QuEChERS結(jié)合氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定地參中63種農(nóng)藥殘留

黃小蘭，周祥德，何旭峰，楊 勤，周 濃 *，易良鍵，鄭 容

（1.重慶市萬州食品藥品檢驗(yàn)所，重慶 404100；2.重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院三峽庫區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實(shí)驗(yàn)室，重慶 404100；3.重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校中醫(yī)學(xué)院，重慶 404100）

地參為唇形科地筍屬植物硬毛地筍（Lycopus lucidusvar.hirtusRegel）的干燥根莖，其性平味甘，有化瘀止血、益氣利水之功效[1]，是我國名貴的中草藥，曾收載于2009版《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[2]，晚秋以后采挖出飽滿脆嫩的根莖可作蔬菜食用，其營養(yǎng)豐富、味道鮮美，享有“蔬菜珍品”之美譽(yù)，是一種傳統(tǒng)的藥食兼用佳品[3]。目前關(guān)于地參的研究主要集中在其營養(yǎng)和藥用價(jià)值上[4-7]，而對(duì)其安全指標(biāo)的研究鮮見報(bào)道。

近年來，外源性有害物質(zhì)污染問題受到社會(huì)的廣泛關(guān)注，中藥材、食品中農(nóng)藥殘留超標(biāo)問題日益凸顯[8]。農(nóng)藥殘留超標(biāo)不僅危害人體健康，還損害中藥材的聲譽(yù)，嚴(yán)重制約了中藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。由于環(huán)境、水土的污染[9]，化學(xué)農(nóng)藥的亂用濫用等問題，使得植物中害蟲、病菌抗藥性增強(qiáng)[10]，故在種植過程中不得不加強(qiáng)各種化學(xué)防治手段的力度，從而造成了農(nóng)藥殘留。因此對(duì)地參進(jìn)行農(nóng)藥殘留等安全性控制顯得十分必要。

大部分農(nóng)藥化合物具有能氣化、熱穩(wěn)定性好和沸點(diǎn)較低等特點(diǎn)，適用于氣相色譜法[11-12]進(jìn)行測(cè)定，但氣相色譜儀檢測(cè)器單一無法滿足同時(shí)測(cè)定不同種類的農(nóng)藥化合物，且定性效果較差。氣相色譜-質(zhì)譜法具有定性準(zhǔn)確、靈敏度高和通量高等優(yōu)點(diǎn)[13-16]，目前廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)產(chǎn)品和中藥材等植物源性樣品中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。近幾年興起的農(nóng)藥殘留檢測(cè)前處理方法QuEChERs是一種應(yīng)用在農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)方面的快速樣品前處理技術(shù)，具有快速、簡便、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)[15-16]。本研究利用QuEChERS前處理技術(shù)結(jié)合氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法（gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry，GC-MS/MS）同時(shí)快速測(cè)定地參（Lycopus lucidus）中63種農(nóng)藥殘留量。通過本研究，可以了解不同產(chǎn)地地參農(nóng)藥殘留水平以及常用農(nóng)藥品種，以期為地參安全指標(biāo)的制定提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對(duì)規(guī)范地參的種植管理、生產(chǎn)加工以及監(jiān)督提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

63種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品溶液（1 000 μg/mL）、環(huán)氧七氯B（100 μg/mL）：中國計(jì)量研究院；乙酸乙酯、乙腈（農(nóng)殘級(jí)）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；QuEChERs萃取鹽包（6 g無水硫酸鎂、1.5 g乙酸鈉）、QuEChERs凈化管（1 200 mg硫酸鎂、400mgN-丙基乙二胺（primarysecondaryamine，PSA）及200 mg石墨化炭黑（graphitized carbon black，GCB））：美國Agilent公司；試驗(yàn)用水為超純水。

地參自采或委托采集于我國地參主要栽培基地，經(jīng)重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院周濃教授鑒定為唇形科地筍屬植物硬毛地筍（Lycopus lucidusvar.hirtusRegel）的干燥根莖。樣品預(yù)處理方法參照湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)[2]，將地參洗凈泥沙，晾干水分，置于恒溫干燥箱45 ℃烘干至恒質(zhì)量，將其粉碎過35目篩，備用。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ8000EVO型三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀（配TraceFinder定性定量軟件）：美國賽默飛世爾科技有限公司；Milli-Q Advantage A10型超純水機(jī)：美國Millipore公司；Sigma4-16S型高速離心機(jī)：德國Sigma公司；ML204型萬分之一分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 氣相色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱為賽默飛石英毛細(xì)管柱TG-5MS（30 m×0.25 mm×0.25μm）；升溫程序：初始溫度40℃，保持1.5 min；以25 ℃/min升溫至90 ℃，保持1.5 min；然后以25 ℃/min升溫至180 ℃，保持1.5 min；再以5 ℃/min升溫至280 ℃，不保持；最后以10 ℃/min升溫至300 ℃，保持5 min。載氣：高純氦氣（He）（純度≥99.999%）；流速1.2 mL/min；進(jìn)樣口溫度270 ℃，脈沖不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量1 μL；離子源：電子電離（electron ionization，EI）源；離子源溫度300 ℃；傳輸線溫度300 ℃；掃描方式：選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（selected reaction monitoring，SRM）；各農(nóng)藥化合物的質(zhì)譜參數(shù)詳見表1。

表1 各農(nóng)藥化合物及內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間、監(jiān)測(cè)離子對(duì)和碰撞能量Table 1 Retention time,monitoring ion pairs and collision energy of each pesticide compound

續(xù)表

1.3.2 樣品溶液制備

參照GB 23200.113—2018《植物源性食品中208種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測(cè)定》[17]進(jìn)行樣品前處理，即稱取混合均勻的地參粉末2 g（精確至0.000 1 g），置于50 mL塑料離心管中，加水5 mL潤濕30 min，加入15.0 mL 1%醋酸-乙腈溶液，渦旋10 min，冷凍30 min，加入QuEChERs萃取鹽包和2顆陶瓷均質(zhì)子，蓋上蓋子，劇烈振蕩1 min后4 000 r/min離心5 min。準(zhǔn)確吸取8.0 mL上清液加入QuEChERs凈化管中，渦旋混勻1 min，4 000 r/min離心5 min，準(zhǔn)確吸取3.0 mL上清液于10 mL氮吹管中，40 ℃水浴氮吹至近干。加入20 μL內(nèi)標(biāo)溶液，加入1.0 mL乙酸乙酯復(fù)溶，過0.22 μm微孔濾膜，待測(cè)。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

稱取樣品（空白基質(zhì)），按照“1.3.2”項(xiàng)下處理步驟除不添加內(nèi)標(biāo)溶液外同法制備空白基質(zhì)溶液。

精密量取內(nèi)標(biāo)物質(zhì)環(huán)氧七氯B（質(zhì)量濃度為100 μg/mL）1.0 mL，置于20 mL容量瓶中，用乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，制得質(zhì)量濃度為5.0 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

精密量取各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品溶液100 μL置于10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度制得質(zhì)量濃度為10 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。然后用乙酸乙酯進(jìn)行逐級(jí)稀釋制得質(zhì)量濃度分別為5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、250 ng/mL、500ng/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液?？瞻谆|(zhì)溶液氮?dú)獯蹈?，分別加入1.0 mL系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液復(fù)溶，加入20 μL內(nèi)標(biāo)溶液，混勻，配制成系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，上機(jī)前，過0.22 μm微孔濾膜。按照“1.3.1”的儀器條件測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量，以各農(nóng)藥化合物與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度比（X）為橫坐標(biāo)，農(nóng)藥化合物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。

1.3.4 精密度及回收率試驗(yàn)

取“1.3.3”項(xiàng)下同一混合標(biāo)準(zhǔn)工作液按照“1.3.1”的儀器條件平行測(cè)定6次，計(jì)算各農(nóng)藥化合物峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）得儀器精密度結(jié)果。稱取空白基質(zhì)地參粉末2 g（精確至0.000 1 g），按0.05 mg/kg、0.25 mg/kg、0.75 mg/kg低中高3個(gè)水平添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平平行3份進(jìn)行測(cè)定，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算回收率。

1.3.5 檢出限和定量限

參照文獻(xiàn)[18]的方法，取0.05 mg/kg加標(biāo)水平的樣品進(jìn)行分析，測(cè)定信噪比，通過計(jì)算，以信噪比為3時(shí)的濃度作為檢出限（limit of detection，LOD），信噪比為10時(shí)的濃度作為定量限（limit of quantitation，LOQ）。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)藥指標(biāo)的選擇

63種農(nóng)藥的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 63種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液GC分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ions chromatogram of 63 kinds of pesticide mixed standard solutions ahalyzed by GC

農(nóng)藥殘留超標(biāo)的現(xiàn)象主要是人為因素引起的，種植戶缺乏相關(guān)知識(shí)或者存在逐利心理，導(dǎo)致農(nóng)藥的濫用。本文參考了GB 2763—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[19]和《中國藥典》[20]里的農(nóng)藥檢測(cè)指標(biāo)，結(jié)合此類植物的常見病蟲害，選擇了其中63種農(nóng)藥進(jìn)行測(cè)定，包括有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類，涵蓋禁用、限用和常用農(nóng)藥，覆蓋面廣、種類齊全。

2.2 基質(zhì)效應(yīng)的消除

基質(zhì)效應(yīng)是質(zhì)譜分析方法中常見的干擾因素，分為增強(qiáng)和抑制2種作用[21]。預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，地參基質(zhì)對(duì)大部分農(nóng)藥具有增強(qiáng)效果，一般消除的方法有添加保護(hù)劑和空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法。由于本試驗(yàn)采用QuEChERs前處理方法，操作簡單，空白基質(zhì)方便易得，故通過空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法很好地補(bǔ)償了基質(zhì)效應(yīng)。

2.3 各農(nóng)藥化合物的線性關(guān)系、檢出限及定量限

各農(nóng)藥化合物的保留時(shí)間、回歸方程、相關(guān)系數(shù)（R2）、檢出限和定量限見表2。結(jié)果顯示各化合物在5～500 ng/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)（R2）為0.996 4～0.999 9，表明所用方法線性良好，符合分析要求，檢出限為0.5～3.6 μg/kg，定量限為1.7～12.0 μg/kg。

表2 63種農(nóng)藥化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限和儀器精密度Table 2 Regression equation,determination coefficient,limit of detection,limit of quantitation and instrument precision of 63 kinds of pesticides

續(xù)表

2.4 儀器精密度試驗(yàn)及加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，各農(nóng)藥化合物精密度試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.93%～5.06%，表明儀器精密度滿足試驗(yàn)需求。各農(nóng)藥化合的平均回收率為71.5%～120.4%，回收率試驗(yàn)結(jié)果RSD為0.12%～9.70%，符合農(nóng)藥殘留分析要求。

表3 63種農(nóng)藥化合物的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Recovery rates and relative standard deviation of 63 kinds of pesticides

續(xù)表

2.5 地參樣品中農(nóng)藥殘留結(jié)果

利用建立的方法對(duì)10個(gè)產(chǎn)地的地參進(jìn)行農(nóng)藥殘留測(cè)定，結(jié)果見表4。由表4可知，所有樣品均不同程度檢出了農(nóng)藥，主要包括氯菊酯、丙環(huán)唑、氯唑磷、苯霜靈和肟菌酯。其中氯菊酯和丙環(huán)唑的檢出率最高，均為60%，含量范圍分別為0.014～0.170 mg/kg、0.068～0.160 mg/kg；氯唑磷檢出率為20%，含量范圍為0.020～0.022 mg/kg；苯霜靈檢出率為20%，含量范圍為0.015～0.017 mg/kg；肟菌酯檢出率為30%，含量范圍為0.013～0.020 mg/kg。結(jié)合歐盟農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)和GB 2763—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[17]的相關(guān)規(guī)定，擬定氯菊酯、丙環(huán)唑、氯唑磷、苯霜靈和肟菌酯的限量值分別為1 mg/kg、0.1 mg/kg、0.01 mg/kg、0.02 mg/kg和0.2 mg/kg，結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品S6（山東菏澤）、S7（江蘇鹽城）中丙環(huán)唑和氯唑磷均出現(xiàn)超標(biāo)現(xiàn)象，其他均在限量范圍內(nèi)。

表4 地參樣品中農(nóng)藥的測(cè)定結(jié)果Table 4 Determination results of pesticides in Lycopus lucidus samples

3 結(jié)論

采用QuEChERS前處理技術(shù)結(jié)合氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）對(duì)不同產(chǎn)地的10批地參中的63種農(nóng)藥殘留進(jìn)行測(cè)定。63種農(nóng)藥在5～500 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均＞0.996 4；在0.05 mg/kg、0.25 mg/kg和0.75 mg/kg 3個(gè)添加水平下，各農(nóng)藥化合物加樣回收率為71.5%～120.4%，方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.12%～9.70%；儀器精密度RSD為1.93%～5.06%；檢出限（LOD）為0.5～3.6 μg/kg，定量限（LOQ）為1.7～12.0 μg/kg。10個(gè)產(chǎn)地的地參樣品在63種農(nóng)藥的檢測(cè)篩選中，不同產(chǎn)地地參均不同程度檢出5種農(nóng)藥殘留，包括氯菊酯、丙環(huán)唑、氯唑磷、苯霜靈和肟菌酯，且有2個(gè)產(chǎn)地出現(xiàn)了超標(biāo)現(xiàn)象，故在地參的規(guī)范化種植過程中，應(yīng)引導(dǎo)種植戶選擇正確的農(nóng)藥進(jìn)行合理噴灑，以保證地參的品質(zhì)及安全。此外，對(duì)地參開展農(nóng)藥殘留等安全指標(biāo)的檢測(cè)分析，不僅可為地參安全評(píng)價(jià)指標(biāo)的制定提供參考，同時(shí)在地參的規(guī)范化栽培過程中，應(yīng)對(duì)農(nóng)藥殘留進(jìn)行監(jiān)控，提高地參質(zhì)量及食用安全性。