梔子豉湯固體發(fā)酵菌質(zhì)的制備及主要成分含量變化

陳麗艷，邢 怡，宓月光，孫國(guó)東，孫銀玲，曹 陽(yáng)，馮麗娜，王偉明*

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150036）

梔子豉湯為張仲景的經(jīng)典名方，由梔子和淡豆豉兩味藥食同源中藥配伍而成，為清宣胸中郁熱，治療虛煩懊惱不得眠之良方[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，梔子豉湯具有抗抑郁作用，環(huán)烯醚萜類成分為其主要藥效物質(zhì)，其中梔子苷含量最高[2-3]。藥代動(dòng)力學(xué)和腸吸收代謝動(dòng)力學(xué)研究表明，梔子苷生物利用度低，口服需經(jīng)腸道微生物及腸壁酶將其代謝為京尼平而被吸收利用[4-5]。然而京尼平不穩(wěn)定，在一定條件下可與多種氨基酸結(jié)合生成穩(wěn)定的梔子藍(lán)[6]，且梔子藍(lán)較梔子苷和京尼平肝毒性更低[7]。崔元璐等[8]研究推測(cè)，梔子豉湯采用“先煎梔子再加淡豆豉煎煮”的方法是由于梔子豉湯在煎煮過(guò)程中存在：梔子苷京尼平（不穩(wěn)定）京尼平-氨基酸復(fù)合物（梔子藍(lán)）的轉(zhuǎn)化過(guò)程，其中京尼平-酪氨酸復(fù)合物已被證實(shí)其抗抑郁作用優(yōu)于梔子苷和京尼平[9-10]。淡豆豉為特殊的發(fā)酵類中藥飲片，含有一定數(shù)量的枯草芽孢桿菌等益生菌，具有調(diào)節(jié)腸道菌群作用[11]，在梔子豉湯煎煮過(guò)程中，由于高溫煎煮會(huì)殺滅一部分有益微生物并降低酶的活性，不能充分實(shí)現(xiàn)梔子苷的生物轉(zhuǎn)化，且京尼平與氨基酸的結(jié)合屬于靜態(tài)恒定過(guò)程。

本研究在梔子豉湯原方基礎(chǔ)上，采用雙向固體發(fā)酵技術(shù)，以梔子、青蒿、桑葉水煎液浸泡黑豆作為發(fā)酵基質(zhì)，以枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和傘枝犁頭霉（Fusariumumbellatum）復(fù)合菌作為發(fā)酵菌株制備梔子豉，通過(guò)發(fā)酵菌株及發(fā)酵時(shí)間的考察，以梔子苷的轉(zhuǎn)化率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在體外實(shí)現(xiàn)梔子苷的降解及京尼平-氨基酸復(fù)合物的動(dòng)態(tài)積累過(guò)程，為提高梔子豉湯藥效及新產(chǎn)品開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 藥材和菌株

青蒿和桑葉（批號(hào)170101）：河北祁新中藥顆粒飲片有限公司；黑豆（批號(hào)20170503）：北京本草方源藥業(yè)集團(tuán)有限公司；梔子（批號(hào)171001）：亳州市張仲景中藥飲片有限責(zé)任公司。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）DDC-SP1、傘枝梨頭霉（Absidia corymbifera）DDC-SP11、米根霉（Rhizopus oryzae）DDC-SP14：均從市售淡豆豉飲片中分離，經(jīng)中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心鑒定（報(bào)告編號(hào)分別為17-066-161-169，17-276-852-1123和17-066-163-171），三株菌經(jīng)篩選具有較高的蛋白酶和β-葡萄糖苷酶活性。

1.1.2 化學(xué)試劑

梔子苷對(duì)照品（批號(hào)Z-003-170222）（純度＞98%）、京尼平對(duì)照品（批號(hào)J-028-161216）（純度＞98%）：成都瑞芬思生物科技有限公司；17種氨基酸水解標(biāo)樣混合液：天冬氨酸（Asp）、絲氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg）、蘇氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）、胱氨酸（Cys）、酪氨酸（Tyr）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、賴氨酸（Lys）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）；AccQ·Fluor衍生劑（硼酸緩沖液、衍生劑粉末、衍生劑稀釋液、三水乙酸鈉-磷酸鈉洗脫液）：美國(guó)Waters公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉粉3.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，瓊脂15.0 g/L，加熱溶解于1 000 mL蒸餾水中。121 ℃高壓滅菌15 min。

營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基：稱取蛋白胨10.0 g/L，牛肉浸粉3.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，加熱溶解于1 000 mL蒸餾水中。121 ℃高壓滅菌15 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯浸粉6.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，瓊脂20.0 g/L，加熱溶解于1 000 mL蒸餾水中。115 ℃高壓滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基：馬鈴薯浸粉6.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，加熱溶解于1 000 mL蒸餾水中。115 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters Alliance 2489高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國(guó)Waters公司；DHP9272恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV/VIS Lambda 365紫外-可見分光光度計(jì)：美國(guó)PE公司；BSA224S電子天平：德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；HNY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器：天津歐諾儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；DH6-907385-III電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 梔子豉湯各藥味配伍劑量的換算

《傷寒論》記載梔子豉湯由“梔子十四個(gè)（掰），香豉四合（綿裹）”配伍而成。依據(jù)東漢時(shí)期度量衡的計(jì)量方法，換算為現(xiàn)代的梔子15 g、淡豆豉50 g[12]。《中國(guó)藥典》淡豆豉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定每1 kg大豆用青蒿、桑葉分別為70～100 g[13]。因此，本研究梔子豉湯制備中梔子∶青蒿∶桑葉∶黑豆質(zhì)量比為15∶5∶5∶50。

1.3.2 發(fā)酵基質(zhì)的制備

按照1.3.1的比例稱取梔子（打碎）、桑葉、青蒿加10倍水煎煮2次，每次1 h，過(guò)濾，合并濾液并濃縮至100 mL，拌入洗凈的黑豆中（黑豆與藥液的比例為1∶0.8（g∶mL））浸泡12～16 h，待藥液吸盡，于121 ℃高壓滅菌30 min，即得。

1.3.3 菌液的制備、接種及培養(yǎng)

分別利用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）DDC-SP1、傘枝梨頭霉（Absidia corymbifera）DDC-SP11、米根霉（Rhizopus oryzae）DDC-SP14三株菌采用單菌和雙菌發(fā)酵，發(fā)酵樣品編號(hào)及采用的發(fā)酵菌株分別為1號(hào)：菌株DDC-SP1；2號(hào)：菌株DDC-SP11；3號(hào)：菌株DDC-SP14；4號(hào)：菌株DDC-SP1和DDC-SP11（1∶1，V/V）；5號(hào)：菌株DDC-SP1和DDC-SP14（1∶1，V/V）；6號(hào)：菌株DDC-SP11和DDC-SP14（1∶1，V/V）。按照細(xì)菌和霉菌的常規(guī)培養(yǎng)溫度，本研究采用單菌細(xì)菌（即菌株DDC-SP1）發(fā)酵溫度37 ℃，霉菌和復(fù)合菌發(fā)酵溫度為28 ℃。將菌株DDC-SP1接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯中于37 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)18～24 h，得到枯草芽孢桿菌DDC-SP1菌液（108～109CFU/mL）；菌株DDC-SP11和DDC-SP14分別接種至馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液中，于28 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)3～5 d，分別制成孢子菌懸液（105～106孢子/mL）。將1.3.2的發(fā)酵基質(zhì)接種上述菌液，單菌發(fā)酵樣品接菌量為2 mL/100 g，雙菌發(fā)酵樣品每種菌液接菌量為1 mL/100 g，混勻，除1號(hào)樣品于37 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)外，其余5組均于28 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)，分別于不同發(fā)酵時(shí)間取樣，60 ℃干燥。

1.3.4 樣品中梔子苷和京尼平的含量測(cè)定

采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定梔子苷、京尼平和氨基酸的含量。

供試品溶液制備：分別取發(fā)酵0、1 d、3 d、7 d、10 d、15 d的干燥樣品，粉碎成細(xì)粉（80目），精密稱取粉末3.0 g，置具塞錐形瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為50%甲醇50 mL，稱質(zhì)量，搖勻，超聲40 min，放冷后再次稱定質(zhì)量，用體積分?jǐn)?shù)為50%甲醇補(bǔ)足質(zhì)量損失，以3 000 r/min離心20 min，精密吸取上清液10 mL加體積分?jǐn)?shù)為50%甲醇定容至50 mL，搖勻，0.45 μm濾膜過(guò)濾備用。

對(duì)照品溶液的配制：精密稱取梔子苷和京尼平對(duì)照品，分別加體積分?jǐn)?shù)為50%甲醇制成400 μg/mL的對(duì)照品溶液，用體積分?jǐn)?shù)為50%甲醇進(jìn)行系列稀釋，0.45 μm濾膜過(guò)濾。

HPLC色譜條件：參照李翔等[14]的方法，Symmetry C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為0.5%冰醋酸；流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，進(jìn)樣量10 μL，柱溫40 ℃；梯度洗脫程序設(shè)置以流動(dòng)相A計(jì)：0～2 min，10%；3～8min，22%；9～13min，30%；14～40min，60%；41～42min，30%；43～50 min，10%。

1.3.5 樣品溶液吸光度值測(cè)定

京尼平可與多種氨基酸形成復(fù)合物產(chǎn)生藍(lán)色或黃色色素，但聚合度不一，分子質(zhì)量相差很大，一般以色價(jià)或者吸光度值衡量其品質(zhì)[15]。分別精密稱取不同發(fā)酵時(shí)間梔子豉樣品干燥粉末1 g，加蒸餾水100 mL搖勻，超聲提取20 min，靜置過(guò)濾，取濾液，以6 000 r/min離心15 min，取上清液，于波長(zhǎng)590 nm處測(cè)定吸光度值。

1.3.6 樣品游離氨基酸含量測(cè)定

采用高效液相色譜-熒光檢測(cè)器法（high performance liquid chromatography-fluorescence detector，HPLC-FLD）測(cè)定游離氨基酸的含量。

在確定7 d為最佳發(fā)酵時(shí)間的前提下考察游離氨基酸的含量變化，分別于發(fā)酵0、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、120 h、168h取樣，60℃干燥，粉碎。參照宓月光等[16]游離氨基酸含量測(cè)定方法，分別精密稱取各樣品粉末200 mg，加入0.1 mol/mL的鹽酸10mL，混勻，超聲提取40min，8 000 r/min離心20 min，取上清液過(guò)0.45 μm濾膜，進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 梔子豉發(fā)酵過(guò)程中梔子苷和京尼平的含量變化

對(duì)照品梔子苷（A）、京尼平（B）及梔子豉樣品（C）的高效液相色譜見圖1。由圖1可知，梔子苷在24～390 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為Y=6 962.804 4X+35 420.657 1，相關(guān)系數(shù)R為0.997 4；京尼平在22～355 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為Y=110.56X+32 838，相關(guān)系數(shù)R為0.998 2，梔子苷和京尼平色譜峰均達(dá)到了基線分離。

各組樣品發(fā)酵過(guò)程中梔子苷含量變化結(jié)果見圖2。由圖2可知，發(fā)酵第1天，2號(hào)、3號(hào)和6號(hào)樣品梔子苷含量略有上升，其他各組稍有下降，第3天開始各組樣品梔子苷含量均隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸下降，2號(hào)和4號(hào)樣品均在7 d降為0，4號(hào)樣品在3 d降解最快，1號(hào)、3號(hào)和5號(hào)樣品于發(fā)酵15 d梔子苷完全轉(zhuǎn)化，6號(hào)轉(zhuǎn)化最慢。由于2號(hào)、3號(hào)和6號(hào)的發(fā)酵菌均為霉菌，第1天生長(zhǎng)處于遲緩期，因此梔子苷未發(fā)生降解，28 ℃恒溫1 d可能利于梔子苷的溶出而呈小幅上升趨勢(shì)，而其他各組均有1號(hào)枯草芽孢桿菌，由于細(xì)菌生長(zhǎng)較快，酶活逐漸提高而使梔子苷含量下降；3～7 d霉菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，各組梔子苷在微生物酶的作用下快速降解。結(jié)果表明，采用菌株DDC-SP1和DDC-SP11復(fù)合菌發(fā)酵7 d梔子苷轉(zhuǎn)化最快。

圖1 梔子苷（A）、京尼平（B）及梔子豉樣品（C）高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatography of geniposide (A),genipin (B) and Zhizichi sample (C)

圖2 各組樣品發(fā)酵過(guò)程中梔子苷含量變化Fig.2 Changes of gardenoside contents in each group of samples during fermentation

各組樣品發(fā)酵過(guò)程中京尼平含量變化結(jié)果見圖3。由圖3可知，1號(hào)、2號(hào)和4號(hào)樣品京尼平含量均在7 d降為0，推測(cè)此時(shí)段京尼平與氨基酸可能完全形成復(fù)合物，在發(fā)酵3 d京尼平降解速率1號(hào)＞4號(hào)＞2號(hào)；3號(hào)樣品發(fā)酵15 d京尼平轉(zhuǎn)化完全，而6號(hào)樣品京尼平轉(zhuǎn)化最慢，15 d仍含有0.14 mg/g。除1號(hào)樣品外，其他各組樣品京尼平含量呈先下降后小幅升高再下降的趨勢(shì)，可能與各發(fā)酵菌酶系的構(gòu)成及活力相關(guān)，除1號(hào)為單一枯草芽孢桿菌發(fā)酵外，其他各組的發(fā)酵菌均含有霉菌，發(fā)酵1～3 d霉菌生長(zhǎng)處于遲緩期。發(fā)酵第1天，由于梔子苷較少量轉(zhuǎn)化為京尼平，梔子中原有的京尼平與大豆中的氨基酸結(jié)合生成梔子藍(lán)而使京尼平含量下降，在1～3 d又有小幅升高，此階段細(xì)菌正處于生長(zhǎng)繁殖的活躍期，梔子苷轉(zhuǎn)化速度高于京尼平與氨基酸結(jié)合的速度，使京尼平產(chǎn)生積累，發(fā)酵3 d后隨著梔子苷和大豆蛋白的逐漸降解，生成的京尼平動(dòng)態(tài)與多種氨基酸結(jié)合生成梔子藍(lán)復(fù)合物，導(dǎo)致京尼平含量迅速下降。結(jié)果表明，采用菌株DDC-SP1與DDC-SP11復(fù)合菌發(fā)酵可促進(jìn)梔子苷降解為京尼平且于發(fā)酵7 d完全轉(zhuǎn)化。

圖3 各組樣品發(fā)酵過(guò)程中京尼平含量變化Fig.3 Changes of genipin contents in each group of samples during fermentation

綜上，2號(hào)和4號(hào)樣品均在7 d梔子苷和京尼平含量降為0，一方面表明梔子苷完全降解，另一方面表明京尼平完全與氨基酸形成復(fù)合物，而4號(hào)在第3天兩種成分轉(zhuǎn)化速率更快。4號(hào)是采用菌株DDC-SP1與DDC-SP11復(fù)合菌發(fā)酵制備梔子豉，可發(fā)揮多種酶協(xié)同作用促進(jìn)梔子苷的轉(zhuǎn)化及京尼平-氨基酸的結(jié)合。

2.2 不同發(fā)酵時(shí)間梔子豉水溶液吸光度值變化

各組樣品發(fā)酵過(guò)程中吸光度值（OD590nm值）變化結(jié)果見表1。

表1 各組樣品發(fā)酵過(guò)程中OD590nm值變化Table1 Changes of OD590nmvalue of each group of samples during fermentation

由表1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，各組樣品溶液的吸光度值未呈規(guī)律性變化，但4號(hào)樣品發(fā)酵7 d吸光度值最大為0.575，表明其產(chǎn)生的梔子藍(lán)色價(jià)最高。由于各組發(fā)酵菌的酶系及活性不同，對(duì)梔子苷和大豆蛋白的轉(zhuǎn)化能力存在差異，每組樣品中京尼平與不同氨基酸生成梔子藍(lán)復(fù)合物的組成及含量也不一樣。徐尤智等[15]研究表明，賴氨酸、甘氨酸、谷氨酸和丙氨酸與京尼平反應(yīng)呈色較深，而天冬氨酸、蘇氨酸和酪氨酸呈色較淺，脯氨酸幾乎不顯色，因此梔子豉水溶液OD590nm值不呈規(guī)律變化。結(jié)果表明，采用菌株DDC-SP1與DDC-SP11復(fù)合菌發(fā)酵7 d生成梔子藍(lán)的色價(jià)最高。

2.3 梔子豉最佳發(fā)酵工藝

梔子豉最佳發(fā)酵工藝為梔子（打碎）15 g、青蒿5 g、桑葉5 g，加10倍量水煎煮2次，每次1 h，合并濾液，濾液濃縮至100 mL，拌入凈黑豆（黑豆與藥液的料液比為1.0∶0.8（g∶mL））浸泡12～16 h，待黑豆將藥液吸盡，裝袋，121 ℃高壓滅菌30 min，稍涼，分別接種菌株DDC-SP1菌液（108～109CFU/mL）和菌株DDC-SP11菌液（105～106孢子數(shù)/mL）各1 mL/100 g，搖勻，于28 ℃培養(yǎng)168 h（7 d），60 ℃干燥，即得梔子豉。

2.4 梔子豉發(fā)酵過(guò)程中游離氨基酸的含量變化

在確定梔子豉最佳工藝的基礎(chǔ)上，考察發(fā)酵7 d內(nèi)樣品游離氨基酸的含量變化氨基酸混合標(biāo)樣及樣品的HPLC-FLD色譜圖見圖4，各組樣品氨基酸含量測(cè)定結(jié)果見表2。

圖4 氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品及梔子豉樣品的HPLC-FLD色譜圖Fig.4 HPLC-FLD chromatogram of mixed amino acid standards and Zhizichi samples

由圖4可知，17種氨基酸衍生物均達(dá)到基線分離，分離良好。由表2可知，氨基酸含量于發(fā)酵24～72 h變化明顯，72 h后趨于平穩(wěn)。發(fā)酵基質(zhì)（0 h）中精氨酸（Arg）含量最高為3.16 mg/g，絲氨酸（Ser）和脯氨酸（Pro）次之，分別為0.81 mg/g和0.73 mg/g，其他氨基酸含量在0～0.3 mg/g（所有樣品中均未出現(xiàn)胱氨酸色譜峰）。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品中不同氨基酸含量變化趨勢(shì)不一致，168 h精氨酸（Arg）含量下降了94.9%，絲氨酸（Ser）和天冬氨酸（Asp）含量分別下降了71.6%和52.0%，而脯氨酸（Pro）含量升高了3.4倍，組氨酸（His）和谷氨酸（Glu）含量均升高1.5倍，其余氨基酸含量未發(fā)生明顯變化。梔子豉發(fā)酵過(guò)程中出現(xiàn)了幾種氨基酸含量上升或下降的現(xiàn)象，其中精氨酸含量下降幅度最大，可能京尼平與精氨酸結(jié)合較多[18-20]，另外，梔子豉發(fā)酵過(guò)程復(fù)雜，涉及多種成分的變化及相互作用，尚需進(jìn)一步深入研究。

表2 梔子豉發(fā)酵過(guò)程中17種游離氨基酸的含量變化Table 2 Changes of 17 kinds of free amino acids contents during Zhizichi fermentation

3 結(jié)論

雙向固體發(fā)酵技術(shù)已成為開發(fā)中藥新藥的新途徑，國(guó)家一類新藥——槐耳菌質(zhì)即是采用此技術(shù)研制而成[17]。本研究在梔子豉湯原方基礎(chǔ)上，采用雙向固體發(fā)酵技術(shù)制備梔子豉，確定了其最佳發(fā)酵工藝條件為以梔子、青蒿、桑葉水煎液浸泡黑豆作為發(fā)酵基質(zhì)，接種枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和傘枝犁頭霉（Fusarium umbellatum）復(fù)合菌（1∶1，V/V）于28 ℃發(fā)酵168 h。此條件下，梔子苷和京尼平含量降為0，生成的京尼平-氨基酸復(fù)合物的色價(jià)最高（OD590nm為0.575），精氨酸（Arg）、絲氨酸（Ser）和天冬氨酸（Asp）含量分別下降了94.9%、71.6%、52.0%，而脯氨酸（Pro）、組氨酸（His）和谷氨酸（Glu）含量含量分別升高了3.4倍、1.5倍、1.5倍。本研究根據(jù)梔子豉湯抗抑郁活性成分的代謝轉(zhuǎn)化機(jī)制制備梔子豉，明確了其最佳發(fā)酵工藝及主要成分含量變化，后續(xù)將進(jìn)一步通過(guò)抑郁癥大鼠模型進(jìn)行藥效學(xué)研究，為基于經(jīng)典名方的新型抗抑郁食療產(chǎn)品或新藥開發(fā)奠定基礎(chǔ)。