基于同位素標記相對和絕對定量技術研究藏香豬冷鮮肉冰溫保鮮分子機制

楊飛艷，辜雪冬，孫術國,，羅 章，謝司偉，黃文陽

（1.中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004；2.西藏農(nóng)牧學院食品科學學院，西藏 林芝 860000）

豬肉約占全球肉類消費總量的40%[1]。藏香豬，在西藏又稱人參豬，生長在海拔3 000～4 000 m的地區(qū)，以天然野生食用植物為主要食物，并以皮薄、脂肪含量低、肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富而聞名[2-3]。然而，由于目前對藏香豬肉理化評價、加工技術等基礎研究缺乏，造成藏香豬肉在貯藏加工過程其質(zhì)構(gòu)、色澤、感官等品質(zhì)損失巨大。

肉的冰溫保鮮技術是最近20 年開發(fā)的最新保鮮技術，相對于冷凍保鮮，其滴水損失少，貯藏過程品質(zhì)保持最佳，相對于冷藏保鮮技術，其保鮮時間更長[4]。然而，目前研究肉的貯藏品質(zhì)主要通過測定質(zhì)地、外觀、風味、顏色等[5]，主要集中于宏觀層面，較難解釋肉在貯藏過程品質(zhì)劣化分子機制。隨著蛋白質(zhì)組學技術在肉類科學中的應用，為揭示肉在貯藏過程品質(zhì)變化規(guī)律提供重要研究手段，目前已有研究發(fā)現(xiàn)肉在冷藏過程中涉及與其品質(zhì)劣化相關的生物標記物[6]，部分揭示了肉在貯藏過程中品質(zhì)劣化內(nèi)在分子機制[7]。冰溫保鮮相對冷藏保鮮優(yōu)勢明顯，但相關的保鮮分子機制原理仍不明確。

因此，本研究利用同位素標記相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）蛋白質(zhì)組學技術，比較分析了冰溫和冷藏保鮮條件下藏香豬冷鮮肉蛋白質(zhì)組的變化，旨在了解冰溫條件對藏香豬冷鮮肉品質(zhì)保鮮分子機制，為冰溫保鮮技術合理利用、冷鮮肉合理貯藏提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料肉選自西藏貢博甘達縣薩沙鎮(zhèn)的天然牧場藏香豬肉大腿肉（成年豬肉，正常、健康、無病、年齡1 歲）。

牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（質(zhì)量濃度為5 μg/μL）、氨水、胰酶美國Sigma公司；胰蛋白酶、肌鈣蛋白I（Troponin I）、鈣蛋白酶抑制素（Calpastatin）、反貝克林1（anti-Beclin 1）美國Promega公司；Bradford染液、甲醇、裂解液L3、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、丙酮廣州輝駿生物科技有限公司；乙腈美國Fisher公司；BCA蛋白分析試劑盒、ECL化學發(fā)光底物試劑盒上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

1524R低溫培養(yǎng)箱珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司；OQ610 Squirrel數(shù)據(jù)記錄器英國格蘭特儀器公司；SP-765PC紫外-可見分光光度計上海光譜儀器有限公司；Nicolet iG50傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR）儀、Ultimate 3000 RSLC nano液相色譜（liquid chromatography，LC）儀、Orbitrap Fusion Lumos Tribrid質(zhì)譜（mass chromatography，MS）儀美國賽默飛世爾科技公司；Acclaim PepMap RSLC C18分析柱（2 mm×150 mm，2 μm）美國Dionex公司；XHF-DY均質(zhì)機寧波新芝生物科技股份有限公司；DHP-9012恒溫箱上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將現(xiàn)宰的豬肉精細分割，取25 g冷鮮肉樣品進行無菌袋包裝，放入含冰袋的保溫箱中，在3 h內(nèi)運送到實驗室。所有無菌袋包裝的樣品置于低溫培養(yǎng)箱中，分別在－2 ℃和4 ℃中貯藏16 d，于第0、4、8、16天觀察并測定各項理化指標。選取0 d與16 d的樣品進行蛋白質(zhì)組學分析。

1.3.2 藏香豬冷鮮肉的冰點測定

用于測定實驗的腔室溫度設置為（-20.0±1.0）℃。使用數(shù)據(jù)記錄器以1 min的間隔記錄溫度。當所有探針記錄的溫度均低于-10 ℃時，將樣品從培養(yǎng)箱中取出。藏香豬冷鮮肉的冰點是根據(jù)冰點曲線的“高原”初始溫度確定的，平衡冰點是發(fā)現(xiàn)冷卻速度最慢時的溫度范圍[8]。

1.3.3 總揮發(fā)性鹽基氮含量的測定

根據(jù)GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》測定總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量。

1.3.4 彈性感官評分的測定

參考GB/T 22210—2008《肉與肉制品感官評定規(guī)范》對肉彈性進行打分。肉彈性指標評價標準：1）按壓肉樣表面后立即恢復評分為10 分；2）按壓肉樣表面恢復較快評分為8 分；3）按壓肉樣后凹陷恢復緩慢評分為6 分；4）按壓肉樣后凹陷不能恢復評分為小于4 分；若樣品平均分小于6 分，則視為感官不可接受[9]。

1.3.5 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的測定

利用FTIR分析總蛋白的二級結(jié)構(gòu)[10]。將真空冷凍干燥48 h后的藏豬肉粉碎成200 目的粉末，準確稱量2 mg樣品，加入0.1 g干燥無水的溴化鉀，用研缽研磨成均勻粉末，壓制成薄片進行FTIR分析，數(shù)據(jù)采集范圍在4 000～500 cm-1，每次測定前需扣除空氣背景光譜，32 次掃描積累，分辨率為4 cm-1，每個樣品測定3 次，取最具代表性的圖譜用于分析。

1.3.6 菌落總數(shù)測定

菌落總數(shù)（total aerobic count，TAC）的測定按照參考Liu Qian等[11]的方法。無菌條件下每個處理組稱10 g碎豬肉，用90 mL 0.85 g/100 mL無菌生理鹽水勻漿1 min。將1 mL勻漿液加入9 mL 0.85 g/100 mL無菌生理鹽水中，連續(xù)稀釋10 倍。在（36±1）℃下孵育48 h，菌落總數(shù)以lg（CFU/g）表示。

1.3.7 蛋白質(zhì)組學分析

1.3.7.1 蛋白質(zhì)提取、胰蛋白酶消化及iTRAQ試劑標記

取豬肉（3 g）與1 mL L3裂解液，預冷卻、砂漿完全研磨溶解后，轉(zhuǎn)移至環(huán)氧樹脂試管（1.5 mL）中，超聲處理（功率600 W、間隔1.5 s）5 min，于12 000 r/min、4 ℃離心20 min，并收集上清液。取上清液于4 個試管中，每個試管取250 μL，并在-20 ℃下加入1 mL丙酮過夜使其沉淀。將沉淀的蛋白質(zhì)在4 ℃、12 000 r/min下離心20 min，倒出上清液，干燥，得到加工的蛋白質(zhì)塊。加入適量的裂解液L3以溶解蛋白質(zhì)，超聲溶解（100 W，打開0.8 s、關閉0.8 s，超聲4 次，重復溶解一次），在4 ℃、12 000 r/min離心20 min，吸出上清液并轉(zhuǎn)移到新的EP管中。用0.22 μm聚偏氟乙烯膜過濾，獲得豬肉總蛋白提取物，用BCA蛋白分析試劑盒測定濾液的蛋白質(zhì)量濃度。蛋白質(zhì)的胰蛋白酶消化及iTRAQ試劑標記參考Mi Si等[12]的方法。

1.3.7.2 高pH值反相色譜分級

先用100 μL體積分數(shù)95%的A相（20 mmol/L甲酸銨，pH 10.0）和100 μL體積分數(shù)5%的B相（含20 mmol/L甲酸銨，pH 10.0）平衡柱子30 min，然后將標記后的混合多肽用100 μL的A相復溶；進樣，以0.2 mL/min的流速進行梯度洗脫；梯度洗脫條件為：0～5 min，5% B；5～10 min，5%～10% B；10～60 min，10%～40% B；60～65 min，4 0%～9 5% B；6 5 ～7 5 m i n，保持95% B；75 min～85 min，95%～5% B。整個洗脫過程在214 nm波長處進行監(jiān)測，從梯度洗脫開始根據(jù)峰型收集組分，每管接60 s，反復循環(huán)接樣；根據(jù)峰型和時間共收取10 個組分，真空干燥后，進行第二維反向LC-MS分析。

1.3.7.3 第二維反相LC-MS分析

LC條件：色譜柱為Acclaim PepMap RSLC C18柱，流動相A為1%（體積分數(shù)，后同）的甲酸溶液，流動相B為80%的乙腈溶液（含0.1%甲酸）。洗脫條件為：0～5 min，5% B；5～8 min，5%～10% B；8～40 min，10%～30% B；40～45 min，30%～35% B；45～50 min，35%～90% B；50～55 min，保持90% B；55～56 min，90%～5% B；56～65 min，5% B；流速為300 nL/min。

MS條件：一級MS參數(shù)：分辨率60 k，最大離子強度400 000，最大注入時間50 ms，掃描范圍：350～1 800m/z；二級MS參數(shù)：分辨率7.5 k；最大離子強度50 000；最長注入時間80 ms；母離子選擇20 個；母離子碎裂方法為高能碰撞解離；碰撞能量32%。

1.3.7.4 蛋白質(zhì)鑒定和定量

使用Penrot Pilot Software 4.5軟件對MS鑒定結(jié)果進行合并和數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，通過添加反庫計算由隨機匹配導致的誤報率（false positive rate，F(xiàn)DR）。FDR設置為小于1%，并且至少有一種匹配的特異性肽。搜索參數(shù)包括：樣品類型＝iTRAQ 8plex（標記肽）；半胱氨酸烷基化＝碘乙酰胺；酶＝胰蛋白酶。蛋白質(zhì)閾值大于1.3（相當于≥95%的肽置信度）用作鑒定標準。利用Excel軟件對蛋白可信肽段數(shù)和覆蓋率進行統(tǒng)計，利用Prism Graph軟件作圖。采用t檢驗對兩個重復進行相對定量分析，以1.5 倍臨界值評估蛋白表達的上調(diào)和下調(diào)，P＜0.05表示差異顯著。

1.3.7.5 差異表達蛋白分析

采用單變量分析差異倍數(shù)和t統(tǒng)計檢驗進行BH校正得到P值。差異離子同時滿足：差異倍數(shù)平均值（average，AVG）不低于2.0（或AVG不高于0.5）、P＜0.05的蛋白質(zhì)被認為是差異表達蛋白。

1.3.8 蛋白質(zhì)印跡分析

使用12%（體積分數(shù)，下同）的SDS-十二烷基硫酸鈉分離蛋白質(zhì)樣品（20 μg），然后將蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)移后，在室溫下用搖床將膜用5%脫脂奶（含0.5% Tris-HCl+0.05% Tween，TBS/T）封閉1 h。按1∶5 000的比例加入一抗（anti-Beclin 1），即6 mL含5% BSA的TBS/T加入1.5 μL抗體，過夜。然后，將膜用TBS/T洗滌3 次（每次10 min）。在室溫下用5% BSA以1∶3 000比例稀釋的二抗，室溫孵育1 h后，將膜在TBS/T中洗滌3 次（每次10 min）。最后，將膜的蛋白質(zhì)面朝上放置在兩層膠片之間，將這兩層膠片或其他透明膠片粘貼在曝光盒上。利用ECL化學發(fā)光底物試劑盒進行曝光、顯影和定影。

1.4 生物信息學與統(tǒng)計分析

為了表征豐度差異蛋白的特性。使用基因本體（gene ontology，GO）（http://www.geneontology.org）進行蛋白質(zhì)的功能注釋。利用京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）途徑數(shù)據(jù)庫（http://www.genome.jp/kegg/pathway.html）預測所鑒定蛋白質(zhì)的主要代謝途徑和生化信號轉(zhuǎn)導途徑。對于豬肉樣品品質(zhì)的參數(shù)結(jié)果，使用SPSS 18.0軟件的多因素方差分析進行多重比較，所有結(jié)果均表示為平均值±標準差，所有豬肉樣品使用6 個重復，每個重復進行3 次平行。使用SPSS 18.0軟件對豬肉中的豐度差異蛋白與品質(zhì)指標之間進行Pearson相關分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藏香豬冷鮮肉的冰點溫度

圖 1 藏香豬冷鮮肉的冷凍曲線Fig. 1 Freezing curve of chilled Tibetan fragrant pig meat

如圖1所示，當溫度下降到-2.3～-2.5 ℃時，進入最大冰晶形成區(qū)，溫度下降極慢，由此測定藏香豬冷鮮肉的冰點為-2.4～-2.5 ℃，低于普通豬肉的冰點（-0.8～-1.2 ℃）[13]，主要是這兩種豬肉在組成成分的差異所導致，如藏香豬肉氨基酸、蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸和微量元素相對普通豬肉含量更高[14]，高濃度的營養(yǎng)物質(zhì)可能導致藏香豬更低的冰點，然而，富含營養(yǎng)物質(zhì)理論上是不利于其貯藏保鮮，冷藏和冰溫的表現(xiàn)效果是否存在差異，目前鮮有相關的報道。同時，藏香豬肉較低的冰點溫度特點有利于將過冷技術應用到藏香豬冷鮮肉的貯存和保藏中，因為它提供了更寬的工作溫度范圍，并降低了對保藏設備的要求[15]。

2.2 冰溫保鮮條件下藏香豬冷鮮肉理化指標和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化

TVB-N是指蛋白質(zhì)在酶和細菌的作用下分解，產(chǎn)生揮發(fā)性的堿性含氮物質(zhì)，例如氨、伯胺和仲胺等，其含量是評估肉類新鮮度的重要指標。藏香豬肉冷藏16 d，其TVB-N含量從5.10 mg/100 g（初始值）升高到17.77 mg/100 g，已經(jīng)超過新鮮肉的限量值（15 mg/100 g）[16-17]，而冰溫貯藏的藏香豬肉樣品TVB-N含量從初始值增加到13.51 mg/100 g，結(jié)果表明冰溫貯藏對藏香豬冷鮮肉保鮮效果更好（表1），表1中藏香豬冷鮮肉在冰溫貯藏和冷藏過程中TAC變化與TVB-N含量變化結(jié)果一致。可能歸因于冰溫相對于冷藏，冷鮮肉內(nèi)源酶和腐敗細菌引發(fā)的蛋白質(zhì)降解反應速率更低，包括核苷酸降解、游離氨基酸的脫氨基、脫羧以及胺類的氧化等反應速率[18]，藏香豬冷鮮肉蛋白質(zhì)降解會導致其質(zhì)構(gòu)和風味品質(zhì)劣化。感官指標是衡量冷鮮肉品質(zhì)的一種最直接、重要的指標，能夠影響消費者的購買意向[19]。藏香豬冷鮮肉彈性隨著貯藏時間的延長，呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，但冷藏條件下降更快。豬肉蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)決定了其功能特性，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)與肉的整體品質(zhì)密切相關[20]。酰胺I帶（1 700～1 600 cm-1）是蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化的敏感區(qū)域，吸收峰最強，經(jīng)常被用于分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)[21]。本研究結(jié)果表明在冰溫和冷藏16 d條件下，藏香豬肉樣中蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要表現(xiàn)為β-折疊和β-轉(zhuǎn)角變化，而α-螺旋和無規(guī)卷曲相對含量雖然也變化，但變化不顯著（數(shù)據(jù)未展示），冰溫貯藏過程中藏香豬冷鮮肉蛋白質(zhì)β-折疊和β-轉(zhuǎn)角相對含量變化不顯著（P＞0.05），冷藏過程中β-折疊相對含量變化顯著，β-轉(zhuǎn)角相對含量變化雖然不顯著，但比冰溫貯藏組變化大，說明藏香豬肉在冰溫貯藏條件下蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)較冷藏條件更穩(wěn)定，導致蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)被破壞的程度較低，對冷鮮肉質(zhì)地結(jié)構(gòu)起到較好的保護作用[22]。

表 1 藏香豬冷鮮肉在不同貯藏溫度下的TAC、理化品質(zhì)和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化Table 1 Changes in TAC, physicochemical quality and protein secondary structure contents in chilled Tibetan fragrant pig meat stored at different temperatures

2.3 定量蛋白質(zhì)組學分析結(jié)果

對采用定量蛋白質(zhì)組學分析獲得的數(shù)據(jù)進行過濾后，總共匹配了4 756 個蛋白質(zhì)，并將它們映射到1 197 個可信賴的蛋白質(zhì)上。在所有鑒定出的蛋白質(zhì)中，約71.7%的蛋白質(zhì)包含至少兩個肽（圖2A）。此外，鑒定出的蛋白質(zhì)具有較高的序列覆蓋率，鑒定出67.57%的蛋白質(zhì)具有超過5%的序列覆蓋率，鑒定出43.48%的蛋白質(zhì)具有超過10%的序列覆蓋率（圖2B）。肽段長度顯示大多數(shù)肽段長度在6～17范圍內(nèi)（圖2C）；肽段長度超過11后，隨著肽段長度的增加，肽段的數(shù)量變得越來越少。

圖 2 藏香豬冷鮮肉定量蛋白質(zhì)組學分析結(jié)果Fig. 2 Results of quantitative proteomics analysis of chilled Tibetan fragrant pig meat

2.4 豐度差異蛋白的鑒定和比較結(jié)果

基于“AVG≥2.0或AVG≤0.5，且P＜0.05”的兩個標準鑒定了豐度差異蛋白。與0 d肉樣品相比，在-2 ℃和4 ℃下16 d的肉樣品中共有179 個蛋白質(zhì)豐度發(fā)生了顯著變化。-2 ℃16 d/0 d和4 ℃16 d/0 d比較分別有143 個豐度差異蛋白和97 個豐度差異蛋白，包括61 個共有的豐度差異蛋白（圖3A）?？紤]到豬肉蛋白質(zhì)組在兩種溫度條件下變化的復雜性，本研究擬從其重疊的61 種豐度差異蛋白變化規(guī)律中尋找溫度對豬肉品質(zhì)影響的共同規(guī)律和分子機制。

2.5 重疊豐度差異蛋白的生物信息學分析結(jié)果

GO分析結(jié)果如圖3B和圖3C所示。在生物過程中，重疊豐度差異蛋白質(zhì)主要參與解剖結(jié)構(gòu)發(fā)育、生物合成過程和細胞分化；在分子功能分類中，重疊豐度差異蛋白質(zhì)主要功能涉及離子結(jié)合、細胞骨架蛋白結(jié)合以及結(jié)構(gòu)分子活性等；在細胞組成中，重疊豐度差異蛋白質(zhì)主要分布在細胞質(zhì)、細胞骨架以及含蛋白質(zhì)復合物中。利用KEGG數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果如圖3D和圖3E所示，結(jié)果表明，重疊豐度差異蛋白質(zhì)主要涉及代謝通路、肌肉擴張障礙、鈣信號通路等途徑。根據(jù)結(jié)果可以推測，冷鮮肉在貯藏過程，其細胞質(zhì)或者細胞骨架中與細胞結(jié)構(gòu)相關蛋白分子功能發(fā)生變化，導致它們參與的代謝、結(jié)構(gòu)功能以及信號轉(zhuǎn)導功能發(fā)生障礙，而蛋白質(zhì)和代謝酶作為豬肉組織中重要組成部分，其結(jié)構(gòu)、分子功能和分布的變化必然會影響到肉的色澤、質(zhì)構(gòu)等品質(zhì)，譬如肌紅蛋白結(jié)構(gòu)變化就會影響肉的色澤變化和質(zhì)構(gòu)變化。而這種變化非常容易受到貯藏溫度和微生物的影響，因此，通過對貯藏豬肉重疊豐度差異蛋白的生物信息學分析，宏觀掌握貯藏豬肉品質(zhì)變化過程中所涉及的生物過程、分子功能和相關蛋白的分布，進而推測肉品質(zhì)變化的可能分子機制以及受到的影響原因。

圖 3 藏香豬冷鮮肉在－2 ℃和4 ℃條件下貯藏16 d后與0 d相比的蛋白差異表達Fig. 3 Analysis of differentially expressed proteins in chilled Tibetan fragrant pig meat stored at －2 and 4 ℃ for 16 days

2.6 藏香豬冷鮮肉中豐度差異蛋白與微生物指標、理化品質(zhì)及蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化的相關性

目前，蛋白質(zhì)組學應用肉類研究成為一個研究熱點，Yu Qianqian等[23]采用蛋白質(zhì)組學技術研究牛宰后肉品質(zhì)變化規(guī)律，基于蛋白質(zhì)分子水平一定程度解釋了牛肉成熟機制。然而，動物宰后成熟階段與其冷鮮肉貯藏過程是兩個完全不同過程，貯藏肉的質(zhì)構(gòu)、貯藏環(huán)境條件以及表面微生物數(shù)量與成熟階段肉存在巨大差異；因而，動物宰后成熟階段蛋白質(zhì)組學研究結(jié)果并不能用于解釋冷鮮肉在貯藏過程的品質(zhì)變化機制。藏香豬肉與普通豬肉的組成差異明顯，而其他品種豬肉的蛋白質(zhì)組學研究成果參考性非常有限，因此，基于蛋白組學技術研究藏香豬肉在冰溫和冷藏貯藏過程中品質(zhì)變化機制，可以補充相關研究的不足。為了進一步驗證上述推測，利用Pearson相關性分析法對重疊豐度差異蛋白與冷鮮肉的微生物指標、品質(zhì)特性（TVB-N含量和彈性）和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)（β-折疊相對含量和β-轉(zhuǎn)角相對含量）進行相關性分析（表2），旨在初步探明藏香豬肉冰溫保鮮的分子機制。結(jié)果表明：這些豐度差異蛋白根據(jù)特定功能分為5 類：結(jié)構(gòu)蛋白（39.3%）、代謝酶（11.5%），應激蛋白（8.2%），鈣調(diào)節(jié)蛋白（16.4%）和其他蛋白（24.6%），其與冷鮮肉的微生物指標、品質(zhì)特性（TVB-N含量和彈性）和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)（β-折疊和β-轉(zhuǎn)角相對含量）整體上存在顯著相關性。

表 2 藏香豬冷鮮肉中豐度差異蛋白表達量與TAC、品質(zhì)（TVB-N含量和彈性）、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)（β-折疊和β-轉(zhuǎn)角相對含量）的相關性Table 2 Correlation of differentially expressed proteins in chilled Tibetan fragrant pig meat with TAC, quality traits (TVB-N content and springiness)and protein secondary structure (β-sheet and β-turn contents)

2.6.1 結(jié)構(gòu)蛋白

結(jié)構(gòu)蛋白對豬肉組織結(jié)構(gòu)、質(zhì)構(gòu)以及色澤起著重要的作用。肌球蛋白在調(diào)節(jié)收縮、細胞內(nèi)囊泡遞送、細胞遷移、胞質(zhì)分裂和維持細胞形態(tài)中起重要作用[23]。研究結(jié)果表明，結(jié)構(gòu)蛋白中肌球蛋白-1、慢型-肌球蛋白結(jié)合蛋白C、肌球蛋白-4、肌球蛋白-2、原肌球蛋白α-1鏈和原肌球蛋白α-3鏈表達量均與肉的彈性和β-折疊相對含量呈極顯著正相關（P＜0.01），與TVB-N含量、TAC和β-轉(zhuǎn)角相對含量呈顯著（P＜0.05）或極顯著負相關（P＜0.01）（表2）。這說明豬肉貯藏過程中其肌球蛋白經(jīng)歷降解，蛋白質(zhì)β-折疊相對含量降低，β-轉(zhuǎn)角相對含量增加，肉的彈性降低，導致肉的質(zhì)構(gòu)品質(zhì)變差，而這種質(zhì)構(gòu)品質(zhì)變化主要受到貯藏溫度和冷鮮肉TAC的影響。從上述結(jié)構(gòu)蛋白在冰溫（-2 ℃）和冷藏（4 ℃）兩種溫度條件下差異表達情況可知，冰溫更利于結(jié)構(gòu)蛋白的保持，可能原因在于冰溫更利于控制腐敗微生物對蛋白質(zhì)的降解，本研究藏香豬冷鮮肉在貯藏過程結(jié)構(gòu)蛋白變化規(guī)律一定程度解釋了其品質(zhì)變化規(guī)律。Shi Jing等[24]研究也表明，肉肌球蛋白在肉貯藏過程降解越快，其質(zhì)構(gòu)、風味以及色澤等品質(zhì)下降越快。

2.6.2 代謝酶

本研究分析了α-1,4-葡聚糖磷酸化酶、4-α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶、AMP脫氨酶、磷酸甘油酸突變酶、UTP-1-磷酸葡萄糖尿酰轉(zhuǎn)移酶等代謝酶與藏香豬冷鮮肉的品質(zhì)特征的相關性，結(jié)果表明，α-1,4-葡聚糖磷酸化酶和4-α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的表達量均與TVB-N含量、β-轉(zhuǎn)角相對含量呈顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）負相關，與肉彈性指標和β-折疊呈現(xiàn)顯著正相關（P＜0.05）（表2），α-1,4-葡聚糖磷酸化酶促進肉糖原分解，4-α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶將分解的糖基轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)上，且在冰溫條件下這兩種代謝酶的表達量顯著高于冷藏條件，說明冰溫貯藏能為冷鮮肉正常生理代謝提供必要的能量，抑制蛋白質(zhì)分解生成胺基，冰溫條件能較好地保持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，維持冷鮮肉的彈性指標和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。AMP脫氨酶表達量與TVB-N含量、TAC呈極顯著正相關（P＜0.01），與冷鮮肉其他品質(zhì)指標相關性較低，且在冷藏條件下其表達量高于冰溫條件，說明冰溫條件抑制腺苷一磷酸被AMP脫氨酶催化降解成NH3和肌苷酸[25]，有利于冷鮮肉貯藏保鮮。磷酸甘油酸突變酶表達量與TVB-N含量呈極顯著負相關（P＜0.01），與TAC呈極顯著正相關（P＜0.01），與冷鮮肉其他品質(zhì)指標相關性較低，且在冰溫條件下其表達量高于冷藏條件，說明冰溫條件更好地維持冷鮮肉碳代謝，有利于冷鮮肉貯藏保鮮。

2.6.3 應激蛋白

應激蛋白又稱為熱休克蛋白，是在高熱、缺血、缺氧和其他應激條件下由變性蛋白誘導產(chǎn)生的，其表達量能反映細胞受到外界的刺激水平[26-27]。熱休克蛋白beta-7和熱休克蛋白家族B（?。┏蓡T6這兩種熱休克蛋白的表達量與TVB-N含量、TAC呈極顯著正相關（P＜0.01），與β-轉(zhuǎn)角含量呈顯著正相關（P＜0.05），與肉彈性和β-折疊相對含量呈現(xiàn)顯著（P＜0.0 5）或極顯著（P＜0.01）負相關（表2），且在冰溫條件下其表達量低于冷藏條件，說明冰溫條件對藏香豬冷鮮肉細胞刺激水平更低，受到微生物污染更輕，能夠減少蛋白質(zhì)變性酶解，從而維持冷鮮肉的彈性指標和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，達到貯藏保鮮的效果。

2.6.4 鈣調(diào)節(jié)蛋白

肌鈣蛋白是肌肉組織收縮的調(diào)節(jié)蛋白，位于收縮蛋白的細肌絲上，在肌肉收縮和舒張過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，Bekhit等[28]發(fā)現(xiàn)鮮綿羊肉于5～35 ℃真空貯藏過程中，其肌肉中的肌鈣蛋白（肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白T和肌鈣蛋白C）表達量上調(diào)，說明肌肉細胞受到損傷，表明蛋白一定程度發(fā)生降解。肌鈣蛋白T和結(jié)構(gòu)蛋白等細胞骨架蛋白與肉質(zhì)性狀息息相關，已知存在于骨骼肌中[29]。本研究結(jié)果表明，肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白C表達量均與TVB-N含量和β-轉(zhuǎn)角相對含量呈極顯著負相關（P＜0.01），與肉彈性和β-折疊相對含量呈現(xiàn)顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）正相關，且在冰溫條件下其表達量低于冷藏條件，說明藏香豬冷鮮肉細胞在冰溫條件下受到損傷少，肌肉彈性和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)仍然保持較好。鈣蛋白酶抑制蛋白是一種廣泛分布的內(nèi)源性抑制蛋白質(zhì)，能特異地抑制需鈣激活的中性蛋白酶，其分子結(jié)構(gòu)中每個鈣抑素分子均包含1 個前導（L）域和4 個抑制域（I～IV），每個抑制域均可以抑制1 個鈣蛋白酶分子表達[30-31]。鈣蛋白酶抑制蛋白表達量與TVB-N含量和β-轉(zhuǎn)角相對含量呈極顯著負相關（P＜0.01），與肉彈性和β-折疊相對含量呈顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）正相關，且在冷藏條件下該蛋白表達量為冰溫條件下的2.33 倍，說明冷藏條件下發(fā)生更為劇烈的蛋白質(zhì)酶解反應，冷鮮肉由于自身存在免疫系統(tǒng)，會誘導鈣蛋白酶抑制蛋白表達量上調(diào)。上述結(jié)果一定程度上反映藏香豬冷鮮肉在冰溫條件下蛋白質(zhì)分解速率更慢，有利于抑制腐敗微生物增殖和蛋白分解產(chǎn)生胺基，較好地保持肉彈性和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，起到較好的貯藏保鮮效果。

2.6.5 其他蛋白

在其他蛋白中，半胱氨酸和甘氨酸富集蛋白3在細胞胞漿結(jié)構(gòu)組織中起著關鍵的作用，其表達量與TVB-N含量、TAC和β-轉(zhuǎn)角相對含量呈極顯著正相關（P＜0.01），與肉彈性和β-折疊相對含量呈現(xiàn)極顯著負相關（P＜0.01）（表2），且冰溫條件表達量遠低于冷藏條件，一定程度說明冷藏條件冷鮮肉細胞結(jié)構(gòu)變化更大，盡管冰溫和冷藏條件下細胞自身存在免疫系統(tǒng)，但冷藏條件其受到更多逆環(huán)境（相對較高溫度、微生物等）作用，可能會導致半胱氨酸和甘氨酸富集蛋白3表達量更高。

2.7 蛋白質(zhì)印跡驗證結(jié)果

圖 4 冷鮮豬肉在貯藏期間Western Blot分析（A）及不同貯藏溫度條件下Troponin I（B）和Calpastatin（C）差異表達Fig. 4 Western blot analysis (A) of troponin I and calpastatin in chilled fragrant pig meat during storage and their differential expression levels (B, C) at different storage temperatures

為了驗證研究中iTRAQ觀察結(jié)果，本實驗選擇了具有代表性的兩種重疊差異蛋白質(zhì)（Troponin I和Calpastatin）進行蛋白質(zhì)印跡分析。如圖4所示，Western Blot印跡分析結(jié)果表明，與0 d相比，藏香豬冷鮮肉中Troponin I和Calpastatin在16 d時的相對表達量明顯增加，但冷鮮肉在冷藏條件下這兩種蛋白相對表達量更高，這與表2分析結(jié)果高度一致，一定程度上反映本蛋白質(zhì)組學分析方法可靠性較高，同時也說明貯藏溫度顯著影響冷鮮肉蛋白質(zhì)表達，進而造成肉品質(zhì)的差異。

3 結(jié) 論

藏香豬冷鮮肉的冰點溫度為-2.4～-2.5 ℃。貯藏過程中，冰溫條件豬肉TAC、TVB-N含量、彈性及蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化明顯低于冷藏條件，與0 d肉樣品相比，在兩種貯藏條件下共有179 個蛋白質(zhì)豐度發(fā)生了顯著變化，其中共有豐度差異蛋白61 個，這些蛋白質(zhì)主要分為結(jié)構(gòu)蛋白、代謝酶、應激蛋白和鈣調(diào)節(jié)蛋白，這些共有豐度差異蛋白與豬肉理化品質(zhì)及蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)之間正體上具有顯著相關性，可以作為潛在生物標記物來標記豬肉貯藏品質(zhì)優(yōu)劣。初步推測冰溫保鮮機制在于，相對于冷蔵保鮮，冰溫保鮮更好抑制冷鮮肉微生物增長，降低了豬肉蛋白質(zhì)（如Troponin I和Calpastatin）表達量，特別是能降低腐敗微生物對肉蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響，從而較好保持豬肉理化和質(zhì)構(gòu)品質(zhì)。本研究從蛋白質(zhì)分子水平初步解釋了冰溫貯藏保鮮的分子機制，研究成果可為合理設計冷鮮肉貯藏條件提供參考。