短鏈脂肪酸-?；矸蹖π∈笠钟魳有袨榈木徑饧皺C制

朱慧越，鄒仁英，許夢舒，王琳琳，田培郡，陳衛(wèi)，王剛

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

抑郁癥(depression)是一類精神障礙疾病[1]。據(jù)不完全統(tǒng)計，焦慮和抑郁[2]已成為影響國人身心健康的主要公共衛(wèi)生問題。近年來大量臨床研究表明，抑郁患者在抑郁癥發(fā)作時，會出現(xiàn)下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA軸)反饋機制失調[3-4]、免疫失調與慢性炎癥[5]等病理特征。伴隨著探索腸道的熱潮，“微生物-腸-腦軸”的研究為抑郁癥的防治打開了新的窗口。

抑郁癥常與胃腸疾病有極高的共病性[6]，其機制涉及“微生物-腸-腦軸”功能異常。作為腸道最重要的一類細菌代謝產(chǎn)物，短鏈脂肪酸與抑郁癥關聯(lián)密切。短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)由宿主攝入體內的膳食纖維等耐消化物質經(jīng)腸道微生物發(fā)酵產(chǎn)生[7]，常見的SCFAs包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸和異戊酸等。SCFAs既能作為G蛋白偶聯(lián)受體的激動劑[8]，介導腸上皮信號，又可作為組蛋白去乙酰化酶的抑制劑[9]，穩(wěn)定神經(jīng)系統(tǒng)，因此成為生命科學的研究熱點之一。隨著對其作用機制的闡明，SCFAs被認為是調節(jié)精神類疾病的重要信號分子[10]，廣泛參與調控神經(jīng)遞質5-羥色胺(5-hydroxytrptamine，5-HT)生成[11]、維持神經(jīng)元形態(tài)[3]、緩解神經(jīng)炎癥[12-13]等多項生理過程，表現(xiàn)出巨大的抗抑郁潛力。

由于SCFAs大多氣味濃烈，直接灌胃SCFAs會影響小鼠情緒，進而影響研究結果；此外，SCFAs的鈉鹽會被小腸吸收，無法模擬腸道菌群代謝產(chǎn)生SCFAs的正常生理過程。因此無論是SCFAs還是SCFAs鈉鹽的干預方式都無法精確體現(xiàn)大腸中微生物代謝產(chǎn)生的SCFAs對神經(jīng)系統(tǒng)的影響。而現(xiàn)有研究表明，取代度(degree of substitution，DS)在0.2～0.3的?；矸劬哂行∧c酶抗性[14]，這種SCFAs的衍生產(chǎn)物在小腸難以被吸收分解，在大腸才會被腸道微生物發(fā)酵，釋放出SCFAs及氣體。FUKUDA等[15]研究證實，給小鼠喂食添加了乙酰化淀粉的食物，乙酰化淀粉在小鼠的大腸內分解釋放出乙酸，顯著提高糞便中醋酸鹽含量；WANG等[16]通過對比不同組織中SCFAs的含量，也證實了酰化淀粉的抗小腸酶水解功能。

本研究采用SCFA-?；矸?，實現(xiàn)SCFAs在大腸的定點釋放，探究其對慢性應激引起的抑郁癥狀的緩解及其機制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

分析天平、pH計，美國METTLER TOLEDO公司；熱力磁力攪拌器，德國IKA公司；真空冷凍干燥機，上海泰事達機電設備有限公司；臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；EthoVision XT 11.5動物運動軌跡跟蹤系統(tǒng)，原制造商荷蘭Noldus公司；Waters e2695高效液相色譜儀、Waters 2475熒光檢測器，上海沃特世科技有限公司；PCR基因擴增儀，美國Bio-Rad公司；高通量組織研磨器，寧波新芝公司；氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(GC-MS)，美國Thermo Fisher Scientific公司。

高直鏈玉米淀粉，國藥集團化學試劑有限公司；乙酸酐、丙酸酐、異丁酸酐、丁酸酐，阿拉丁生化科技股份有限公司；異戊酸酐，日本TCI公司；小鼠皮質酮(corticosterone，CS)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、小鼠促腎上腺皮質激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)酶聯(lián)免疫分析試劑盒，南京森貝伽生物科技有限公司；qRT-PCR相關引物，上海桑尼生物科技有限公司。

1.2 飼料的制備

1.2.1 制備?；矸?/p>

?；矸鄣闹苽湓诤檠愕萚17]的方法上加以改進。將高直鏈玉米淀粉配制成質量分數(shù)為40%的淀粉乳?？販?0 ℃，滴加酸酐，用量相當于淀粉質量的50%，用0.50 mol/L NaOH溶液調節(jié)淀粉乳液pH，期間嚴格控制溫度和pH穩(wěn)定，反應2 h。結束后用0.50 mol/L鹽酸將體系pH值調整至5.70。水洗至洗液中性，冷凍干燥，得?；矸?。

不加酸酐，嚴格同上操作制備空白對照組和抑郁模型組使用的普通淀粉。

1.2.2 測定取代度

(1)樣品滴定：取2 g?；矸蹣悠芳尤?0 mL蒸餾水，以1%酚酞作為指示劑，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至終點。加入25 mL 0.5 mol/L NaOH準溶液，皂化反應1.5 h。鹽酸滴定體系中過量的NaOH溶液[18]；平行滴定3次，取均值。

(2)空白實驗：取2 g原料淀粉，檢測步驟同上。

(3)取代度計算如公式(1)、公式(2)所示：

(1)

(2)

式中：A，?；|量分數(shù)，%；V1，樣品組耗用的鹽酸標準溶液體積，mL；V2，空白組耗用的鹽酸標準溶液體積，mL；c，鹽酸標準溶液濃度，mol/L；m1，樣品組樣品質量，g；m2，空白組樣品質量，g；M，取代基的摩爾質量，g/mol(乙酰基取43，丙酰基取57，丁?；彤惗□；?1，異戊?；?5)；DS，酰化淀粉取代度；162，淀粉相對分子質量，g/mol[高聚體淀粉分子通式為(C6H10O5)n]。

1.2.3 制備飼料

以DS=0.25為基準換算各類?；矸坌枰砑恿?。以1 000 g混合飼料為例，需要150 g的取代度為0.25的酰化淀粉，如公式(3)所示：

0.25×150=DS×m

(3)

式中：m，1 000 g混合飼料中需加入的淀粉量。

將原飼料經(jīng)粉碎機破碎成細小顆粒，加入?；矸郏靹?，少量多次加入水，經(jīng)5 mL注射器擠壓成型，分類存放于-20 ℃冰箱。使用時，將飼料經(jīng)過紫外照射帶入屏障環(huán)境。

1.2.4 驗證?；矸酃δ?/p>

SCFAs的測定在毛丙永[19]的方法上做適當改進。稱取小鼠盲腸及內容物濕重約50 mg凍干，加入飽和NaCl溶液浸泡樣品，破碎至無明顯顆粒。硫酸酸化，振蕩均勻。加入乙醚旋渦以提取SCFAs，4 ℃、14 000 r/min離心15 min，將乙醚轉移至加入0.25 g無水硫酸鈉的EP管中，再次離心。將上清液轉移至氣相進樣小瓶中，用GC-MS測定，選取各分析物標準品的特征離子進行定量分析。外標法計算樣品中SCFAs的含量(μmol/g)。

1.3 動物實驗與方案設計

實驗動物選擇SPF級的C57BL/6J雄性小鼠，6周齡，購自蘇州格瑞斯威生物科技有限公司。動物實驗所有操作符合江南大學實驗動物管理各項規(guī)定，許可證SYXK(蘇)2016-0045。動物實驗方案經(jīng)江南大學實驗動物福利與倫理審查批準，審批號JN.No20191115c0600109[321]。經(jīng)適應性飼養(yǎng)后，除空白對照組外，其余6組經(jīng)5周的慢性不可預知溫和應激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)造模。動物實驗方案設計如圖1所示。

圖1 動物實驗方案設計Fig.1 Animal experiment design

1.3.1 構造抑郁模型

采用CUMS結合C57BL/6J方式進行造模[20]，每天隨機采用1～2種刺激，并避免晝夜節(jié)律，刺激因素如表1所示。

表1 抑郁模型小鼠的造模方式Table 1 Modeling method for depression mice

1.3.2 行為學測試

小鼠抑郁行為學的評價借助動物房的行為學實驗室展開，通過EthoVision XT 11.5系統(tǒng)分析行為學相關指標。

1.3.2.1 曠場實驗(open field test，OFT)

用鑷子輕輕夾住小鼠尾部，將其放入曠場箱內底面中心，同時進行錄像和計時，每只觀察時間為10 min。分析小鼠在中心、邊緣區(qū)域的活動情況[21]。

1.3.2.2 高架十字迷宮實驗(elevated plus maze test，EPM)

實驗開始時將小鼠面向開放臂放入迷宮中央格，同時進行錄像和計時。記錄5 min內小鼠在開放臂、閉合臂的活動情況[22]。

1.3.2.3 強迫游泳實驗(forced swimming test，F(xiàn)ST)

5 L實驗桶內裝有大約3 L的清水，水溫在(24±1) ℃，每只小鼠進行6 min游泳測試。同時進行錄像，分析3～6 min的小鼠靜止、活躍和狂躁時間[23]。

1.3.3 生理指標檢測

1.3.3.1 血清中HPA軸相關激素濃度的檢測

采用雙抗體夾心法ELISA試劑盒測定小鼠血清中ACTH和CS的含量。操作嚴格參考使用說明書。

1.3.3.2 結腸組織中神經(jīng)遞質及其前體濃度的檢測

稱取結腸組織50 mg，10倍稀釋(預冷PBS)后進行組織勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液，加入等體積的5%高氯酸沉淀蛋白，充分混勻，再次離心，上清液經(jīng)0.22 μm水系膜過濾后，上機分析。外標法計算結腸樣品中色氨酸(tryptophan，Trp)、5-羥色氨酸(5-Hydroxytryptophan，5-HTP)和5-HT的濃度[24]。

色譜條件：色譜柱為島津Intertsil ODS-3(5 μm，4.6 mm×250 mm)，流動相a為0.1 mol/L的NaAc(含0.1 mmol/L EDTA-2 Na)，pH=5.10，甲醇為流動相b，流動相a∶b=85∶15，流速1.0 mL/min，激發(fā)波長為290 nm，發(fā)射波長為330 nm，進樣量為10 μL。

1.3.3.3 結腸組織中色氨酸羥化酶1基因表達量的檢測

取20 mg結腸組織，TRIZOL提取總RNA并立即進行反轉錄得cDNA模板。使用1 μL cDNA和SYBR Green Supermix在BioRad-CFX384系統(tǒng)上進行色氨酸羥化酶1(tryptophan hydroxylase 1，TPH1)的實時熒光定量PCR，每個樣品重復3次，記錄樣品的循環(huán)閾值?；虮磉_量經(jīng)由內參Gapdh歸一化處理，使用2-△△Ct法進行分析小鼠結腸Tph1表達量[10]。

反應程序：95 ℃、2 min進行預變性，95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、15 s條件下進行40個循環(huán)，默認程序采集融解曲線小鼠Tph1引物序列(5′-GTAGGAACCAACCAGATTCACCAT-3′；5′-CCAAGGAGAA-GATGAGAGTC-3′)，小鼠Gapdh引物序列(5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′；5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

空白對照組和抑郁模型組的實驗數(shù)據(jù)使用Turkey′s test進行比較，各?；矸鄹深A組和抑郁模型組的實驗數(shù)據(jù)使用One-way ANOVA進行分析，P<0.05有統(tǒng)計學差異。實驗結果用GraphPad Prism 8軟件進行計算和繪圖，使用SIMCA 14.1進行正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least-squares discrimination analysis, OPLS-DA)和主成分分析(principal component analysis, PCA)。

2 結果與分析

2.1 ?；矸鄣娜〈?/h3>

本實驗采用堿法推進取代反應，得到的酰化淀粉皂化后滴定取代度。乙酰化淀粉、丙?；矸?、異丁酰化淀粉、丁?；矸酆彤愇祯；矸鄣腄S分別為0.22、0.25、0.22、0.26和0.28。

空白對照組和抑郁模型組小鼠所用的飼料加入不經(jīng)酸酐取代、同等條件操作的淀粉，其余5組以DS=0.25為基準換算各類?；矸坌枰砑拥牧?。各實驗組的原飼料與?；矸塾昧壳闆r如表2所示。

表2 干預飼料淀粉及原飼料用量Table 2 Quantity of starch and raw feed

2.2 ?；矸蹖崿F(xiàn)大腸釋放SCFAs

小鼠盲腸及內容物中SCFAs檢測結果如圖2所示。通過對比各組SCFAs濃度，發(fā)現(xiàn)補充特定的?；矸勰茉诿つc段顯著提高對應的短鏈脂肪酸的濃度，可以認為?；矸蹖崿F(xiàn)了對應短鏈脂肪酸的大腸定點釋放。此外，雖然空白對照組和抑郁模型組的飲食相同，但是抑郁模型組的小鼠大腸內乙酸和丁酸的濃度顯著低于空白對照組的小鼠(P<0.05)。

a-小鼠盲腸及內容物中乙酸的濃度;b-小鼠盲腸及內容物中丙酸的濃度;c-小鼠盲腸及內容物中異丁酸的濃度;d-小鼠盲腸及內容物中丁酸的濃度;e-小鼠盲腸及內容物中異戊酸的濃度圖2 盲腸及內容物中主要SCFAs的濃度Fig.2 Concentration of main SCFAs in cecum and contents注：ns表示沒有統(tǒng)計學差異；#表示P<0.05，##表示P<0.01；*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.000 1(下同)

2.3 SCFAs改善行為表型

為評價酰化淀粉對抑郁和焦慮癥狀的緩解作用，采用曠場實驗、高架十字迷宮實驗和強迫游泳實驗對小鼠的行為進行測試。分別就曠場實驗中小鼠第一次潛伏期時間和小鼠在中心區(qū)域的移動距離占總移動距離比例(%)、高架十字迷宮實驗中小鼠在開放臂活動時間占總時間比例(%)和強迫游泳實驗中小鼠靜止漂浮時間占總統(tǒng)計時間比例(%)進行評估，實驗結果如圖3所示。

空白對照組和抑郁模型組小鼠之間的焦慮及抑郁行為存在顯著差異(P<0.01)，而?；矸鄣母深A表現(xiàn)出了不同程度的抗焦慮、抗抑郁效果。在曠場實驗中，異丁酰化淀粉干預組(P<0.05)、丁?；矸鄹深A組(P<0.01)和異戊酰化淀粉干預組(P<0.001)的小鼠的第一次潛伏期顯著低于抑郁模型組的小鼠，并且異丁?；矸鄹深A組(P<0.05)的小鼠在中心區(qū)域移動的距離顯著高于抑郁模型組，這提示異丁酸、丁酸和異戊酸可能對小鼠探索未知環(huán)境的焦慮有潛在的緩解作用；在高架十字迷宮實驗中，各組小鼠在開放臂的停留時間無統(tǒng)計學差異，但是?；矸鄹深A的各組小鼠表現(xiàn)出在開放臂中停留時間增加的趨勢；在抑郁相關的行為測試方面，強迫游泳實驗中，空白組和模型組之間存在顯著差異(P<0.05)，而?；矸鄹深A的各組別無顯著差異，部分組別出現(xiàn)靜止漂浮時間延長的趨勢，這和預期并不完全一致。先前有研究者提出，一定劑量的丁酸處理對于急性抑郁和焦慮模型的整體活動并沒有影響，甚至使其在強迫游泳測試中表現(xiàn)出了更大的不活躍性[25]。這表明丁酸對情緒的調節(jié)作用仍需要進一步確認。

a-曠場實驗：小鼠第一次潛伏期;b-曠場實驗：小鼠在中心區(qū)域移動距離占總移動距離的比例;c-高架十字迷宮實驗：小鼠在開放臂停留時間占總時間比例;d-強迫游泳實驗：小鼠靜止漂浮時間占總時間比例圖3 行為學測試結果Fig.3 Results of behavioral tests

2.4 SCFAs修復HPA軸功能

測定小鼠血清中ACTH和CS的濃度，ELISA結果如圖4所示。抑郁模型組的血清ACTH和CS的濃度顯著高于空白組(P<0.01)，而乙?；矸?P<0.01)、丙?；矸?P<0.01)和異丁酰化淀粉(P<0.01)的干預使得小鼠體內ACTH的水平接近于空白對照組的小鼠，并且乙酰化淀粉(P<0.05)、異丁?；矸?P<0.05)和丁酰化淀粉(P<0.01)的干預會降低小鼠體內CS的含量。這表明乙酸和丁酸能通過調節(jié)神經(jīng)-內分泌系統(tǒng)，使應激激素恢復到正常水平，進而緩解小鼠HPA軸亢進。大量臨床研究表明，抑郁患者常伴隨著HPA軸亢進的癥狀。長期應激狀態(tài)下，高濃度的糖皮質類激素使得海馬體萎縮、調節(jié)HPA軸負反饋的能力下降，形成了惡性循環(huán)[26]。趙丹陽[27]提出，腸道微生物中，擬桿菌屬和普雷沃氏菌科等菌群的豐度與ACTH的水平呈正相關，GAREAU等[4]發(fā)現(xiàn)服用乳酸菌能夠降低母嬰分離誘導的異常高的CS水平，并且束縛應激的大鼠服用乳酸菌后過度亢進的HPA軸活動能夠恢復正常[28]。有研究明確指出，SCFAs作為主要的腸道菌群代謝產(chǎn)物，攝入后可以降低促皮質素釋放激素水平[29]，而人體循環(huán)中SCFAs的增加會隨著皮質醇對社會心理壓力反應的減弱而顯著協(xié)變[30]，并且可以緩解伴隨炎癥[5]。本文結果印證了先前的報道。盡管如此，GAGLIANO等[31]的研究表明，高劑量(1 200 mg/kg)的丁酸也具有應激作用，能夠顯著提高血漿中ACTH和CS的外周水平，誘導壓力應激行為。因此，SCFAs和抑郁調節(jié)之間的量效關系仍需進一步探究。

a-小鼠血清中ACTH的質量濃度;b-小鼠血清中CS的質量濃度圖4 HPA軸亢進相關的激素濃度Fig.4 Concentration of hormone related to HPA axis hyperactivity

2.5 SCFAs影響神經(jīng)遞質合成

腸道中，L-Trp經(jīng)TPH1轉化可以得到5-HTP，5-HTP進而在脫羧酶的作用下轉變成5-HT，是體內神經(jīng)遞質5-HT合成的主要來源[11]。Tph1的基因表達量參見圖5，抑郁模型組小鼠Tph1表達量顯著低于空白模型組(P<0.05)，表明CUMS造成的抑郁小鼠其結腸內Trp向5-HTP及5-HT的轉變受到了影響；而部分SCFAs，尤其是異丁酸(P<0.05)的攝入，能夠恢復小鼠結腸內Trp向5-HTP及5-HT的轉變過程，同時乙酸和丁酸也表現(xiàn)出了增強Tph1轉錄的特性，盡管沒有顯著性。我們的結果與先前的研究結論類似。REIGSTAD等[32]發(fā)現(xiàn)，恢復無菌小鼠的腸道菌群進而產(chǎn)生的SCFAs促進了腸嗜鉻細胞模型——BON細胞中的Tph1轉錄，可以顯著增強Trp向5-HTP的轉變。并且腸道產(chǎn)孢子菌及其代謝產(chǎn)物(如丙酸鹽和丁酸鹽等)顯著提高了小鼠腸道合成5-HT的功能[33]。SCFAs逆轉了小鼠體內的低Tph1mRNA水平，是影響5-HT合成的重要因素。

采用HPLC-熒光檢測法對小鼠結腸組織的Trp、5-HTP和5-HT的濃度進行檢測，實驗結果如圖6所示?？梢钥吹?，5類酰化淀粉的干預(相當于對應SCFAs的攝入)可以顯著增加結腸內的Trp濃度，這表明SCFAs的攝入可能影響了腸道菌群的結構，從而使得由腸道微生物代謝蛋白質產(chǎn)生的Trp增多。但從結腸5-HTP、5-HT的水平變化來看，抑郁模型組小鼠結腸5-HT卻顯著(P<0.05)高于空白對照組，盡管其前體5-HTP的水平在空白對照組和抑郁模型組的小鼠之間沒有顯著性變化，并且與Tph1轉錄情況并不完全一致，這可能由于模型動物處于一種代償性應激的狀態(tài)，從而使得神經(jīng)遞質及其前體處于一個短暫升高的階段。但可以肯定的是，SCFAs的攝入，尤其是乙酸和丁酸，均可以使CUMS造成的5-HT水平異常向正?；謴?。

圖5 小鼠結腸Tph1基因的相對表達量Fig.5 Relative expression of Tph1 gene in mouse colon

a-小鼠結腸中Trp的質量濃度;b-小鼠結腸中5-HTP的質量濃度;c-小鼠結腸中5-HT的質量濃度圖6 小鼠結腸中5-HT及其前體的濃度Fig.6 Concentration of 5-HT and its precursors in mice colon

通過正交偏最小二乘法分析空白對照組和抑郁模型組小鼠的組間差異，得到OPLS-DA得分圖，采用主成分分析對以上行為學及生理指標的實驗結果進行降維處理，得到PCA載荷圖(相關性圖)。由圖7-a可知，空白對照組和抑郁模型組在水平方向的差異證實了抑郁模型構建的有效性，在圖7-b中，乙酰化淀粉干預組、異丁酰化淀粉干預組及丁?；矸鄹深A組的小鼠與空白對照組的各項指標的相關性較強，這提示乙酸、異丁酸和丁酸均能在一定程度上緩解抑郁癥狀，使得小鼠的行為表型與生理指標逐漸恢復到正常水平。此前，MARCEL等[29]發(fā)現(xiàn)，將乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉的混合藥物添加到飲水中進行干預，SCFAs組在行為學測試中表現(xiàn)出抗抑郁和抗焦慮特異性。我們的實驗結果與先前報道一致。

a-OPLS-DA得分圖;b-PCA載荷圖圖7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析Fig.7 Statistical analysis of data

3 結論與展望

在本文中，首次采用了SCFA-?；矸鄣男问?，實現(xiàn)了對應短鏈脂肪酸在腸道的定點釋放，并證明了乙酸、異丁酸和丁酸均能在一定程度上緩解抑郁樣行為；相較于對行為表型的影響，SCFAs調節(jié)生理指標的效果更加顯著。在CUMS造模下，小鼠出現(xiàn)HPA軸亢進，分泌大量的應激激素并進入循環(huán)，體內5-HT及其前體水平出現(xiàn)紊亂，經(jīng)過5周的?；矸埏嬍掣深A，SCFAs使得小鼠體內ACTH和CS濃度逐漸恢復正常，對神經(jīng)系統(tǒng)起到保護作用，穩(wěn)定小鼠體內神經(jīng)遞質水平，緩解小鼠抑郁樣癥狀。

由于人體腸道菌群是一個復雜的動態(tài)體系，SCFAs 通過“微生物-腸-腦軸”系統(tǒng)影響抑郁癥的機制仍有很多未解的謎題，如SCFAs在腸道內的作用靶點、對宿主原生腸道微生物的影響、體內轉運涉及的相關通路與受體等。此外，腸道微生物代謝產(chǎn)生的SCFAs生理濃度是否能有效到達大腦、進而直接參與體內神經(jīng)調節(jié)，還需要更多證據(jù)來驗證。對SCFAs作用機制更為詳盡的探究，將為營養(yǎng)健康和疾病的精準干預提供更加堅實可靠的理論依據(jù)。