負(fù)向調(diào)節(jié)因子，可拮抗KROX20 的作用，使施旺細(xì)胞去分化。信號(hào)通路p38 MAPK 及β?catenin 在髓鞘發(fā)生及神經(jīng)修復(fù)等過程發(fā)揮不同的作用，但在糖尿病周圍神經(jīng)施旺細(xì)胞去分化的作用尚不明確。本文旨在觀察糖尿病周圍神經(jīng)病變的病理改變，探討施旺細(xì)胞去分化在糖尿病周圍神經(jīng)病變發(fā)生中的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 （1）動(dòng)物：5 周SD 大鼠8 只，體重約130 g，購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。（2）主要試劑：KROX20 購自Abcam 公司，C?JUN 購自武漢賽維爾生物科技有限公司，p?c?JUN，p38 MAPK，p?p38 MAPK 購 自Cell Signaling Technology 公 司，免 疫 組化試劑盒購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 方法 （1）糖尿病大鼠模型的建立：SPF 級(jí)，5周齡雄性SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分成正常組和糖尿病組，每組4 只。糖尿病組行STZ 65 mg/kg 腹腔注射，1 周后測隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L認(rèn)為造模成功。糖尿病模型建立后第8 周，在用戊巴比妥鈉（45 mg/kg）腹腔注射麻醉滿意后，收取坐骨神經(jīng)。（2）坐骨神經(jīng)電鏡觀察：坐骨神經(jīng)用電鏡固定液固定，1%鋨酸后固定。行環(huán)氧樹脂包埋，用Leica UC7 超薄切皮機(jī)制作60-80 nm 的超薄切片，于2%醋酸鈾飽和酒精溶液避光染色，6%枸櫞酸鉛溶液避二氧化碳染色。透射電子顯微鏡HT7800/HT7700 下觀察，采集圖像分析。每個(gè)組織選取5?8 個(gè)視野，用Image J 軟件進(jìn)行分析。Gra?tio=軸突直徑/纖維直徑。（3）免疫組化：坐骨神經(jīng)用4%多聚甲醛固定后，行石蠟包埋，切片后常規(guī)脫蠟，按相關(guān)免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行KROX20的標(biāo)記。用IRS 評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行分析，IRS= P×I，P 為染色陽性率：P=0，陰性；P=1，1%?24% 陽性率；P=2，25%?49%陽性率；P=3，50%?74% 陽性率；and P=4，75%?100% 陽性率。I 為染色強(qiáng)度：I=0，陰性；I=1，弱陽性；I=2，陽性；I=3，強(qiáng)陽性。（4）Western blot 檢測蛋白含量：用放射免疫沉淀法提取坐骨神經(jīng)組織蛋白，電泳前按4∶1 體積比與上樣緩沖液混合熱變性，約取10 μg 蛋白上樣于10%聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，封閉1 h，4℃過夜孵育特異性一抗，后與HRP 標(biāo)記的特異性二抗，室溫孵育1 h，ECL 試劑處理曝光。用Image J 軟件分析條帶光密度。以內(nèi)參β?actin 計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù)。計(jì)量數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組獨(dú)立組均值間采用t 檢驗(yàn)，多組均值間采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 糖尿病大鼠的周圍神經(jīng)病變髓鞘的病理改變 電鏡結(jié)果顯示，糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)的髓鞘出現(xiàn)明顯的病變。圖1A 示糖尿病大鼠神經(jīng)髓鞘出現(xiàn)明顯的腫脹和松解，可見髓鞘脫失，軸突萎縮變性多見于髓鞘損傷嚴(yán)重的纖維。糖尿病大鼠神經(jīng)髓鞘的G ratio 明顯比正常大鼠大，且在軸突直徑小的神經(jīng)纖維中更明顯，說明糖尿病大鼠的小纖維更薄，提示髓鞘的再生現(xiàn)象（圖1B）；糖尿病大鼠的神經(jīng)纖維面積明顯小于正常組大鼠，且髓鞘面積的比值下降（圖1C）。以上結(jié)果提示，糖尿病周圍神經(jīng)病變以髓鞘病變?yōu)橹鳌?/p>

1.2 糖尿病神經(jīng)病變存在施旺細(xì)胞去分化 糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)分化相關(guān)蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示，髓鞘蛋白調(diào)控因子KROX20 在糖尿病神經(jīng)明顯下調(diào)。同時(shí)，施旺細(xì)胞重編程的主要調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，p?C?JUN 在糖尿病神經(jīng)中明顯上調(diào)（圖2），提示糖尿病狀態(tài)下，施旺細(xì)胞出現(xiàn)去分化。

1.3 糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)相關(guān)通路的變化 糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)中β?catenin 明顯上調(diào)，wnt 通路的激活；而磷酸化的p38 MAPK 在糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)中明顯下調(diào)，詳見圖3。

3 討 論

3.1 糖尿病大鼠周圍神經(jīng)病變的主要病理改變 本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠周圍神經(jīng)病變的病理改變主要是髓鞘腫脹、脫失，髓鞘變薄減少及軸突變性，伴有輕度的髓鞘再生，與人體標(biāo)本的病理改變相符。也驗(yàn)證了在糖尿病周圍神經(jīng)病變的過程中，施旺細(xì)胞出現(xiàn)了去分化現(xiàn)象。髓鞘病變是神經(jīng)傳導(dǎo)速度減弱，麻木等臨床癥狀的主要原因之一［5］。在糖尿病患者神經(jīng)病變癥狀輕微時(shí)的神經(jīng)標(biāo)本發(fā)現(xiàn)明顯的脫髓鞘，但軸突病變不明顯，也有研究認(rèn)為1 型糖尿病模型軸突病變更為突出，可能與模型建立的時(shí)間及方法不同有關(guān)［6］。

圖1 糖尿病周圍神經(jīng)病變的髓鞘病理改變 A：大鼠坐骨神經(jīng)髓鞘電鏡圖（標(biāo)尺=20 μm）；B：神經(jīng)髓鞘G Ratio 分析；C：大鼠坐骨神經(jīng)纖維面積及髓鞘面積分析。*P＜0.05，***P＜0.001

圖2 糖尿病狀態(tài)下，施旺細(xì)胞發(fā)生去分化 A：Western blot 檢測大鼠坐骨神經(jīng)中KROX20，C-JUN 及p-C-JUN 的蛋白表達(dá)水平。B：免疫組化檢測大鼠坐骨神經(jīng)中KROX20 的表達(dá)（放大倍數(shù)：200×）。*P＜0.05，**P＜0.01

圖3 糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)通路改變 Western blot 檢測大鼠坐骨神經(jīng)β-catenin，p38 MAPK 及其磷酸化蛋白的表達(dá)水平。*P＜0.05

3.2 糖尿病周圍神經(jīng)病變的髓鞘病變與施旺細(xì)胞去分化之間的關(guān)系 尚不明確。施旺細(xì)胞的去分化主要表現(xiàn)在其成髓能力的下調(diào)。KROX20 是促進(jìn)髓鞘形成及維持髓鞘結(jié)構(gòu)的重要轉(zhuǎn)錄因子［7］，其表達(dá)下調(diào)提示施旺細(xì)胞的成髓能力下降和髓鞘結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定。磷酸化的C?JUN 通過拮抗KROX20 的作用，抑制髓鞘蛋白的生成，誘導(dǎo)施旺細(xì)胞的去分化。在神經(jīng)病變早期，神經(jīng)脫髓鞘及施旺細(xì)胞去分化現(xiàn)象并存，提示施旺細(xì)胞去分化與脫髓鞘關(guān)系密切［8，9］。在多項(xiàng)脫髓鞘疾病模型研究中發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)外抑制施旺細(xì)胞去分化可改善脫髓鞘的發(fā)生［10］。高糖可以直接導(dǎo)致施旺細(xì)胞去分化，藥物干預(yù)后施旺細(xì)胞去分化被逆轉(zhuǎn)，脫髓鞘現(xiàn)象有所改善［11］，提示施旺細(xì)胞去分化可能導(dǎo)致脫髓鞘。此外，神經(jīng)損傷修復(fù)過程中，施旺細(xì)胞去分化導(dǎo)致的脫髓鞘屬于正常生理過程［12］，但在糖尿病狀態(tài)下，神經(jīng)功能修復(fù)發(fā)生障礙，施旺細(xì)胞異常去分化，可能是糖尿病周圍神經(jīng)病理性脫髓鞘的原因之一。

3.3 糖尿病周圍神經(jīng)病變的信號(hào)通路變化 本研究結(jié)果顯示β?catenin 在糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)中呈激活狀態(tài)，β?catenin 信號(hào)通路是神經(jīng)系統(tǒng)十分重要的通路。β?catenin 信號(hào)通路的激活可通過炎癥反應(yīng)引起脫髓鞘并抑制髓鞘再生［13］。抑制β?catenin信號(hào)通路可通過減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及炎癥因子改善糖尿病周圍神經(jīng)病變［14］。因此，β?catenin 通路的激活可能直接引起糖尿病髓鞘病變。促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）在施旺細(xì)胞的去分化中起重要作用，p38 MAPK 是神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘形成的正向調(diào)控因子［22］。p38 MAPK 可通過調(diào)控KROX20 的表達(dá)影響施旺細(xì)胞的成髓能力［23］。本研究結(jié)果顯示，糖尿病大鼠p?p38 MAPK 及KROX20 表達(dá)明顯減少，提示糖尿病狀態(tài)下p38 MAPK 的活性下降引起KROX20 的表達(dá)下調(diào)而介導(dǎo)施旺細(xì)胞的去分化及脫髓鞘。因此，wnt 通路的激活及p38 MAPK 通路的抑制共同作用引起糖尿病周圍神經(jīng)病變。

綜上所述，本研究通過建立糖尿病大鼠模型，闡述了糖尿病周圍神經(jīng)病變早期以髓鞘腫脹脫失為主，施旺細(xì)胞發(fā)生去分化。其病理機(jī)制可能與β?catenin 及p38 MAPK 通路的改變相關(guān)，為糖尿病周圍神經(jīng)病變的機(jī)制探討及臨床診治提供新思路。