復(fù)合微生物的篩選及其發(fā)酵秸稈的應(yīng)用效果

曾佳佳，陳 靜，陳 振，黨士坤，徐海燕，谷 巍，曹 斌

（山東寶來利來生物工程股份有限公司山東省動物微生態(tài)制劑重點實驗室，山東泰安 271000）

我國農(nóng)作物秸稈的產(chǎn)量高，利用率低，焚燒和堆放在田間地頭會造成巨大的資源浪費和環(huán)境污染。秸稈主要含有纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)及灰分物質(zhì)，前三種的含量占80%以上，纖維素類物質(zhì)在自然狀態(tài)下降解率不高，往往降低了秸稈的再利用水平[1-2]。

目前秸稈的綜合利用有多種途徑。秸稈能源化會產(chǎn)生二次污染并且總利用率低。直接還田的降解周期長，還會增加來年耕作難度；作為動物飼料，由于其纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的含量高，蛋白含量低，適口性差，使得秸稈的消化率低和營養(yǎng)價值低，有效提高消化率和營養(yǎng)價值可以改善秸稈的再利用價值[4]；堆漚還田是利用微生物將大部分有機質(zhì)轉(zhuǎn)化為腐殖質(zhì)，使秸稈中的氮磷鉀等被轉(zhuǎn)化為可利用的狀態(tài)再應(yīng)用于土壤中[5]。

微生物發(fā)酵秸稈可以降低其纖維素、木質(zhì)素含量，并提高蛋白含量，提高秸稈飼料的營養(yǎng)價值和利用率。微生物的生長和繁殖會分泌大量酸類、酶類，酶類可以將秸稈中的木聚糖鏈和木質(zhì)素聚合物酯鏈進行酶解[6-8]，酸類可以軟化秸稈[9]。發(fā)酵過程中有益微生物的繁殖還會抑制其他有害細菌的生長。自然環(huán)境中秸稈降解緩慢，纖維素酶活力低限制著纖維素的降解，制約著秸稈的再利用，在秸稈中加入微生物有助于加快秸稈的降解[10-11]。本研究為了提高秸稈的發(fā)酵效果，通過測定復(fù)合微生物發(fā)酵秸稈過程中的酶活，篩選出纖維素酶活和木聚糖酶活力高的復(fù)合微生物，將其應(yīng)用于秸稈發(fā)酵，測定秸稈成分（粗纖維、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、木質(zhì)素、粗蛋白）的變化，為復(fù)合微生物應(yīng)用于秸稈發(fā)酵提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

供試菌株黑曲酶（Aspergillus niger）0002、黑曲酶（Aspergillus niger）0007、黑曲酶（Aspergillus niger）0011、米曲酶（Aspergillus oryzae）0008、白腐菌（white rot fungi）0126、芽孢桿菌（Bacillus）0136和放線菌（Actinomyces）0057等：山東寶來利來生物工程股份有限公司菌種保藏中心保存；玉米秸稈、小麥秸稈：泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)院的種植基地。

1.1.2 化學(xué)試劑

硫酸（分析純）：天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉、硫酸亞鐵、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉（均為分析純）：天津凱通化學(xué)試劑有限公司；酒石酸鉀鈉（分析純）：天津北辰方正試劑廠；木糖、葡萄糖（均為分析純）：天津大茂化學(xué)試劑廠；3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）：上海中秦化學(xué)試劑有限公司；無水亞硫酸鈉、羧甲基纖維素鈉（carboxymethy cellulose-Na，CMC-Na）（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；木聚糖（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；醋酸、醋酸鈉（均為分析純）：青島捷世康生物科技有限公司；硫酸鎂（分析純）：濟南匯豐達化工有限公司；蛋白胨（生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；酵母膏（生化試劑）：天津市英博生化試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

黑曲霉和米曲霉培養(yǎng)基：稱量麩皮30 g，加入20 mL水，121 ℃滅菌30 min。

芽孢桿菌培養(yǎng)基：葡萄糖0.2%，蛋白胨1.0%，氯化鈉0.5%，酵母膏0.5%，pH調(diào)至7.0，121 ℃滅菌30 min。

放線菌培養(yǎng)基：可溶性淀粉2%，硝酸鉀0.1%，磷酸氫二鉀0.05%，硫酸鎂0.05%，氯化鈉0.05%，硫酸亞鐵0.001%，pH調(diào)至7.2～7.4，121 ℃滅菌30 min。

白腐菌培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g/L，葡萄糖20 g/L，121 ℃滅菌30 min。

剛果紅纖維素鑒別培養(yǎng)基：CMC-Na 10 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g，NaCl 1.5 g，剛果紅0.2 g，水1 L，121 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9082數(shù)顯恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱：常州諾基儀器有限公司；KDN-103F自動定氮儀、HYP308消化爐：上海纖檢儀器有限公司；LD5-2A低速離心機：北京京立離心機有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；722E型可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；YXQ-LS-50S11壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；pHS-3C型pH計：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的培養(yǎng)及其篩選

分別用接種環(huán)取黑曲酶、米曲霉、芽孢桿菌、白腐菌、放線菌斜面于裝有對應(yīng)培養(yǎng)基的三角瓶中，芽孢桿菌于37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h。黑曲酶和米曲霉于30 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)72 h。白腐菌和放線菌于30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)72 h。

將制備的菌液滴到剛果紅培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)菌落至周圍出現(xiàn)透明圈后，用0.02%剛果紅溶液染色20 min，1 mol/L氯化鈉溶液脫色20 min后計算透明圈直徑D、菌落直徑d。根據(jù)透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）的比值（H=D/d）來初步判斷該待測菌株降解纖維素的能力，H值越大表明該待測菌株降解纖維素的能力越強，初篩H值大的菌株。

1.3.2 復(fù)合菌株的篩選及發(fā)酵玉米秸稈

在初篩菌株的基礎(chǔ)上，將發(fā)酵菌株組合分別設(shè)計為：①白腐菌0126+黑曲酶（0007、0011、0002）[1∶1（0.33∶0.33∶0.33）]；②白腐菌0126+米曲霉0008（1∶1）；③白腐菌0126+黑曲霉（0007、0011、0002）+米曲霉0008[1∶1（0.33∶0.33∶0.33）∶1]；④白腐菌0126+黑曲霉（0007、0011、0002）+米曲霉0008+芽孢桿菌0136+放線菌0057[1∶1（0.33∶0.33∶0.33）∶1∶1∶1]。

將玉米秸稈剪碎至3～5 cm長度，加入培養(yǎng)基（秸稈∶麩皮=7∶3，（NH4）2SO41%，KH2PO40.2%，料水比1∶4（g∶mL））后在密封袋中充分混勻，于121 ℃滅菌30 min，冷卻后分別按照接菌量1%接入4種組合的菌，于30 ℃條件下發(fā)酵，保持通風(fēng)，根據(jù)腐化程度于第15天時結(jié)束發(fā)酵。同時設(shè)置自然發(fā)酵對照組（不接菌）。發(fā)酵不同的時間（1d、3d、6d、9d、12d、15 d）進行取樣測定纖維素酶活、木聚糖酶活。木聚糖酶是半纖維素復(fù)合酶的主要成分，木聚糖酶活越高則半纖維素酶活越高，因此，可以用木聚糖酶活來反映半纖維素酶活的情況。

1.3.3 復(fù)合菌株發(fā)酵田間大堆小麥秸稈

在田間用小麥秸稈堆成圓錐形堆體，堆體高度約1.2 m，直徑約2.0 m，每個堆體約50 kg干秸稈。堆體的底部、表面都用塑料布鋪蓋。秸稈中加入玉米面6.1%，尿素1%，料水比1∶1（g∶mL），按照1%的接菌量分別接入白腐菌、黑曲霉、米曲霉、芽孢桿菌和放線菌（1∶1∶1∶1∶1）。每天記錄堆體的溫度，分別在發(fā)酵第5、10、15、20天時翻堆補水（以手握時指縫有水但不下滴為宜）。觀察堆體的形貌變化，定期取樣測定pH、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、木質(zhì)素、粗纖維和粗蛋白，發(fā)酵38 d時外觀腐化程度良好，即可結(jié)束發(fā)酵。

1.3.4 粗酶液的制備

取發(fā)酵秸稈樣品3 g，加30 mL蒸餾水，在室溫下浸提4 h后用4層紗布過濾，于轉(zhuǎn)速為3 500 r/min條件下離心10 min，上清液即為粗酶液，置于4 ℃冰箱備用。

1.3.5 分析檢測

（1）纖維素酶活測定

纖維素酶酶活采用羧甲基纖維素糖化力法[12]。纖維素酶酶活定義：在40 ℃、pH 4.6的條件下，1 min水解羧甲基纖維素產(chǎn)生1.0 μg葡萄糖的酶量定義為1個酶活單位（U/g）。

（2）木聚糖酶活測定

木聚糖酶酶活測定參考國標(biāo)GB/T 23874—2009《飼料添加劑木聚糖酶活力的測定分光光度法》。木聚糖酶酶活定義：在37 ℃、pH 5.5的條件下，每分鐘從質(zhì)量濃度為5 mg/mL的木聚糖溶液中降解釋放1 mol還原糖所需要的酶量為1個酶活力單位（U/g）。

（3）組分及pH值測定

粗纖維含量：參照國標(biāo)GB/T 6434—2006《飼料中粗纖維的含量測定過濾法》；中性洗滌纖維含量：參照國標(biāo)GB/T 20806—2006《飼料中中性洗滌纖維（NDF）的測定》；酸性洗滌纖維含量：參照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準NY/T 1459—2007《飼料中酸性洗滌纖維的測定》；木質(zhì)素含量：參照國標(biāo)GB/T 20805—2006《飼料中酸性洗滌木質(zhì)素（ADL）的測定》；粗蛋白含量：參照國標(biāo)GB/T 6432—1994《飼料中粗蛋白測定方法》；pH的測定：采用玻璃電極pHS-3C型pH計。

1.3.6 統(tǒng)計分析

使用Excel 2007軟件對原始數(shù)據(jù)進行處理，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件（One-Way ANOVA）進行顯著性分析，并采用最小顯著差異（least significant difference，LSD）法進行多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準誤差表示，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素分解能力菌株的篩選

通過剛果紅纖維素鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)后，只有纖維素分解菌周圍才會形成透明圈。本實驗對本公司菌種庫中的7株菌進行篩選，結(jié)果見表1。由表1可知，7株菌均能觀察到透明圈，可以產(chǎn)降解纖維素酶，能夠用于降解秸稈的試驗。

表1 不同菌株的透明圈直徑D與菌落直徑d的比值HTable 1 Ratio value H of transparent ring diameter D to colony diameter d of different strains

2.2 不同組合復(fù)合株菌發(fā)酵玉米秸稈的纖維素酶活和木聚糖酶活

纖維素酶可以將纖維素分解成寡糖或單糖。木聚糖是植物中半纖維素的重要組成部分，在植物細胞壁中的含量僅次于纖維素。木聚糖酶能夠降解木聚糖生成木寡糖、木糖等低聚木糖混合物及葡萄糖等[13]，這兩種酶活力越高，越有利于降解秸稈中的纖維素和半纖維素。木聚糖酶和纖維素酶可以通過物理或化學(xué)作用直接或間接使秸稈的纖維結(jié)構(gòu)得到膨脹甚至破壞[14]。

圖1 不同菌株組合發(fā)酵玉米秸稈的纖維素酶活（A）及木聚糖酶活（B）Fig.1 Cellulase (A) and xylanase (B) activities of corn straw fermented by different combinations of strains

由圖1A可知，添加復(fù)合菌株的試驗組在發(fā)酵秸稈1～9 d時，各組纖維素酶酶活隨時間增加呈持續(xù)升高趨勢，第9天后開始下降。①組的纖維素酶酶活在發(fā)酵第9天時最高，為194.73 U/g。②組的纖維素酶酶活在發(fā)酵第9天時最高，為159.80 U/g。③組的纖維素酶酶活在發(fā)酵第3天時最高，為155.92 U/g。④組的纖維素酶酶活在發(fā)酵第9天時最高，為203.64 U/g。自然發(fā)酵對照組纖維素酶酶活在第6天時，酶活最高，為102.47 U/g。試驗組的纖維素酶活均顯著高于對照組（P＜0.05）。結(jié)果表明，④組（白腐菌+黑曲霉+米曲霉+芽孢+放線菌）的纖維素酶活最佳（203.64 U/g）。

由圖1B可知，試驗組不同的復(fù)合菌株在發(fā)酵1～9 d時，各組木聚糖酶酶活隨時間增加呈先升高后下降趨勢。①組的木聚糖酶酶活在發(fā)酵第6天時最高，為9 021.33 U/g。②組的木聚糖酶酶活在發(fā)酵第6天時最高，為8 376.55 U/g。③組的木聚糖酶酶活在發(fā)酵第9天時最高，為9 503.88 U/g。④組的木聚糖酶酶活在發(fā)酵第6、9天時最高，為100 17.41 U/g。對照組在第9天時木聚糖酶活最高，為1 189.43 U/g。試驗組的木聚糖酶活均顯著高于對照組（P＜0.05）。結(jié)果表明，④組（白腐菌+黑曲霉+米曲霉+芽孢+放線菌）的木聚糖酶活最佳（100 17.41 U/g）。

綜上所述，白腐菌+黑曲霉+米曲霉+芽孢+放線菌菌株組合可以應(yīng)用于秸稈發(fā)酵。

2.3 田間大堆發(fā)酵小麥秸稈的情況

溫度為堆肥過程中微生物生命活動的重要參數(shù)，也是判斷發(fā)酵產(chǎn)品能否達到無害化條件的重要指標(biāo)之一，發(fā)酵初期微生物的繁殖等大量活動釋放熱量，使溫度上升。高溫發(fā)酵過程能殺死其中的病菌、蟲卵和雜草種子，部分嗜溫菌受到抑制甚至死亡，需要及時降溫[15]，各溫度階段的微生物群和酶系存在著差異。白腐菌+黑曲霉+米曲霉+芽孢+放線菌菌株組合應(yīng)用于小麥秸稈田間大堆發(fā)酵，發(fā)酵過程中溫度的變化見圖2，pH值變化見表2，組分變化見表3，外觀變化見圖3。

圖2 小麥秸稈發(fā)酵過程中溫度的變化Fig.2 Changes of temperature during wheat straw fermentation

由圖2可知，本次發(fā)酵過程中溫度有高溫期、中溫期和低溫期。試驗組從第3天開始迅速升溫，第4天升至60 ℃以上，第5天溫度有所下降。整個發(fā)酵過程中，溫度超過60 ℃以上的時間有4 d，超過50～60 ℃的時間有6 d，40～50 ℃的時間有8 d?；旧系?4天開始，溫度都低于40 ℃。對照組從第3天開始迅速升溫，第3天升至50 ℃以上，第4天溫度有所下降。整個發(fā)酵過程中，溫度超過50 ℃以上的時間有1 d，40～50 ℃的時間有10 d。第21天開始，溫度都低于40 ℃。在第5、10、15、20天時進行翻堆補水，試驗組和對照組每翻堆一次溫度有小幅度升高。

本研究中采用翻堆來改善通風(fēng)狀況，每次翻堆后溫度都有小幅度升高，有助于提高秸稈的發(fā)酵腐熟。李春燕等[16]研究發(fā)現(xiàn)，翻堆可延長好氧發(fā)酵高溫期。在高溫期進行翻堆2～3次，能夠更有效促進可揮發(fā)性固體的降解，提高秸稈腐殖化程度。

表2 小麥秸稈發(fā)酵過程中pH值的變化Table 2 Changes of pH during wheat straw fermentation

由表2可知，小麥秸稈堆肥初始pH值為9.33，發(fā)酵22 d后pH略微降低，仍為堿性，至發(fā)酵38 d時pH為微堿性?？赡苁怯捎诎l(fā)酵過程中微生物的繁殖和代謝產(chǎn)物產(chǎn)生了少量酸性物質(zhì)，使pH有所下降。發(fā)酵結(jié)束秸稈pH為微堿性，符合腐熟堆肥的pH為7.5～8.5[17-18]。王瓊瑤等[19]研究了不同腐熟劑對水稻秸稈的腐熟效果，發(fā)現(xiàn)強微堆肥快速腐熟劑處理后，在42 d時腐熟液pH值達7.5，與本研究結(jié)果一致。

表3 小麥秸稈發(fā)酵過程中組分變化Table 3 Changes of compositions during wheat straw fermentation

由表3可知，對照組和試驗組的小麥秸稈的中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、木質(zhì)素、粗纖維隨著發(fā)酵時間的增加而逐漸降低，粗蛋白逐漸升高。

對照組發(fā)酵38 d的小麥秸稈，中性洗滌纖維、粗纖維比發(fā)酵前秸稈顯著降低（P＜0.05），粗蛋白顯著升高（P＜0.05）。

試驗組發(fā)酵38 d的小麥秸稈，中性洗滌纖維比發(fā)酵前顯著降低21.53%（P＜0.05），粗纖維顯著降低17.31%（P＜0.05），粗蛋白顯著升高95.52%（P＜0.05）。試驗組發(fā)酵38 d的秸稈中酸性洗滌纖維和木質(zhì)素與未發(fā)酵時無顯著性差異（P＞0.05），酸性洗滌纖維降低7.4%，木質(zhì)素降低7.16%。

試驗組發(fā)酵38 d的小麥秸稈的中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、木質(zhì)素、粗纖維分別比對照組發(fā)酵38 d的小麥秸稈降低了11.36%、6.29%、3.63%、6.95%，粗蛋白顯著升高了48.23%（P＜0.05）。

目前發(fā)現(xiàn)能夠降解小麥秸稈的微生物主要有細菌、真菌和放線菌，它們能夠降解纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，還會影響蛋白質(zhì)的含量[20-21]。喬君毅等[22]利用黑曲霉3.3148菌株發(fā)酵玉米秸稈，粗蛋白含量提高了11.26%，粗纖維、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量分別下降了24.45%、45.24%、37.04%；黑曲霉產(chǎn)生的羧甲基纖維素酶活力為29.94 IU/g。

由圖3可知，添加復(fù)合微生物的發(fā)酵秸稈比自然發(fā)酵對照組外觀腐化程度高?？赡芪⑸锇l(fā)酵改變了秸稈內(nèi)部的分子結(jié)構(gòu)和表觀形態(tài)。趙方圓等[23]篩選了纖維素高效降解菌曲霉YN1，并進行了降解濾紙、秸稈和稻殼的微觀形態(tài)上的觀察，對照組的稻殼表面光滑有排列整齊的突起，接菌發(fā)酵后稻殼表面呈現(xiàn)瓦解潰爛狀。秸稈原來是光滑的表面，發(fā)酵后菌絲定殖于秸稈的纖維表面，破壞了秸稈原有的光滑表面。

圖3 小麥秸稈發(fā)酵38 d的外觀Fig.3 Appearance of wheat straw fermentation for 38 d

3 結(jié)論

本研究篩選出復(fù)合菌株：白腐菌+黑曲霉+米曲霉+芽孢桿菌+放線菌（1∶1∶1∶1∶1），該復(fù)合菌株產(chǎn)纖維素酶活和木聚糖酶活較高，分別可達203.64 U/g、10 017.41 U/g。添加該復(fù)合菌株發(fā)酵秸稈，顯著降低了中性洗滌纖維、粗纖維水平（P＜0.05），顯著提高了粗蛋白水平（P＜0.05），該復(fù)合菌株可以用于秸稈發(fā)酵該復(fù)合菌有助于提高秸稈發(fā)酵效果，為秸稈的再利用提供了一種處理方法，具有廣泛的應(yīng)用前景。