L-天冬氨酸的提取工藝優(yōu)化

徐 慧，崔 穎，王珊珊，田延軍，朱坤福，祝 蕾，賀強(qiáng)之，姜國(guó)政，韓延雷，黃艷紅，劉建軍*

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院），山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，山東濟(jì)南 250013；2.煙臺(tái)恒源生物股份有限公司，山東煙臺(tái) 265709；3.山東朱氏藥業(yè)集團(tuán)有限公司，山東菏澤 274300）

L-天冬氨酸（L-aspartic acid，L-Asp）又名α-氨基丁二酸，是一種重要的酸性氨基酸[1]，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域。在食品工業(yè)方面，L-天冬氨酸是多種食品的營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑，還用于合成甜味劑阿斯巴甜[2]；在醫(yī)藥方面，其可用作肝功能促進(jìn)劑、氨解毒劑和疲勞恢復(fù)劑等[3-5]，且還是合成L-丙氨酸的主要原料和多種醫(yī)藥中間體[6]；在化工方面，其可用于合成高分子材料聚天冬氨酸[7]。

L-天冬氨酸可以通過(guò)傳統(tǒng)發(fā)酵法、固定化酶或固定化細(xì)胞法和游離整體細(xì)胞法進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。其中，游離整體細(xì)胞法是目前主要的工業(yè)生產(chǎn)方法，即利用產(chǎn)生L-天冬氨酸酶的菌種將富馬酸與氨直接轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-天冬氨酸。1974年，日本田邊制藥公司利用反丁烯二酸發(fā)酵技術(shù)率先實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)[8-9]。我國(guó)在20世紀(jì)80年代中后期開(kāi)始研制和開(kāi)發(fā)L-天冬氨酸，首先以物理或化學(xué)方法將酶制劑包埋或吸附在固相中催化富馬酸和氨進(jìn)行連續(xù)生產(chǎn)[10]，由于固定化后酶的穩(wěn)定性降低，故在此基礎(chǔ)上研發(fā)了固定化細(xì)胞法。徐禮生等[11]以反丁烯二酸和氨水為底物，采用天冬氨酸酶基因工程菌固定化細(xì)胞生物催化法合成L-天冬氨酸，產(chǎn)率達(dá)到96.7%。固定化法生產(chǎn)L-天冬氨酸存在工藝設(shè)備投入多、技術(shù)要求高、操作復(fù)雜等問(wèn)題，進(jìn)一步技術(shù)改進(jìn)幾乎不可能。1996年，徐虹等[12]以大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC11303培養(yǎng)液作酶源，采用游離酶法由富馬酸轉(zhuǎn)氨生成L-天冬氨酸。取培養(yǎng)26 h左右的培養(yǎng)液，37 ℃酶反應(yīng)6 d，可轉(zhuǎn)化富馬酸9 kg/L。2000年，王雪根等[13]游離整體細(xì)胞法生產(chǎn)L-天冬氨酸，轉(zhuǎn)化率平均在99%以上。隨后很多研究者從篩選高產(chǎn)天冬氨酸酶菌株[14]、天冬氨酸酶改造[15]、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件[16-18]等方面對(duì)此生產(chǎn)工藝進(jìn)行優(yōu)化，以提高L-天冬氨酸合成效率。

游離整體細(xì)胞法生產(chǎn)L-天冬氨酸的工藝路線成熟，生產(chǎn)效率高，但L-天冬氨酸轉(zhuǎn)化液中含有菌體、色素等雜質(zhì)，需用活性炭對(duì)其進(jìn)行凈化處理。另外，L-天冬氨酸的提取是用硫酸將pH 8.5左右的酶轉(zhuǎn)化液調(diào)至其等電點(diǎn)2.8，結(jié)晶沉淀后，再經(jīng)過(guò)濾、干燥得到成品[19]。L-天冬氨酸在等電點(diǎn)附近迅速結(jié)出，會(huì)包結(jié)部分母液，使產(chǎn)品質(zhì)量受到影響。為此，本研究對(duì)L-天冬氨酸提取工藝過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化，旨在為實(shí)現(xiàn)高光學(xué)純度及醫(yī)藥級(jí)等高端產(chǎn)品的規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

大腸桿菌HY-05C：煙臺(tái)恒源生物股份有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：玉米漿干粉3 g/L，酵母粉3 g/L，蛋白胨1 g/L，氯化鈉5 g/L，硫酸錳0.05 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0～7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基：富馬酸10 g/L，玉米漿干粉8 g/L，酵母粉2 g/L，蛋白胨7 g/L，氯化鈉5 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，用氨水調(diào)節(jié)pH值至6.0。

1.1.3 試劑

767型活性炭：安徽大別山活性炭有限公司；富馬酸（分析純）：煙臺(tái)恒源生物股份有限公司；玉米漿干粉（生化試劑）：山東康源生物科技有限公司；酵母粉、蛋白胨（均為生化試劑）：安琪酵母股份有限公司；氨水（分析純）：武漢制氨廠；L-天冬氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：美國(guó)Sigma公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 底物溶液

富馬酸200 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，氨水調(diào)節(jié)pH值至9.0，45 ℃，備用。

1.2 儀器與設(shè)備

XNP-9052BS-III生化培養(yǎng)箱：上海馨朗電子科技有限公司；SPH恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；722型分光光度計(jì)：上海天普分析儀器有限公司；PY-P10 pH計(jì)、BSA124S-CW電子分析天平：德國(guó)賽多利斯集團(tuán)；U3000高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：戴安（中國(guó)）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液的制備

取一環(huán)活化后斜面菌體接入500 mL（裝液量50 mL）搖瓶中，200 r/min、35～37 ℃培養(yǎng)8 h，得到一級(jí)培養(yǎng)液；將一級(jí)種子液按1%（V/V）接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，200 r/min培養(yǎng)10 h，得到二級(jí)培養(yǎng)液。

1.3.2 酶法轉(zhuǎn)化反應(yīng)

大腸桿菌培養(yǎng)液與底物溶液按1∶7（V/V）混合搖勻，于45 ℃進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，利用高錳酸鉀滴定法[20]測(cè)定富馬酸濃度，待底物溶液中的富馬酸濃度降至0.2%以下，結(jié)束反應(yīng)。

1.3.3L-天冬氨酸提取工藝流程

1.3.4 脫色條件確定

（1）脫色溫度的選擇：在1 L轉(zhuǎn)化液中加入0.10%活性炭，設(shè)置脫色溫度30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃，脫色時(shí)間1 h條件下過(guò)濾，波長(zhǎng)640 nm條件下測(cè)定透光率，考察溫度對(duì)脫色效果的影響。

（2）活性炭用量的選擇：在1 L轉(zhuǎn)化液中，設(shè)置活性炭用量0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%，脫色溫度60 ℃，脫色時(shí)間1 h條件下過(guò)濾，波長(zhǎng)640 nm條件下測(cè)定透光率，考察活性炭用量對(duì)脫色效果的影響。

1.3.5 硫酸酸化工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

取600 mL濾液，加入60 mL硫酸，分別設(shè)置結(jié)晶溫度75℃、80℃、85℃、90℃、95℃，硫酸滴加速度10mL/h、20mL/h、30 mL/h、40 mL/h、50 mL/h，冷卻時(shí)間5 min、10 min、15 min、20 min、25 min，考察其對(duì)L-天冬氨酸含量的影響。

1.3.6 硫酸酸化工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以結(jié)晶溫度（A）、硫酸滴加速度（B）、冷卻時(shí)間（C）進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以L-天冬氨酸含量（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行提取工藝的優(yōu)化。試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments desigh

1.3.7 測(cè)定方法

透光率測(cè)定：分光光度法，純水作參比，10 mm光程，波長(zhǎng)640 nm。

L-天冬氨酸含量測(cè)定：高效液相色譜法，SinoChrom ODS-BP C18（5 μm×4.6 mm×250 mm）分析柱；流動(dòng)相為0.03 mol/L KH2PO4-H3PO4緩沖液（pH2.5）；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；流速0.8 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫色條件的確定

2.1.1 溫度對(duì)脫色的影響

溫度對(duì)脫色效果的影響見(jiàn)圖1。由圖1可知，在溫度為30～60℃時(shí)，轉(zhuǎn)化濾液透光率隨溫度的升高呈快速上升趨勢(shì)；當(dāng)溫度為60 ℃時(shí)，透光率最高，達(dá)到96.4%；在溫度高于60 ℃之后，透光率逐漸降低。因此，選擇最適脫色溫度為60 ℃。

圖1 溫度對(duì)脫色的影響Fig.1 Effect of temperature on decolorization

2.1.2 活性炭用量對(duì)脫色的影響

活性炭用量對(duì)脫色效果的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知，隨著活性炭用量在0.05%～0.15%范圍內(nèi)增加，轉(zhuǎn)化液濾液透光率隨之逐漸增大，當(dāng)活性炭用量為0.15%時(shí)，透光率達(dá)到最大值，為99.6%；當(dāng)活性炭用量＞0.15%之后，透光率不再有明顯增加。且考慮到活性炭用量過(guò)大，一方面增加成本，另一方面其會(huì)吸附部分氨基酸，從而影響產(chǎn)品收率，因此，選擇活性炭用量為0.15%。

圖2 活性炭用量對(duì)脫色的影響Fig.2 Effect of active carbon addition on decolorization

2.2 硫酸酸化工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.2.1 結(jié)晶溫度對(duì)L-天冬氨酸含量的影響

結(jié)晶溫度對(duì)L-天冬氨酸含量的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨著結(jié)晶溫度在75～90 ℃范圍內(nèi)的上升，L-天冬氨酸含量不斷增加；當(dāng)結(jié)晶溫度為90 ℃時(shí)，L-天冬氨酸含量達(dá)到最大值，為94.51%；當(dāng)結(jié)晶溫度高于90 ℃之后，L-天冬氨酸含量下降。因此，選擇最適結(jié)晶溫度為90 ℃。

圖3 結(jié)晶溫度對(duì)L-天冬氨酸含量的影響Fig.3 Effect of crystallization temperature on L-aspartic acid content

2.2.2 硫酸滴加速度對(duì)L-天冬氨酸含量的影響

硫酸滴加速度對(duì)L-天冬氨酸含量的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，在硫酸滴加速度為10～20 mL/h時(shí)，L-天冬氨酸含量隨硫酸滴加速度增加呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)；當(dāng)硫酸滴加速度為20 mL/h時(shí)，L-天冬氨酸含量達(dá)到最大值，為95.3%；當(dāng)硫酸滴加速度＞20 mL/h之后，L-天冬氨酸含量逐漸降低。因此，選擇最適硫酸滴加速度為20 mL/h。

圖4 硫酸滴加速度對(duì)L-天冬氨酸含量的影響Fig.4 Effect of dropping rate of sulfuric acid on L-aspartic acid content

2.2.3 冷卻時(shí)間對(duì)L-天冬氨酸含量的影響

圖5 冷卻時(shí)間對(duì)L-天冬氨酸含量的影響Fig.5 Effect of cooling time on L-aspartic acid content

冷卻時(shí)間對(duì)L-天冬氨酸含量的影響見(jiàn)圖5。由圖5可知，在冷卻時(shí)間為5～10 min時(shí)，隨著冷卻時(shí)間增加，L-天冬氨酸含量增加；當(dāng)冷卻時(shí)間為10 min時(shí)，L-天冬氨酸含量達(dá)到最大值，為96.15%；冷卻時(shí)間＞10 min之后，L-天冬氨酸含量逐漸降低。因此，選擇最適冷卻時(shí)間為10 min。

2.3 硫酸酸化工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以L-天冬氨酸含量（Y）為響應(yīng)值，選取結(jié)晶溫度（A）、硫酸滴加速度（B）、冷卻時(shí)間（C）進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

利用軟件Design-Expert 8.0.6對(duì)表2中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到回歸方程為：

由表3可知，該模型極顯著（P＜0.01），決定系數(shù)R2為0.950 9，失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說(shuō)明試驗(yàn)誤差小且擬合度較高，可以應(yīng)用于試驗(yàn)的分析預(yù)測(cè)。影響L-天冬氨酸含量的因素順序?yàn)槔鋮s時(shí)間＞硫酸滴加速度＞結(jié)晶溫度，其中各因素中一次項(xiàng)C、二次項(xiàng)C2對(duì)結(jié)果影響均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），一次項(xiàng)B、二次項(xiàng)B2對(duì)結(jié)果影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。

響應(yīng)面及等高線圖能夠直觀地反映出各因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響程度，曲面越陡，等高線越密集，對(duì)相應(yīng)值影響越顯著[21]。根據(jù)回歸方程得到結(jié)晶溫度、硫酸滴加速度和冷卻時(shí)間之間的交互作用對(duì)L-天冬氨酸含量影響的響應(yīng)面及等高線見(jiàn)圖6。

圖6 各因素交互作用對(duì)L-天冬氨酸含量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction among various factors on L-aspartic acid content

由圖6可知，各交互因素的最佳作用點(diǎn)基本都落在試驗(yàn)范圍內(nèi)，經(jīng)過(guò)軟件分析得到最佳提取工藝條件為結(jié)晶溫度90.76 ℃，硫酸滴加速度23.19 mL/h，冷卻時(shí)間12.48 min。在此優(yōu)化條件下L-天冬氨酸含量預(yù)測(cè)值為98.60%。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

考慮到實(shí)際需要對(duì)上述工藝條件進(jìn)行調(diào)整，即結(jié)晶溫度91 ℃，硫酸滴加速度23 mL/h，冷卻時(shí)間12 min。在此條件下進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，測(cè)得L-天冬氨酸含量實(shí)際值為98.22%，與預(yù)測(cè)值接近，表明采用響應(yīng)面優(yōu)化方法得到的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

以大腸桿菌發(fā)酵液為原料，采用硫酸萃取法提取L-天冬氨酸。利用單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化確定了最適脫色條件為脫色溫度60 ℃，活性炭添加量0.15%；最佳酸化工藝條件為結(jié)晶溫度91 ℃，硫酸的滴加速度23 mL/h，冷卻時(shí)間12 min，在此工藝條件下L-天冬氨酸含量為98.22%，較優(yōu)化前提高了7.42%。