酶解結(jié)合高剪切破壁技術(shù)對(duì)蜂花粉酚類(lèi)物質(zhì)及抗氧化活性的影響

王 悅，徐元元，楊二林，程 妮,3※

（1. 西北大學(xué)化工學(xué)院，西安 710069；2. 西北大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，西安 710069；3. 陜西省蜂產(chǎn)品工程技術(shù)研究中心， 西安 710065）

0 引言

蜂花粉是由蜜蜂采集被子植物雄蕊花藥或裸子植物小孢子囊內(nèi)的花粉細(xì)胞，并混入花蜜及自身分泌物而形成團(tuán)粒狀物[1]。蜂花粉作為一種保健食品，具有治療特性，蜂花粉中約70%的物質(zhì)具有生物活性，具有抗氧化、保護(hù)肝臟、抗炎、抗菌和抗癌作用[2-4]。其中多酚類(lèi)物質(zhì)表現(xiàn)出強(qiáng)抗氧化活性[5]，可以有效清除自由基，保護(hù)機(jī)體免受活性氧的損傷，同時(shí)增強(qiáng)血管活性，從而改善血液循環(huán)和心臟功能。酚類(lèi)物質(zhì)可促進(jìn)改變膜的通透性，破壞細(xì)菌的遺傳物質(zhì)達(dá)到抑菌效果，特別是對(duì)病原菌化膿性鏈球菌有顯著的抗菌效果[6]，酚類(lèi)物質(zhì)是蜂花粉主要的抑菌劑，總酚含量同革蘭氏細(xì)菌生長(zhǎng)數(shù)量呈負(fù)相關(guān)[7]。酚類(lèi)物質(zhì)還有抑制腫瘤細(xì)胞的作用，阻斷腫瘤細(xì)胞特定基因的表達(dá)，同時(shí)增強(qiáng)免疫系統(tǒng)[8]。但蜂花粉外壁主要由纖維素和孢粉素構(gòu)成，具有抗酸、耐堿、抗微生物分解的特性，不經(jīng)破壁，酚類(lèi)物質(zhì)很難溶出，只能從萌發(fā)孔中緩慢釋放，體外抗氧化活性很低，不利于開(kāi)發(fā)用于外用的護(hù)膚品及藥品。此外堅(jiān)硬的花粉壁使得蜂花粉在生物體內(nèi)消化率不高，吳偉[9]通過(guò)小鼠體內(nèi)消化試驗(yàn)表明破壁蜂花粉在小鼠胃部更容易排空，熒光顯微鏡觀察消化2 h和12 h后的蜂花粉形態(tài)，發(fā)現(xiàn)破壁蜂花粉碎片并無(wú)變化，未破壁蜂花粉粉粒依舊完整，表明蜂花粉外殼并不受消化酶影響，意味著大部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能夠被胃腸消化。未破壁蜂花粉在生物體內(nèi)消化率只有52%～59%，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)成分浪費(fèi)，因此蜂花粉破壁有助于對(duì)提高蜂花粉活性物質(zhì)溶出，提高體內(nèi)外利用度[10-12]。

花粉破壁是指在外力作用下破壞花粉壁結(jié)構(gòu)，破壁后內(nèi)容物溶出，有助于提高生物活性。吳偉[9]研究表明，破壁后蜂花粉總黃酮、總酚溶出率顯著增加（P＜0.001）。趙萌萌等[13]對(duì)青稞麩皮超微破壁后，抗氧化活性均有顯著提高（P＜0.05）。目前主要采用機(jī)械破壁、溫差破壁、酶解以及微生物發(fā)酵等破壁方法。機(jī)械破壁法時(shí)間作用長(zhǎng)可能導(dǎo)致原料溫度過(guò)高，破壞營(yíng)養(yǎng)成分；溫差破壁法成本過(guò)高，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；酶解破壁與微生物發(fā)酵法等生物破壁法，成本較高、時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，大量使用使樣品污染的可能性增大[14]。由于蜂花粉外壁主要由纖維素和孢粉素構(gòu)成，且為了克服單一破壁方法的弊端，故本研究采用纖維素酶酶解結(jié)合高剪切方法進(jìn)行復(fù)合法破壁，提高生物利用度，降低成本的同時(shí)不破壞營(yíng)養(yǎng)成分。且目前對(duì)于蜂花粉破壁研究多集中于破壁后形態(tài)表征以及對(duì)總酚、總黃酮含量影響，而破壁對(duì)蜂花粉酚類(lèi)物質(zhì)的溶出情況、抗氧化活性及對(duì)·OH介導(dǎo)的質(zhì)粒DNA氧化損傷的保護(hù)作用的影響研究甚少。

本文以荷花、棗花、茶花、油菜、玫瑰和五味子6種蜂花粉等為研究對(duì)象，采用酶解聯(lián)合高剪切破壁技術(shù)，研究破壁對(duì)蜂花粉酚類(lèi)物質(zhì)和抗氧化活性的影響。同時(shí)探討破壁前后蜂花粉對(duì)·OH介導(dǎo)的質(zhì)粒DNA鏈氧化損傷的保護(hù)作用，以期為蜂花粉資源的開(kāi)發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荷花、棗花、茶花、油菜、玫瑰、五味子6種蜂花粉均直接從蜂農(nóng)處采購(gòu)，且植物源經(jīng)過(guò)孢粉學(xué)鑒定[15]，確認(rèn)每種蜂花粉的種類(lèi)。

菲洛嗪（Ferrozine）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）、水溶性維生素E（Trolox）、2,4,6-三（2-吡啶基）三嗪（tripyridyltriazine，TPTZ）和酚類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品（沒(méi)食子酸、對(duì)羥基苯甲酸、2,4-二羥基苯甲酸、咖啡酸、丁香酸、p-香豆酸、阿魏酸、蘆丁、鞣花酸、肉桂酸、槲皮素、柚皮素、山奈酚、異甘草素）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；色譜級(jí)甲醇購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；過(guò)氧化氫（H2O2）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）購(gòu)自科昊生物工程有限公司；纖維素酶（酶活力為400 U/mg）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 蜂花粉破壁工藝

1.2.1 纖維素酶酶解破壁

參考并優(yōu)化孟良玉等[16]的方法，分別稱(chēng)取0.5 g蜂花粉，置于15 mL離心管中，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%纖維素酶，料液比為1∶10 g/mL，50 ℃恒溫水浴搖床酶解5 h。酶解結(jié)束后，80 ℃水浴滅酶10 min。吸取破壁蜂花粉懸濁液1 mL，蒸餾水定容到10 mL，取1～2滴稀釋液于載玻片上，置于20×20目（放大倍數(shù)：400×）熒光顯微鏡下觀察，取九宮格視野，計(jì)算破壁率。

1.2.2 纖維素酶酶解-高剪切聯(lián)用破壁

參考王凱[17]的方法，采用D-500均質(zhì)機(jī)（德國(guó)Wiggens公司）將酶解過(guò)的蜂花粉懸濁液高剪切30 s，轉(zhuǎn)速10000～15000 r/min，根據(jù)1.2.1節(jié)方法計(jì)算破壁率。

1.3 蜂花粉酚類(lèi)物質(zhì)富集

為了保證試驗(yàn)統(tǒng)一性，6種花粉均稱(chēng)取20 g，用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇、料液比1∶20 g/mL（破壁蜂花粉酚類(lèi)物質(zhì)富集：稱(chēng)取20 g蜂花粉，按照料液比1∶10 g/mL酶解后，將酶解液低溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至一定量，加入無(wú)水乙醇配制成體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液，按照1∶20 g/mL料液比添加到破壁蜂花粉渣中）熱回流2 h，三次回流，濃縮，采用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇定容至15 mL，備用。

1.4 HPLC分析6種蜂花粉破壁前后乙醇提取物酚類(lèi)化合物

采用高效液相色譜-二極管列陣檢測(cè)（High Performance Liquid Chromatography-Diode Array Detection，HPLC-DAD）法測(cè)定蜂花粉酚類(lèi)化合物含量[18]。HPLC-DAD（U3000 HPLC， G1315A DAD，美國(guó)Thermo公司），色譜柱 Zorbax SB-C18（250 mm× 4.6 mm，5.0μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）、體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸（B）；梯度洗脫程序?yàn)椋?～5 min，15%A+85%B；5～10 min，17%A+83%B；10～25 min，30%A+70%B；25～35 min，40%A+60%B；35～40 min，50%A+50%B；40～55 min，55%A+45%B；55～65 min，60%A+40%B；65～70 min，65%A+35%B；70～75 min，70%A+30%B。流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量是10μL蜂花粉乙醇提取物，二極管陣列檢測(cè)器（DAD）檢測(cè)波長(zhǎng)：254、280、290、324 nm；柱溫是30 ℃。

1.5 總酚含量測(cè)定

參照Sfifzadeh等[19]方法，采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定6種蜂花粉破壁前后的總酚含量，以表示酚類(lèi)物質(zhì)的溶出量。吸取0.3 mL方法1.3節(jié)中蜂花粉乙醇提取液定容到200 mL。準(zhǔn)確吸取1 mL蜂花粉乙醇提取稀釋液，加入1 mL福林酚試劑、5 mL 1 mol/L Na2CO3溶液，用蒸餾水定容到10 mL，振蕩混勻后，避光反應(yīng)1 h。760 nm處，以蒸餾水為參比，測(cè)吸光度值，總酚含量以沒(méi)食子酸當(dāng)量（Gallic Acid Equivalents，GAE）mg/g表示。

1.6 總黃酮含量測(cè)定

參照張翠香等[20]方法，采用Al(NO3)3比色法測(cè)定6種蜂花粉破壁前后的總黃酮含量，以表示黃酮類(lèi)物質(zhì)的溶出量。吸取0.3 mL蜂花粉乙醇提取液定容到10 mL。吸取1 mL蜂花粉乙醇提取稀釋液，加0.4 mL 5 g/mL的NaNO2，反應(yīng)6 min后，加入0.4 mL 10%的Al(NO3)3，反應(yīng)6 min后，加入4 mL 4%的NaOH溶液，用80%的甲醇溶液定容到10 mL，靜置15 min。于510 nm處測(cè)定其吸光度值，總黃酮含量以蘆丁當(dāng)量（Rutin Equivalents，RE）mg /g表示。

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1.7 DPPH自由基清除能力測(cè)定

參照Hara等[21]的研究方法，并進(jìn)行調(diào)整后測(cè)定6種蜂花粉破壁前后對(duì)DPPH的清除能力，分別吸取0.6 mL 不同濃度破壁前后的蜂花粉乙醇提取液，加入0.04 mg/mL的DPPH甲醇溶液5 mL，混勻后在暗處?kù)o置1 h，于517 nm處測(cè)其吸光度。結(jié)果以IC50值（抑制50% DPPH自由基時(shí)所需蜂花粉的濃度）表示，DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中A0為參比溶液的吸光值；A1為樣品溶液吸光值。

1.8 Fe2+絡(luò)合力測(cè)定

參照何亮亮等[22]方法，吸取200μL蜂花粉乙醇提取液，加入100μL濃度為1 mmol/L的FeSO4溶液，300μL 1 mmol/L的Ferrozine溶液，用甲醇定容至3 mL，混勻，10 min后于562 nm處測(cè)定吸光度。蜂花粉Fe2+絡(luò)合力測(cè)定以mg/g表示（以Na2EDTA計(jì)）。

1.9 Fe3+還原力測(cè)定

參照Rao等[23]方法，取0.4 mL蜂花粉乙醇提取液，加入3.6 mL的TPTZ（10 mmol/L TPTZ溶液、20 mmol/L FeCl3溶液、300 mmol/L pH值為3.6醋酸緩沖液，1∶1∶10體積比配制)溶液，37 ℃反應(yīng)10 min，于593 nm處測(cè)定吸光度。蜂花粉鐵還原抗氧化力以mg/g表示（以Trolox計(jì)）。

1.10 對(duì)·OH誘導(dǎo)的pBR322質(zhì)粒DNA氧化損傷保護(hù)作用的測(cè)定

使用瓊脂糖凝膠電泳法分別測(cè)定蜂花粉破壁前后對(duì)·OH誘導(dǎo)的pBR322質(zhì)粒DNA氧化損傷保護(hù)作用。參照陳思南等[24]方法進(jìn)行測(cè)定。未破壁組：試驗(yàn)組加入1μL DNA、1μL 1.0 mmol/L FeSO4、1μL H2O2和3μL 0.3 mL/mL蜂花粉提取物，用50 mmol/L PBS磷酸鹽緩沖液（pH值為7.0）定容到15μL，模型組用50 mmol/LPBS磷酸鹽緩沖液代替樣品，正常組添加1μLDNA和14μL磷酸鹽緩沖液；破壁組：試驗(yàn)組加入1μL DNA、1μL 1.0 mmol/L FeSO4、1μL H2O2和3μL 0.3mL/mL破壁蜂花粉提取物，用50 mmol/L PBS磷酸鹽緩沖液（pH值為7.0）定容到15μL，模型組用50 mmol/L PBS磷酸鹽緩沖液代替樣品，正常組添加1μLDNA和14μL磷酸鹽緩沖液。于37 ℃下避光水浴30 min后，加入1μL上樣緩沖液混合均勻，0.8%的瓊脂糖凝膠中電泳50 min（電壓為50 V）。使用凝膠成像儀（德國(guó)耶拿分析儀器股份公司）對(duì)電泳條帶進(jìn)行拍照，使用Quantity One軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，破壁前后的蜂花粉保護(hù)率用以下公式計(jì)算進(jìn)行對(duì)比

1.11 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均測(cè)定3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析和顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，采用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶-高剪切聯(lián)用對(duì)蜂花粉破壁率的影響

由于蜂花粉復(fù)雜的細(xì)胞壁，具有生物活性的化合物難以被充分釋放，導(dǎo)致蜂花粉營(yíng)養(yǎng)成分利用率低[25]，破壁可以使蜂花粉細(xì)胞壁破碎，內(nèi)容物充分溶出，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)釋放，提高蜂花粉營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率。本文首先研究了纖維素酶酶解對(duì)不同品種蜂花粉破壁率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。不同種類(lèi)的蜂花粉經(jīng)破壁后，花粉孢子均呈現(xiàn)出不同程度的破裂現(xiàn)象，且隨纖維素酶濃度的增加，蜂花粉的破壁率均增加。不同蜂花粉的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同，因此對(duì)纖維素酶的耐受能力不同，本研究中玫瑰蜂花粉耐受力最強(qiáng)，纖維素酶添加量增加到8%時(shí)破壁率只有74%，荷花蜂花粉最弱，1%的纖維素酶就可使其破壁率達(dá)到87%。

基于以上研究結(jié)果，下述研究的破壁蜂花粉均采用破壁率達(dá)到90%以上的蜂花粉，具體破壁采用不同濃度的纖維素酶酶解與高剪切聯(lián)用的方法（纖維素酶添加量：荷花1%；棗花4%；茶花2%；油菜1%；玫瑰4%；五味子3%），在此基礎(chǔ)上探究破壁對(duì)蜂花粉酚類(lèi)物質(zhì)及抗氧化活性的影響。

2.2 纖維素酶-高剪切聯(lián)用破壁對(duì)蜂花粉酚類(lèi)化合物的影響

酚類(lèi)化合物對(duì)癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化，免疫系統(tǒng)衰弱以及帕金森等疾病均有預(yù)防和治療作用[27]，可用于防止氧化損傷，清除自由基，螯合金屬離子的活性物質(zhì)[28]。近年來(lái)，蜂花粉酚類(lèi)化合物因其保健作用備受關(guān)注[29]。本文測(cè)定了6種蜂花粉破壁前后總黃酮、總酚含量見(jiàn)表1，6種蜂花粉破壁后總黃酮、總酚含量均有不同程度的增加。破壁后，油菜蜂花粉酚類(lèi)物質(zhì)的釋放作用最為顯著（P＜0.05），總酚含量由8.6 mg/g提高至21.6 mg/g，提高1.5倍，總黃酮含量提高6.4倍，阮征等[30]用纖維素酶-果膠酶-蛋白酶復(fù)合酶液酶解油菜蜂花粉，總黃酮含量由2.2447 mg/g提高到2.4312 mg/g，提高8.3%，相比而言本研究方法能夠釋放更多活性物質(zhì)；經(jīng)破壁后茶花蜂花粉總酚含量為15.7 mg/g，提高11.3%。油菜蜂花粉總黃酮含量最高，五味子蜂花粉破壁后總酚含量最高，荷花蜂花粉總黃酮、總酚含量較低。本文采用HPLC-DAD對(duì)6種蜂花粉中的酚類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表2。茶花蜂花粉破壁后共檢測(cè)出10種物質(zhì)，較未破壁多檢測(cè)出2種物質(zhì)；肉桂酸和山奈酚在破壁后被釋放，含量分別為0.72 mg/g和4.38 mg/g，沒(méi)食子酸含量由0.39 mg/g增加到2.53 mg/g，柚皮素含量為6.50 mg/g，是破壁前4倍，且高于其他蜂花粉。油菜蜂花粉經(jīng)破壁后，山奈酚和異甘草素溶出，異甘草素含量達(dá)到0.97 mg/g，系6種蜂花粉中含量最高，山奈酚含量達(dá)到2.32 mg/g，較Lv等[31]微波破壁檢測(cè)得到的山奈酚含量少（23.44 mg/g），可能由于油菜蜂花粉破壁方式、產(chǎn)地影響，以及酚類(lèi)富集方式不同，導(dǎo)致差異；油菜蜂花粉破壁后沒(méi)食子酸含量為11.59 mg/g，較未破壁前提高59%，為所檢測(cè)到的酚類(lèi)物質(zhì)中含量最高。棗花蜂花粉經(jīng)破壁后檢測(cè)出山奈酚，含量為10.31 mg/g，高于其他蜂花粉。破壁使玫瑰蜂花粉多檢測(cè)出兩種酚類(lèi)物質(zhì)，五味子蜂花粉多檢測(cè)出三種酚類(lèi)物質(zhì)，荷花蜂花粉雖沒(méi)有其他酚類(lèi)物質(zhì)溶出，但沒(méi)食子酸含量有大幅度增加，由0.72 mg/g增加到4.43 mg/g，較破壁前提高5倍。破壁后，茶花蜂花粉檢測(cè)出的酚類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)最多、含量最高，荷花蜂花粉酚類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)及含量均為最少。

表1 破壁前后蜂花粉的總黃酮、總酚含量 Table1 The content of total flavonoids and phenols in bee pollen before and after cell wall disruption

2.3 纖維素酶-高剪切聯(lián)用破壁對(duì)蜂花粉體外抗氧化活性的影響

由表3可知，6種蜂花粉破壁后體外抗氧化能力均增強(qiáng)。DPPH自由基（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）中氮原子的奇數(shù)電子通過(guò)從抗氧化劑接受一個(gè)氫原子到相應(yīng)的肼而被還原[32]。酚類(lèi)物質(zhì)這類(lèi)抗氧化劑可以有效減少DPPH自由基，對(duì)氧化應(yīng)激損傷有保護(hù)作用[33]。測(cè)定IC50值越小，則自由基清除能力越強(qiáng)。經(jīng)破壁后，同等質(zhì)量下棗花蜂花粉清除50%DPPH自由基所需濃度降低約95%，油菜蜂花粉降低約92%，延莎等[34]采用氣流超微粉碎破壁處理油菜蜂花粉后清除50%DPPH自由基所需蜂花粉濃度由0.338 mg/mL降低到0.315 mg/mL，僅降低6.8%，且破壁后檢測(cè)到總黃酮含量由25.462 mg/g減少到23.611 mg/g，可見(jiàn)氣流超微粉碎破壁方法效率不高且對(duì)蜂花粉營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有所損傷，相比而言酶解與高剪切聯(lián)用的破壁方法使DPPH自由基清除能力更大，且溶出的總黃酮含量增加6.4倍，在不破壞其營(yíng)養(yǎng)成分的同時(shí)釋放更多的抗氧化物質(zhì)。破壁對(duì)玫瑰蜂花粉和五味子蜂花粉DPPH自由基清除能力也有明顯的增強(qiáng)趨勢(shì)（P＜0.05）。Fe2+等過(guò)渡態(tài)離子能夠催化Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH[35]，加速氧化反應(yīng)，酚類(lèi)化合物與Fe2+絡(luò)合，中斷氧化反應(yīng)。破壁后6種蜂花粉Fe2+絡(luò)合能力均有提高作用（P＜0.05），棗花蜂花粉Fe2+絡(luò)合能力由0.36 mg/g提高至1.16 mg/g，提高約2.2倍；茶花、玫瑰蜂花粉提高約1倍，荷花、油菜、五味子蜂花粉較其他3種蜂花粉提升幅度較小。Fe3+還原力是指樣品提供電子，將Fe3+還原為Fe2+，生成有色物質(zhì)引起吸光度值增加[36]。破壁后6種蜂花粉的Fe3+還原力均提高（P＜0.05），其中對(duì)油菜蜂花粉影響作用最大，從6.20 mg/g提高至55.80 mg/g，提高8倍；其次為棗花蜂花粉，提高1.5倍；茶花蜂花粉破壁后Fe3+還原力由15.30 mg/g提高至24.20 mg/g。破壁對(duì)荷花蜂花粉和玫瑰蜂花粉Fe3+還原力影響較弱，但也有提高。

表3 破壁前后蜂花粉的抗氧化活性 Table 3 Antioxidant activity of bee pollen before and after cell wall disruption

基于以上數(shù)據(jù)，證實(shí)破壁能夠增強(qiáng)蜂花粉體外抗氧化活性。破壁后，棗花蜂花粉DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，主要基于其高含量的酚類(lèi)化合物，五味子、油菜蜂花粉較其稍弱；茶花蜂花粉Fe2+絡(luò)合力強(qiáng)于其余5種蜂花粉，可能源于茶花蜂花粉破壁后檢測(cè)出的酚類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)和含量最多；五味子、油菜蜂花粉均有強(qiáng)Fe3+還原力，高含量的黃酮、酚酸能夠?qū)e3+還原為Fe2+。棗花、茶花、五味子、油菜蜂花粉含有豐富的酚類(lèi)物質(zhì)，表現(xiàn)出強(qiáng)抗氧化活性，可為蜂花粉抗氧化食品的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

2.4 纖維素酶-高剪切聯(lián)用破壁蜂花粉對(duì)·OH誘導(dǎo)的pBR322質(zhì)粒DNA氧化損傷保護(hù)作用的影響

H2O2是機(jī)體氧化代謝的副產(chǎn)物，是一種非自由基物質(zhì)，很容易擴(kuò)散到活細(xì)胞當(dāng)中，過(guò)渡態(tài)金屬離子條件下，F(xiàn)enton反應(yīng)中H2O2生成·OH，從而破壞DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)。酚類(lèi)化合物通過(guò)絡(luò)合過(guò)渡態(tài)金屬離子或者清除H2O2使得反應(yīng)中斷，從而保護(hù)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)[37]，通過(guò)計(jì)算DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)占比來(lái)測(cè)定蜂花粉對(duì)·OH誘導(dǎo)的pBR322質(zhì)粒DNA氧化損傷的保護(hù)作用。凝膠電泳成相后得到圖4，6種蜂花粉破壁后，DNA雙螺旋條帶均更明亮清晰。由表4可知，破壁后，油菜蜂花粉對(duì)DNA氧化損傷的保護(hù)能力提高442.7%，茶花蜂花粉提高287.7%，荷花、棗花、玫瑰、五味子這4種蜂花粉分別提高了60.5%、12.4%、82.5%和4.8%，表明破壁使得蜂花粉中酚類(lèi)物質(zhì)得到充分的釋放，可以有效提高對(duì)·OH誘導(dǎo)的pBR322質(zhì)粒DNA氧化損傷的保護(hù)能力。

表4 破壁前后蜂花粉對(duì)DNA氧化損傷的保護(hù)率 Table 4 Protection rate of bee pollen against DNA oxidative damage before and after cell wall disruption %

3 結(jié)論

1）少量纖維素酶（荷花1%；棗花4%；茶花2%；油菜1%；玫瑰4%；五味子3%）結(jié)合高剪切技術(shù)使得6種蜂花粉達(dá)到90%以上破壁率。

2）6種蜂花粉經(jīng)破壁作用后酚類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)及含量均增加，總黃酮、總酚含量顯著增加（P＜0.05）。荷花蜂花粉沒(méi)食子酸含量較破壁前提高5倍，油菜蜂花粉總黃酮含量提高6.4倍，總酚含量由8.6 mg/g提高至21.6 mg /g，茶花蜂花粉共檢測(cè)到10種酚類(lèi)物質(zhì)，較未破壁前多2種。

3）體外抗氧化試驗(yàn)表明，破壁能夠?qū)椈?、油菜蜂花粉清?0%DPPH自由基所需濃度降低95%和92%，棗花蜂花粉Fe2+絡(luò)合力提高2.2倍，油菜蜂花粉Fe3+還原力提高8倍。破壁后荷花、棗花、茶花、油菜、玫瑰、五味子6種蜂花粉對(duì)pBR322質(zhì)粒DNA氧化損傷的保護(hù)作用分別提高了60.5%、12.4%、287.7%、442.7%、82.5%、4.8%。