不同光強(qiáng)處理下擬巫山淫羊藿生物學(xué)性狀和淫羊藿苷類黃酮的變化△

潘俊倩，李小明，楊倩茹，落艷嬌，4，申國安，徐超群，魏升華，郭寶林*

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院 輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；3.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；4.山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030001

淫羊藿為傳統(tǒng)中藥，具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的作用?，F(xiàn)代研究表明，淫羊藿含有黃酮類、生物堿、多糖、木脂素等多種化學(xué)成分[1]。其中，C8位具有異戊烯基的淫羊藿苷類黃酮具有促進(jìn)雄性功能、雌激素樣作用，抗肝癌、乳腺癌、白血病等和改善心血管系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)等作用；多糖能調(diào)節(jié)免疫、抗病毒等[2-3]。近年來，隨著市場需求不斷增加，野生淫羊藿資源不斷減少，進(jìn)行人工栽培是實(shí)現(xiàn)資源可持續(xù)利用的必由之路。擬巫山淫羊藿EpimediumpseudowushanenseB.L.Guo是2007年發(fā)表的淫羊藿屬新物種[4]，分布于貴州貴陽、黔南和黔東南地區(qū)及廣西東北部地區(qū)等。該物種中朝藿定C含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于藥用種類巫山淫羊藿，是淫羊藿屬首個(gè)實(shí)現(xiàn)了人工栽培的物種。

野生擬巫山淫羊藿主要生長于灌叢下、林緣等環(huán)境中，是一種典型的陰生植物，對(duì)光的反應(yīng)非常敏感。種植過程中，一般用70%～90%的遮蔭網(wǎng)，或者種植在相似遮蔭度的林下。本課題組Pan等[5]研究了不同光強(qiáng)處理60 d后擬巫山淫羊藿中淫羊藿苷類黃酮成分差異，發(fā)現(xiàn)(18.2±2.5) μmol·m-2·s-1下，擬巫山淫羊藿的生長發(fā)育狀態(tài)較好，而(54.6±2.5) μmol·m-2·s-1下淫羊藿苷類黃酮積累較多，生物量較大。本研究在以上2種光強(qiáng)下，測定擬巫山淫羊藿植物在萌芽30、60、90、120 d持續(xù)生長過程中的各項(xiàng)生長發(fā)育指標(biāo)(株高、復(fù)葉面積、分枝數(shù)、含水量、葉綠素含量、葉片生物量)以及淫羊藿苷類4種主要黃酮成分(淫羊藿苷、朝藿定C、朝藿定A、朝藿定B)的變化規(guī)律，進(jìn)一步闡明2種光強(qiáng)處理下擬巫山淫羊藿生長發(fā)育和黃酮成分積累特點(diǎn)，為淫羊藿的種植和采收提供參考。

1 材料

朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷對(duì)照品(實(shí)驗(yàn)室自制，HPLC純度>98%)；乙腈(色譜純，Honeywell International Inc.)；甲醇、乙醇均為分析純，購自北京化工廠；水為娃哈哈純凈水。

LI-3000C型葉面積儀(LI-COR，American Lincoln Industries Co.，Ltd.)；SPAD-502型葉綠素儀(Konica Minolta Inc.)；高效液相色譜儀(Perkin Elmer Instruments Co.，Ltd.)；KQ-250DB型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；AL204-IC型電子分析天平(Mettler Toledo International Trading Co.，Ltd.)；XSl05型電子天平(Mettler Toledo International Trading Co.，Ltd.)。

選取貴州雷山淫羊藿種植基地的1年生健康實(shí)生苗，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所郭寶林研究員鑒定為擬巫山淫羊藿EpimediumpseudowushanenseB.L.Guo。

2 方法

2.1 生長指標(biāo)測定

將淫羊藿實(shí)生苗移入中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所溫室中，花盆基質(zhì)為泥炭土和蛭石(3∶1)混合。2014年2月1日(新葉萌發(fā)前)，選擇長勢一致的植株移入培養(yǎng)間(溫度：20～21 ℃，相對(duì)濕度：60%，光照時(shí)間：16 h·d-1)，分別在光強(qiáng)(18.2±2.5) μmol·m-2·s-1(L1)和(54.6±2.5) μmol·m-2·s-1(L2)下持續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間。每個(gè)光強(qiáng)下處理36株，在30、60、90、120 d分別取9株測定相關(guān)指標(biāo)。

株高采用卷尺測量莖基到最頂部葉片的高度；復(fù)葉面積采用葉面積儀測量一回三出復(fù)葉中3片小葉的面積；分枝數(shù)為根狀莖上萌發(fā)的分枝數(shù)；葉片總生物量采用天平測量植物所有新鮮葉片的質(zhì)量(鮮質(zhì)量)，然后于60 ℃烘箱中干燥葉片至質(zhì)量恒定后測量干燥葉片的質(zhì)量(干質(zhì)量)；比葉面積(SLA)為復(fù)葉面積與復(fù)葉干質(zhì)量的比值；水分含量采用公式(1)計(jì)算；葉綠素含量(SPAD值)采用葉綠素儀在650、940 nm波長下測定葉片的葉綠素含量；淫羊藿苷類成分含量采用參考文獻(xiàn)[5]方法，每個(gè)植株每個(gè)時(shí)期取1個(gè)小葉片合并為1個(gè)樣品，測定葉片中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C及淫羊藿苷4種淫羊藿苷類黃酮成分含量。

水分含量=1-葉片干質(zhì)量/葉片鮮質(zhì)量×100%

(1)

2.2 分析方法

采用SPSS v20軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)和重復(fù)測量的方差分析，用Tukey HSD測試來比較不同方法之間的差異。其中，t檢驗(yàn)、方差分析和Tukey HSD測試的P值分別設(shè)置為0.05。

3 結(jié)果與分析

3.1 光強(qiáng)對(duì)擬巫山淫羊藿生長發(fā)育的影響

3.1.1株高 從圖1看出，2種光強(qiáng)下，30 d均是擬巫山淫羊藿植株的快速增高生長時(shí)期。60 d內(nèi)還有少量生長，和30 d比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，下同)；60 d后，L1光強(qiáng)下到90 d略有生長，120 d時(shí)不再增高，而L2光強(qiáng)下90 d時(shí)已基本沒有生長，2種光強(qiáng)處理90、120 d與60 d差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明強(qiáng)光下株高更早達(dá)到峰值，停止生長。

注：不同大寫字母表示同一光強(qiáng)下不同處理時(shí)間之間的差異性(P<0.05)；不同小寫字母表示同一處理時(shí)間下不同光強(qiáng)之間的差異性(P<0.05)；下同。圖1 2種光強(qiáng)持續(xù)處理下擬巫山淫羊藿株高的動(dòng)態(tài)變化

3.1.2復(fù)葉面積 從圖2看出，2種光強(qiáng)下，擬巫山淫羊藿植株葉片的生長趨勢相同。30 d內(nèi)葉片大小已經(jīng)基本達(dá)到最大，60、90、120 d與30 d相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 2種光強(qiáng)持續(xù)處理下擬巫山淫羊藿復(fù)葉面積的動(dòng)態(tài)變化

3.1.3比葉面積 從圖3看出，2種光強(qiáng)下，30～90 d擬巫山淫羊藿的比葉面積持續(xù)減小(且各時(shí)期差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，其中L1光強(qiáng)下的變化幅度大，90 d后，L1光強(qiáng)下略降低，L2光強(qiáng)下略升高。在30～90 d期間葉面積沒有變化，含水量變化降低幅度較小的情況下，表明有葉片厚度增加或生物量積累的變化。

圖3 2種光強(qiáng)持續(xù)處理下擬巫山淫羊藿比葉面積的動(dòng)態(tài)變化

3.1.4分枝數(shù) 從圖4看出，2種光強(qiáng)下擬巫山淫羊藿的分枝數(shù)增加的節(jié)律不同，L1光強(qiáng)下60 d達(dá)到最大分枝數(shù)，其后已基本沒有增加，90、120 d與60 d差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而L2光強(qiáng)下分枝數(shù)增加到90 d。表明強(qiáng)光有持續(xù)促進(jìn)新分枝形成的作用。

圖4 2種光強(qiáng)持續(xù)處理下擬巫山淫羊藿分枝數(shù)的動(dòng)態(tài)變化

3.1.5含水量 從圖5看出，2種光強(qiáng)下，擬巫山淫羊藿葉片的含水量在整個(gè)處理時(shí)期呈現(xiàn)降低趨勢。L1光強(qiáng)下表現(xiàn)出持續(xù)降低(各時(shí)期差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，而L2光強(qiáng)下降低幅度較小，其中在60～90 d差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明強(qiáng)光下，葉片的含水量降低達(dá)到最終狀態(tài)的時(shí)間較早。

圖5 2種光強(qiáng)持續(xù)處理下擬巫山淫羊藿葉片含水量的動(dòng)態(tài)變化

3.1.6葉綠素含量 從擬巫山淫羊藿的葉片生長來說，30 d完成展葉，但要達(dá)到60 d才完全成熟，所以表現(xiàn)出30 d的SPAD較高。從圖6看出，L1光強(qiáng)下，葉片的SPAD在30 d時(shí)最高，60 d降低，然后變化不明顯；L2光強(qiáng)下，則30 d和60 d差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其后持續(xù)降低。

圖6 2種光強(qiáng)持續(xù)處理下擬巫山淫羊藿葉片葉綠素含量的動(dòng)態(tài)變化

3.1.7單株葉片生物量 從圖7看出，L1光強(qiáng)下，單株葉片生物量(干質(zhì)量)在緩慢增加，而L2光強(qiáng)下，90 d之前在增加，且增加幅度大于L1光強(qiáng)，90～120 d則略有降低。單株葉片生物量來自植株的單葉片生物量和葉片數(shù)量，擬巫山淫羊藿的葉為根狀莖萌發(fā)出的基生葉，葉片數(shù)量和萌發(fā)分枝數(shù)直接相關(guān)，可看到L1光強(qiáng)下，分枝數(shù)在60 d后變化不大，而比葉面積和含水量在降低，因此單株葉片生物量的升高主要來自于干物質(zhì)積累導(dǎo)致的單葉質(zhì)量增加，而L2光強(qiáng)下，分枝數(shù)在90 d之前增加量較大，而比葉面積和含水量變化較小，因此單株葉片生物量的增加主要來自于分枝數(shù)的增加。

圖7 2種光強(qiáng)持續(xù)處理下擬巫山淫羊藿葉片生物量的動(dòng)態(tài)變化

3.2 光強(qiáng)對(duì)擬巫山淫羊藿苷類黃酮成分含量的影響

2種光強(qiáng)下，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷4種成分總量參見表1。擬巫山淫羊藿中朝藿定C占4種成分總量的80%以上，而另外3個(gè)成分含量較少，因此總成分含量和朝藿定C的含量表現(xiàn)基本一致。

朝藿定A、朝藿定B和淫羊藿苷在L1光強(qiáng)下，大致表現(xiàn)為成分持續(xù)降低，可能與干物質(zhì)積累增加相關(guān)；而L2光強(qiáng)下，均表現(xiàn)為先降低，后升高，再降低的趨勢，由于此3個(gè)化合物屬于含量較低的成分，影響因素較為復(fù)雜，需要進(jìn)一步研究。

表1 2種光強(qiáng)不同處理時(shí)間下擬巫山淫羊藿的4種黃酮成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)及總量 %

4 結(jié)論

光強(qiáng)影響植物的多種生長特性，如高度、葉面積、比葉面積、分枝數(shù)、總生物量等[6]。擬巫山淫羊藿是陰生藥用植物，前期比較了5種光強(qiáng)對(duì)淫羊藿生長發(fā)育的影響[5]，發(fā)現(xiàn)隨光強(qiáng)增加，分枝數(shù)、復(fù)葉面積、SPAD值、含水量在(54.6±2.5) μmol·m-2·s-1光強(qiáng)之后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而主要成分朝藿定C含量達(dá)到最高。其中，(18.2±2.5) μmol·m-2·s-1光強(qiáng)下，復(fù)葉面積、SPAD值最大；而(54.6±2.5) μmol·m-2·s-1光強(qiáng)下，含水量最低，朝藿定C及總黃酮含量最高，分枝數(shù)達(dá)到飽和狀態(tài)。

本研究進(jìn)一步研究2種光強(qiáng)下各個(gè)指標(biāo)的持續(xù)變化，發(fā)現(xiàn)兩者的變化規(guī)律不太一致。2種光強(qiáng)作用下的擬巫山淫羊藿株高均為生長到60 d基本不增加，葉面積的生長期為0～30 d。比葉面積隨發(fā)育時(shí)間而持續(xù)降低，90 d后變化較小。分枝數(shù)隨著植物生長，芽從地下根狀莖上萌發(fā)而增加。L1光強(qiáng)下，只在30～60 d的時(shí)候有所增加，屬于淫羊藿生長發(fā)育的一般節(jié)律，即早春較短的萌發(fā)時(shí)間段，但是L2光強(qiáng)下分枝數(shù)增加幅度較大，且持續(xù)到90 d。經(jīng)觀察，強(qiáng)光可以刺激的根狀莖上的休眠芽繼續(xù)萌發(fā)，形成新的地上分枝。有報(bào)道，香石竹品種“媚娘”的側(cè)芽數(shù)在全光照下一直顯著增多，在一層60%透光遮陽網(wǎng)下2008年5月4日前顯著增加，在二層60%透光遮陽網(wǎng)下2008年4月24日之前顯著增加，表現(xiàn)出強(qiáng)光促進(jìn)側(cè)芽數(shù)的萌發(fā)[7]。葉片的含水量在L1光強(qiáng)下，表現(xiàn)為持續(xù)降低，而在L2光強(qiáng)下，60 d基本上達(dá)到最終狀態(tài)，后續(xù)變化很小了。

因此，本研究結(jié)果支持課題組的前期研究，L1光強(qiáng)下植物表現(xiàn)為正常的生長發(fā)育狀態(tài)，而強(qiáng)度為L1的3倍的L2光強(qiáng)，具有刺激擬巫山淫羊藿根狀莖芽萌發(fā)作用，也促進(jìn)葉片的提前成熟；在葉片總產(chǎn)量上，90 d與60 d相比，強(qiáng)光下較弱光下更高。擬巫山淫羊藿的葉綠素含量結(jié)果表明，在L2光強(qiáng)下，葉綠素含量持續(xù)減少。

淫羊藿苷類成分的含量變化，在不同光照強(qiáng)度下表現(xiàn)不同。弱光下，呈現(xiàn)穩(wěn)中有升的趨勢；而強(qiáng)光下，則在30 d為最高，隨后均有顯著下降。因此如果選擇較強(qiáng)的光照來獲得較高的擬巫山淫羊藿產(chǎn)量和含量，應(yīng)在強(qiáng)光處理后及時(shí)采收，避免長時(shí)間帶來的成分減少。