白玉蘭根圍細菌及菌根真菌遺傳多樣性分析

何小麗

(1.上海市園林科學規(guī)劃研究院，上海 200232； 2.上海城市困難立地綠化工程技術(shù)研究中心，上海 200232)

玉蘭，為木蘭目、木蘭科、木蘭屬落葉喬木，常見種類有白玉蘭、望春玉蘭、二喬玉蘭、紫玉蘭等，為中國著名花木，是早春重要的觀花樹木，有著兩千多年的栽培歷史。玉蘭喜溫暖濕潤氣候和肥沃疏松土壤，不耐干旱和水澇，現(xiàn)多見于園林或行道樹兩側(cè)。白玉蘭為上海市市花，上海氣候濕潤多雨，植物根圍土壤中分布著大量的微生物，根圍微生物和植物互生互利，植物為根圍微生物提供碳源、氮源及其他營養(yǎng)物質(zhì)，根圍微生物幫助植物更好的吸收土壤中的礦質(zhì)營養(yǎng)并提供大量促進植物生長的激素等物質(zhì)，同時由于占據(jù)有效生態(tài)位，也具有有效防御病原菌侵害等作用。根圍微生物中的菌根真菌與植物關(guān)系緊密，據(jù)估計，3%的植物都會形成菌根結(jié)構(gòu)[1-2]。浙江嵊州作為全國著名的玉蘭繁殖基地，本研究對浙江嵊州白玉蘭林進行土樣采集，分析其根圍細菌群落及菌根真菌多樣性，為了解白玉蘭根圍微生物群落結(jié)構(gòu)打下基礎，從而為白玉蘭的推廣應用提供有效的科學支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

共采集浙江嵊州1～4號白玉蘭林不同深度(0～30、30～60 cm)土壤樣品7個，分別編號為1-30、1-60、2-30、2-60、3-30、4-30、4-60。3號樣地由于土壤硬且雜質(zhì)較多，只取0～30 cm土樣，編號3-30(表1)。

表1 各白玉蘭根圍土樣的理化性質(zhì)

1.2 土壤微生物DNA提取及MIseq測序

稱取250 mg的樣品，放入滅菌的2 mL離心管中，加入1 mL 70%乙醇，震蕩混勻，10 000 r·min-1室溫離心3 min，棄上層液體。加入1×PBS溶液，震蕩混勻，10 000 r·min-1室溫離心3 min，棄上層液體。倒置2 mL離心管于吸水紙上1 min，直至沒有液體流出。將樣品管于55 ℃烘箱放置10 min，使殘留酒精完全揮發(fā)。具體提取步驟參照OMEGA試劑盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit使用說明書。使用瓊脂糖凝膠檢測DNA完整性。

采用通用引物(341F/805R)對土樣細菌16S rDNA基因的V3～V4區(qū)進行擴增，采用菌根特異性引物(AMV4.5NF/AMDGR)[3]對土樣菌根真菌18S rDNA基因進行擴增。PCR擴增體系為50 μL，其中含2×Taq master Mix 15 μL、Bar-PCR primer F(10 μmol)1 μL、Primer R(10 μmol)1 μL、Genomic DNA 10～20 ng、H2O 補齊至50 μL。PCR擴增的反應條件為：94 ℃ 3 min；5×(94 ℃ 30 s；45 ℃ 20 s；65 ℃ 30 s)；20×(94 ℃ 20 s；55 ℃ 20 s；72 ℃ 30 s)；72 ℃ 5 min。利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，以方便按照1∶1等量混合后測序。等量混合時，每個樣品DNA取10 ng，最終上機測序濃度為20 pmol。PCR擴增產(chǎn)物利用上海生工生物工程有限公司的MiSeq PE300測定儀(Illumina Inc.San Diego.CA.USA)完成序列測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將測序所得全部有效的基因序列以97%的一致性聚類得到OTUs序列，通過RDP classifier軟件對所有OTUs序列進行序列比對得到其系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 白玉蘭林土壤細菌多樣性

1～4號地塊的白玉蘭林土壤細菌香農(nóng)多樣性指數(shù)均在6左右(表2)。其中，1、2號地塊不同深度土壤細菌香農(nóng)多樣性指數(shù)表現(xiàn)為表層0～30 cm高于深層30～60 cm土壤，4號地塊細菌香農(nóng)多樣性指數(shù)表現(xiàn)為表層0～30 cm與深層30～60 cm土壤差異不顯著。

表2 各白玉蘭根圍土樣的細菌多樣性指數(shù)與豐度

不同地塊白玉蘭土壤細菌物種相對含量平均值大于1%的主要為Unclassified(37.5%)、Gp2(6.1%)、Gp1(5.6%)、Gp3(2.6%)、Rhizomicrobium(2.5%)、Phenylobacterium(2.1%)、Ktedonobacter(2.1%)、Arthrobacter(1.7%)、Burkholderia(1.2%)、Gemmatimonas(1.3%)、Sphingosinicella(1.3%)、Pseudomonas(1.2%)(圖1)。不同地塊不同深度土壤細菌群落結(jié)構(gòu)有所差異，1-30、1-60、2-30、2-60中GP2、GP1相對豐度較高；3-30優(yōu)勢種類Phenylobacterium相對豐度較高；4-30、4-60優(yōu)勢種類GP2、GP1、GP3、Rhizomicrobium相對豐富較高。上述結(jié)果可知，由于GP2、GP1、GP3等種類名稱還未確定，其功能也就難以被深入研究，有待后期進一步的研究。

圖1 各白玉蘭根圍土樣細菌群落在屬水平上的組成和相對豐度

2.2 白玉蘭根圍細菌群落環(huán)境影響因子分析

速效鉀AK與第一排序軸高度相關(guān)，是白玉蘭根圍細菌群落主要環(huán)境影響因子，堿解氮AN、有效磷AP、有機質(zhì)OM、pH和第二排序軸高度相關(guān)，為白玉蘭根圍細菌群落次要環(huán)境影響因子。其中1、2號地塊細菌群落與pH正相關(guān)，3號地塊細菌群落與AK正相關(guān)，4號地塊細菌群落與OM、AN、AP和EC值正相關(guān)(圖2)。

圖2 白玉蘭根圍細菌群落與土壤理化因子的典型對應分析

2.3 白玉蘭林菌根真菌多樣性

1～4號地塊中1-30樣品土壤菌根真菌香農(nóng)多樣性指數(shù)最高，為4.60，高于其他6個樣品(表3)。其中，1、2號地塊不同深度土壤菌根真菌香農(nóng)多樣性指數(shù)表現(xiàn)為表層0～30 cm高于深層30～60 cm土壤，這與其細菌多樣性指數(shù)一致；4號地塊菌根真菌香農(nóng)多樣性指數(shù)表現(xiàn)為與其細菌多樣性指數(shù)變化保持一致。

表3 各白玉蘭根圍土樣的菌根真菌多樣性指數(shù)與豐度

在屬的分類水平上，不同地塊白玉蘭土壤菌根真菌物種主要為unclassified(45.9%)、Umbelopsis(19.6%)、Geminibasidium(6.0%)、Aphelidium(4.1%)、Knufia(2.4%)、Thanatephorus(2.3%)、Aspergillus(1.7%)、Venturia(1.6%)、Powellomyces(1.6%)、Fimicolochytrium(1.3%)、Xylobolus(1.2%)。不同地塊不同深度土壤菌根真菌群落結(jié)構(gòu)差異較大，1-30中Geminibasidium、Knufia、Rigifila占有較高比例，分別為6.0%、7.3%、5.5%；1-60中Aphelidium、Knufia、Fimicolochytrium、Xylobolus占有較高比例，分別為24.5%、8.9%、8.2%、7.0%；2-30、3-30中未分類細菌平均占80%，表明其中含大量潛在的新種；2-60中Geminibasidium、Thanatephorus、Venturia、Powellomyces占有較高比例，分別為31.9%、13.5%、8.1%和5.0%(圖3)?？梢钥闯?號白玉蘭林4-30、4-60土壤中Umbelopsis為主要的優(yōu)勢種群，相對豐度分別占65.8%、69.3%，遠高于其他5個土壤樣品。

圖3 各白玉蘭根圍土樣菌根真菌群落在屬水平上的組成和相對豐度

3 小結(jié)與討論

土壤根圍細菌和菌根真菌對植物生長影響顯著，但由于土壤微生物及菌根真菌研究方法的局限性，園林植物根圍細菌及其菌根真菌分布特征研究報道較少，且多集中在常見的花卉植物。本研究發(fā)現(xiàn)，浙江嵊州1～4號白玉蘭林根圍細菌群落結(jié)構(gòu)較相似(3號林除外)。1～4號白玉蘭菌根真菌群落差異較大，其中4號白玉蘭林菌根真菌以Umbelopsis為主要優(yōu)勢菌，且與矮小傘霉菌(Umbelopsisnana)的相似度達99%。很多學者也從其他植物中分離到傘狀霉屬，如趙建娜[4]從蘭科植物根部分離到傘狀霉屬等菌根真菌；羅開源[5]從銹葉杜鵑根部分離到傘狀霉屬真菌；楊鶴同[6]從鐵皮石斛根部分離到傘狀霉屬真菌。研究表明，Umbelopsis并不是白玉蘭的專一性菌根真菌[7-8]，通常可以將植物促生菌制備成菌劑促進植物生長[9-10]，因此，可以通過添加外源菌根真菌Umbelopsis菌劑以提高白玉蘭林土壤菌根真菌含量，從而間接提升白玉蘭林的生長狀態(tài)。從白玉蘭長勢來看，4號地塊白玉蘭長勢最佳，優(yōu)于1～3號地塊白玉蘭。1～4號地塊白玉蘭土壤菌根真菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯，且無共同的優(yōu)勢菌根真菌，只有1-60、2-60中的Aphelidium、Geminibasidium占有較高比例，分別達24.5%、31.9%；1～3號地塊主要為粗放式管理的白玉蘭林，人工干預小，4號地塊為基地栽植，人工精細化管理，肥水措施完善，4號地塊土壤肥力明顯高于1～3號地塊，這些綜合因素可能導致4號地塊與其他地塊菌根真菌群落不同。綜合分析表明，土壤肥力的提升對白玉蘭菌根真菌遺傳多樣性的影響較大，但對細菌遺傳多樣性影響較小，可以通過改變白玉蘭菌根真菌群落結(jié)構(gòu)來提升白玉蘭林生長效果。本研究對浙江嵊州地區(qū)白玉蘭林地開展研究，研究結(jié)果為上海市白玉蘭的培育與管護提供借鑒意義。對上海地區(qū)白玉蘭根圍細菌及其菌根真菌群落有待開展進一步對比研究。