純培養(yǎng)微生物熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)的影響因素探究

吳冬梅，薛正楷，2，周榮清

（1.瀘州職業(yè)技術(shù)學(xué)院郎酒學(xué)院，四川瀘州 646000；2.瀘州市生物醫(yī)學(xué)工程研究所，四川瀘州 646000；3.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，四川成都 610065）

熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）是利用熒光標(biāo)記已知序列的核酸堿基（探針），根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，探針與待測(cè)樣本中目標(biāo)核酸進(jìn)行特異性結(jié)合，形成待測(cè)核酸與標(biāo)記探針的雜交體，通過(guò)熒光激發(fā)產(chǎn)生熒光信號(hào)。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞遺傳學(xué)[1-2]、腫瘤生物學(xué)[3-4]、微生物群落研究等領(lǐng)域。在環(huán)境微生物群落研究中，F(xiàn)ISH技術(shù)用于診斷海水、湖泊[5]沉積物中的微生物，河水、溪流[6]和海洋[7]中的菌體微生物，土壤[8]和根系表面[9]的寄居群落等環(huán)境微生物；該技術(shù)還應(yīng)用于研究除磷細(xì)菌、硝化細(xì)菌及厭氧氨氧化菌等環(huán)境工程微生物。杜照中[10]用FISH技術(shù)檢測(cè)文登鹽場(chǎng)沉積物樣品，觀察到了慢生單胞菌的細(xì)胞類群，然因數(shù)量較少，未能明確計(jì)數(shù)。姚倩[11]采用熒光原位雜交技術(shù)對(duì)十個(gè)城市污水處理系統(tǒng)的脫氮性能及硝化菌的種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明活性污泥中亞硝酸鹽氧化細(xì)菌（nitrite-oxidizing bacteria，NOB）的數(shù)量明顯高于氨氧化細(xì)菌（ammonia-oxidizing bacteria，AOB）的數(shù)量。樊香妮[12]在研究溫度對(duì)強(qiáng)化生物除磷（enhanced biological phosphorus removal，EBPR）系統(tǒng)處理性能及種群關(guān)系的影響時(shí)，采用FISH方法對(duì)活性污泥中主要功能微生物（聚磷菌和聚糖菌）的相對(duì)數(shù)量及分布狀態(tài)進(jìn)行分析，結(jié)果表明隨著溫度的升高，活性污泥中聚磷菌（polyphosphate accumulating organisms，PAOs）的比例下降，而聚糖菌（glycogen accumulating organisms，GAOs）的比例顯著增加，當(dāng)30 ℃時(shí)，PAOs占總細(xì)菌的比例僅為8%左右，而GAOs的比例高達(dá)（82±3）%。OEHMENA A等[13]使用該技術(shù)研究了序批式反應(yīng)器（sequencing batch reactor，SBR）中反硝化聚磷菌（denitrifying phosphorus removing bacteria，DPB）及其競(jìng)爭(zhēng)菌在污泥中的分布及群落形態(tài)，結(jié)果表明，除磷效果好時(shí)反硝化聚磷菌占優(yōu)勢(shì)，除磷效果壞時(shí)競(jìng)爭(zhēng)菌占優(yōu)勢(shì)。SOEJIMA K等[14]采用FISH技術(shù)研究反A2/O反應(yīng)器中聚磷菌的結(jié)果表明，加入亞硝酸鹽后聚磷菌數(shù)量降低，除磷能力下降，反硝化菌菌量越多越利于脫氮除磷過(guò)程。如MOLLER S等[15]研究了生物膜中微生物的空間分布、啟動(dòng)子誘導(dǎo)及其表達(dá)的時(shí)序進(jìn)程，同時(shí)對(duì)不同種類菌體間的相互作用及影響進(jìn)行了分析；SCHRAMM A等[16]將微傳感器和FISH技術(shù)結(jié)合，剖析了微生物群落結(jié)構(gòu)和代謝活性，揭示了厭氧微生物在有氧環(huán)境中的缺氧微生態(tài)位。但在眾多研究中發(fā)現(xiàn)[17-19]，F(xiàn)ISH雖然實(shí)現(xiàn)了可視化（待測(cè)樣本中目標(biāo)核酸與帶有熒光物質(zhì)的探針接合，熒光激發(fā)產(chǎn)生熒光信號(hào)，用熒光顯微鏡即可直接觀察菌體位置），但不同的檢測(cè)對(duì)象可視化程度差異較大，有的樣品中菌體可視化程度超過(guò)90%，而有的樣品可視化程度不到50%。本實(shí)驗(yàn)擬以純培養(yǎng)革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌及革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌植物乳桿菌為研究對(duì)象，探究純培養(yǎng)微生物FISH檢測(cè)的菌體種類、菌體生長(zhǎng)時(shí)期、菌體分散方式、細(xì)胞通透性、雜交條件等影響因素，以期為白酒生產(chǎn)過(guò)程中酒曲表層、中層、中心，窖池不同發(fā)酵部位（上、中、下層四角、中心）糟醅，窖池不同部位（窖底、窖壁）窖泥中各種釀酒微生物的原位雜交檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α：四川省微生物資源保藏中心；植物乳桿菌（Lactobacillus planetarium）滬1.08：上海市釀造科學(xué)研究所。

1.1.2 化學(xué)試劑

多聚賴氨酸（分子質(zhì)量＞15 000 Da）、焦碳酸二乙酯（分析純）：美國(guó)Sigma公司；4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（分析純）：美國(guó)Roche公司；甲酰胺、多聚甲醛（均為分析純）：成都科龍化工有限公司；氨丙基三乙氧基硅烷（aminopropyltriethoxysilane，APES）（分析純）：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium lauryl sulfate，SDS）、三羥甲基氨基甲烷（tromethamine，Tris）、焦磷酸鈉（分析純）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；抗熒光猝滅封片液：海門(mén)碧云天生物技術(shù)有限公司；溶菌酶（＞20 000 U/mg）；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）：天津市津北精細(xì)化工有限公司；丙酮（分析純）：美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1.0 L，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，牛肉膏10.0 g，乙酸鈉5.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫80 1.0 mL，檸檬酸二銨2.0 g，K2HPO42.0 g，MnSO4·H2O 0.25 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，蒸餾水1.0 L，pH 6.2～6.4，121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

BX-51熒光顯微鏡、CX31RTSF光學(xué)顯微鏡：日本奧林巴斯公司；PHS-3C型酸度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；TGL16M高速離心機(jī)：湘麓離心機(jī)儀器有限公司；722型可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海棱光儀器有限公司；KQ-100E超聲波清洗器：蘇州江東精密儀器有限公司；GL-20G-C型高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器有限公司；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；QYC-2112型恒溫振動(dòng)培養(yǎng)器：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；YX-450全自動(dòng)不銹鋼雙層立式電熱壓力蒸汽消毒器：上海三申醫(yī)療器械有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

E.coli：將（37±1）℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)8 h活化的E.coli以2%接種量接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，混勻后于（37±1）℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，分別用顯微鏡直接計(jì)數(shù)0、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h、24 h的菌體數(shù)量，繪制菌體生長(zhǎng)曲線。

L.planetarium：將（30±1）℃條件下靜置培養(yǎng)12 h活化的L.planetarium以2%接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基，混勻后在（30±1）℃條件下靜置培養(yǎng)，分別用顯微鏡計(jì)數(shù)0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、28 h、32 h、36 h、40 h、44 h、48 h、52 h、56 h、60 h、64 h、68 h、72 h的菌體數(shù)量，繪制菌體生長(zhǎng)曲線。

1.3.2 菌體細(xì)胞形態(tài)觀察及細(xì)胞計(jì)數(shù)

對(duì)2種不同生長(zhǎng)時(shí)期菌體進(jìn)行簡(jiǎn)單染色（齊氏石碳酸復(fù)紅染色液）、觀察菌體形態(tài)；對(duì)菌體進(jìn)行FISH計(jì)數(shù)（FISH counting，F(xiàn)ISHC）和顯微鏡直接計(jì)數(shù)（direct microscopic count，DMC），計(jì)算FISHC/DMC值。

1.3.3 FISH檢測(cè)方法

取培養(yǎng)至穩(wěn)定期的菌液5 mL，加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）（pH 7.2）25 mL，渦旋混勻，10 000 r/min高速冷凍離心10 min，收集菌體，重復(fù)洗滌1次后收集菌體，進(jìn)行熒光原位雜交檢測(cè)[20]。

1.3.4 純菌株FISH檢測(cè)條件優(yōu)化

（1）菌體分散方式的選擇

穩(wěn)定期的菌體用多聚甲醛固定，探討菌體不同分散方式。方式1：玻珠（Φ：3～5 mm）搖床振蕩打散60 min，轉(zhuǎn)速150r/min；方式2：渦旋振蕩后超聲波處理，超聲功率為100W，超聲時(shí)間分別為：0 s、30 s、60 s、90 s、120 s、150 s、180 s，間隔30 s超停一次。原位雜交后鏡檢觀察FISH檢測(cè)效果。

（2）細(xì)胞通透性對(duì)FISH檢測(cè)的影響

以L.planetarium和E.coli為研究對(duì)象，使用溶菌酶在37 ℃條件下分別對(duì)穩(wěn)定期菌體處理0 min、30 min、60 min、90 min（10 mg/mL溶菌酶1 mL）后進(jìn)行原位雜交，F(xiàn)ISH計(jì)數(shù)（FISHC）；同時(shí)顯微鏡直接計(jì)數(shù)菌液菌體數(shù)目；計(jì)算菌體檢出率（FISHC/DMC）。

（3）雜交條件的優(yōu)化

針對(duì)雜交條件（雜交時(shí)間、雜交溫度、甲酰胺濃度及洗脫液中NaCl濃度）固定某3個(gè)因素，改變另外一個(gè)因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。原位雜交后FISH計(jì)數(shù)（FISHC）。雜交時(shí)間分別為1h、2 h、3 h，雜交溫度分別為38 ℃、42 ℃、46℃，甲酰胺濃度分別為10%、20%、30%，洗脫液中NaCl濃度分別為100 mmol/L、300 mmol/L、500 mmol/L。同時(shí)對(duì)菌液顯微鏡直接計(jì)數(shù)（DMC），計(jì)算菌體檢出率（FISHC/DMC）。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

FISH 3.0分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定、形態(tài)觀察及菌體計(jì)數(shù)

2.1.1 純培養(yǎng)菌體生長(zhǎng)曲線

由圖1A可知，E.coli菌體適應(yīng)新環(huán)境能力強(qiáng)，幾乎不經(jīng)延滯期就直接進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；且菌體生長(zhǎng)速度較快，8 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，此后菌體數(shù)目幾乎無(wú)明顯變化；16 h后隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的耗盡和菌體死亡量增加，菌體量減少，E.coli菌體生長(zhǎng)進(jìn)入衰退期。由圖1B可知，L.planetarium經(jīng)4 h延滯期適應(yīng)新環(huán)境后，在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充沛的條件下，菌體迅速增殖進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，約在20 h時(shí)開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期；約52 h后，菌體死亡量增加，菌體進(jìn)入衰退期。

圖1 大腸桿菌（A）和植物乳桿菌（B）的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of Escherichia coli (A) and Lactobacillus planetarium (B)

2.1.2 不同生長(zhǎng)時(shí)期菌體形態(tài)觀察

不同生長(zhǎng)時(shí)期E.coli和L.planetarium菌體形態(tài)觀察結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3。

由圖2可知，不同生長(zhǎng)時(shí)期的E.coli菌體形態(tài)規(guī)則，呈單個(gè)短桿狀，菌體間比較分散且無(wú)連接，是革蘭氏陰性菌（G-）。由圖3可知，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L.planetarium呈鏈狀，菌體長(zhǎng)短不一，每節(jié)菌體形態(tài)規(guī)則，呈桿狀，長(zhǎng)度較均一；進(jìn)入穩(wěn)定期后，菌體為二聯(lián)菌體，形態(tài)規(guī)則，呈短桿狀，二聯(lián)體的兩節(jié)菌體間或成一定角度或處于同一直線，菌體分散；衰退期的L.planetarium亦主要以二聯(lián)體為主，菌體分散、菌體形態(tài)不太規(guī)則，是革蘭氏陽(yáng)性菌（G+）。

圖2 大腸桿菌不同生長(zhǎng)期的形態(tài)（100×）Fig.2 Cell morphology of E.coli in different growth phases (100×)

圖3 植物乳桿菌不同生長(zhǎng)期的形態(tài)（100×）Fig.3 Cell morphology of L.planetarium in different phases (100×)

2.1.3 不同生長(zhǎng)時(shí)期菌體計(jì)數(shù)結(jié)果

菌體純培養(yǎng)物E.coli（G-）和L.planetarium（G+）在對(duì)數(shù)、穩(wěn)定和衰減期的FISHC/DMC比值結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，總體而言，革蘭氏陰性菌（E.coli）檢出率較革蘭氏陽(yáng)性菌（L.planetarium）高，因?yàn)榍罢呒?xì)胞壁較薄，探針容易進(jìn)入；在同一菌體的不同生長(zhǎng)時(shí)期，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，菌體檢出率呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，可能是越到培養(yǎng)后期，菌體rRNA含量及活性有所降低。綜上，菌體種類及生理狀態(tài)對(duì)FISH法的定量表征有一定影響，尤其是對(duì)衰退期的革蘭氏陽(yáng)性菌影響較明顯。

圖4 兩種菌體不同生長(zhǎng)時(shí)期的熒光原位雜交技術(shù)計(jì)數(shù)與顯微鏡直接計(jì)數(shù)比值Fig.4 Ratio of FISH count/direct microscopic count of two strains at different growth stages

2.2 FISH條件的優(yōu)化

2.2.1 菌體分散方式的選擇

采用玻珠或超聲波處理待雜交菌體分散液，菌體分散狀況見(jiàn)圖5。經(jīng)玻珠搖床振蕩（150 r/min）處理60 min的樣品如圖5A所示，菌體分散程度良好；由圖5B～5F可知，未經(jīng)超聲波處理的樣品，部分菌體聚集，熒光信號(hào)強(qiáng)烈，但不便計(jì)數(shù)；超聲處理時(shí)間為60 s時(shí)，菌體分散狀態(tài)良好，便于計(jì)數(shù)；超聲處理時(shí)間偏長(zhǎng)，菌體活性降低甚至使菌體死亡[21]，熒光信號(hào)減弱。因此選擇超聲處理時(shí)間為60 s，間隔30 s。

圖5 不同處理方式下大腸桿菌菌體分布情況Fig.5 Distribution situation of E.coli under different processing modes

2.2.2 溶菌酶處理

FISH法檢測(cè)菌體細(xì)胞時(shí)，改變細(xì)胞通透性尤為必要，可增大探針與目標(biāo)核酸結(jié)合的幾率，提高菌體檢出率。PERNTHALE A等[19]報(bào)道了通過(guò)改變靶細(xì)胞的通透性使得菌體細(xì)胞檢出率從46%提高到了86%；FILION G等[22]也提到使用不同的化學(xué)物質(zhì)及酶處理菌體，改變菌體通透性，以利于FISH檢測(cè)。

用溶菌酶處理E.coli和L.planetarium，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6A可知，溶菌酶處理后，菌體檢出率均有較明顯提高，尤其是L.planetarium，效果顯著，檢出率由32.79%提高到70.3%；相同條件下L.planetarium的菌體檢測(cè)率略低于E.coli，可能是由于前者是革蘭氏陽(yáng)性菌，肽聚糖豐富，細(xì)胞壁較厚的細(xì)胞結(jié)構(gòu)所致；當(dāng)溶菌酶處理時(shí)間為60 min以上時(shí)，菌體檢出率達(dá)到90%。因此，確定溶菌酶處理時(shí)間為60 min。由圖6B可知，時(shí)間對(duì)菌體檢出率無(wú)顯著影響，菌體檢出率都較高（＞88%）。雖然史俊[23]認(rèn)為雜交時(shí)間有較大的影響，過(guò)短使雜交不完全，過(guò)長(zhǎng)則會(huì)增加非特異性雜交，但可能受本實(shí)驗(yàn)條件影響，該因素的影響不明顯。本研究選定雜交時(shí)間為2 h。

圖6 溶菌酶處理時(shí)間（A）及雜交時(shí)間（B）與菌體檢出率的關(guān)系Fig.6 Relationship between lysozyme treatment time (A),hybridization time (B) and bacterial detection rate

2.2.3 雜交溫度、甲酰胺及NaCl濃度的影響

雜交條件對(duì)其雜交體的穩(wěn)定性有較大的影響，其中雜交溫度、甲酰胺濃度及鹽濃度是對(duì)其影響的主要因素。當(dāng)雜交溫度過(guò)低或鹽離子濃度較高及甲酰胺濃度偏低，探針與70%～90%同源順序的核酸雜交而產(chǎn)生非特異雜交信號(hào)[24-25]，故可以借雜交后的洗滌過(guò)程加以彌補(bǔ)，探針雜交時(shí)產(chǎn)生的背景染色特別高時(shí)則通過(guò)不同鹽濃度清洗液的洗滌，以減少探針與標(biāo)本間的靜電作用，降低背景獲得較好的對(duì)比效果。與寡核苷酸雜交時(shí)，其雜交溫度應(yīng)高于60 ℃，然而卻對(duì)菌體形態(tài)的完整及在載玻片上粘附造成不良影響。通常，采用在反應(yīng)體系中加甲酰胺以降低雜交溫度，其濃度每增加1%，RNA：RNA，RNA：DNA，DNA：DNA體系中的Tm值就分別降低0.35 ℃，0.50 ℃及0.65 ℃[27]。雜交溫度、甲酰胺及NaCl濃度對(duì)菌體檢出率影響見(jiàn)圖7。由圖7A和7B可知，雜交溫度和甲酰胺濃度對(duì)E.coli檢出率影響不大，而對(duì)L.planetarium的檢出率有一定影響，綜合考慮確定雜交溫度為42 ℃、甲酰胺含量為20%，此時(shí)兩種菌體檢出率均相對(duì)較高（＞90%）。由圖7C可知，洗脫液中鹽濃度在100～300 mmol/L時(shí)，純培養(yǎng)物E.coli及L.planetarium的菌體檢出率都較高（＞89%），且背景均無(wú)明顯差異，確定NaCl濃度為300 mmol/L。

圖7 雜交溫度（A）、甲酰胺濃度（B）及NaCl濃度（C）與菌體檢出率的關(guān)系Fig.7 Relationship between hybridization temperature (A),formamide concentration (B),NaCl concentration (C) and bacteria detection rate

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以E.coli及L.planetarium為研究對(duì)象，研究了不同種屬、不同生長(zhǎng)期菌株、預(yù)處理方式及雜交條件對(duì)基于探針EUB338的FISH檢測(cè)結(jié)果的影響。結(jié)果表明，菌體種類及菌體生長(zhǎng)階段均較明顯影響FISH計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性；確定超聲分散菌體時(shí)間60 s（100 W、每30 s間歇）、溶菌酶處理60 min可較大幅度提高FISH對(duì)菌體的檢出率；確定較優(yōu)條件為雜交時(shí)間2 h、雜交溫度42 ℃、雜交液中甲酰胺含量20%及洗脫液中NaCl濃度300 mmol/L。