病毒與宿主蛋白互作研究技術(shù)進(jìn)展

石金鳳，丁 媛，陳子楊，王 琦，徐新悅，周泓名，馬一丹，焦國財(cái)，李健明,3,5，時(shí) 坤,3,5*，杜 銳,3,4,5*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院,吉林長春 130118；3.梅花鹿藥用資源利用關(guān)鍵技術(shù)研究室,吉林長春 130118；4.動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長春 130118；5.吉林省梅花鹿高效養(yǎng)殖和產(chǎn)品開發(fā)技術(shù)工程研究中心，吉林長春 130118)

蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)執(zhí)行多種重要功能，超過80%的蛋白質(zhì)在執(zhí)行其功能時(shí)會與其他蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，這些相互作用被稱為蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)[1]，通過在兩個或多個蛋白質(zhì)分子間建立的高度特異性的物理接觸，參與多種生物學(xué)過程，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答、細(xì)胞增殖、DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄等。病毒性疾病給全世界養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，了解病毒的感染和致病機(jī)制對于病毒性疾病的防治非常必要。與真核細(xì)胞相比，病毒由有限的蛋白質(zhì)組成，其與宿主蛋白建立了多種相互作用，使其能夠調(diào)控受感染的細(xì)胞，可能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生凋亡、增殖、代謝失衡和遷移率改變等。因此，了解病毒感染期間與宿主蛋白的相互作用有助于進(jìn)一步了解病毒感染和致病機(jī)理，開發(fā)新的治療方法和免疫策略[2]。目前已開發(fā)出多種方法來輔助PPI的研究，每種檢測方法均有自身的優(yōu)勢和局限性，側(cè)重于PPI分析的不同方面，論文綜述了主要的PPI研究方法。

1 表面等離子體共振

表面等離子體共振(surface plasmon resonance，SPR)已成為研究生物分子互作不可替代的技術(shù)之一，廣泛用于研究具有生物學(xué)意義的多種相互作用伙伴，如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA、酶-底物和受體-藥物等[3]。對比傳統(tǒng)熒光、酶和放射性同位素標(biāo)記分析，SPR技術(shù)增強(qiáng)了實(shí)時(shí)、無標(biāo)記分子識別功能，可實(shí)時(shí)監(jiān)測生物分子間相互作用[4]，且靈敏度高、可重復(fù)性強(qiáng)。獲得的PPI動力學(xué)和熱力學(xué)等參數(shù)，對于理解蛋白質(zhì)在不同生理過程中的作用至關(guān)重要。該技術(shù)對樣品需求量少，可與脂質(zhì)和去污劑相容，適合膜蛋白的研究。但高靈敏度也是它的缺點(diǎn)之一，易產(chǎn)生假陽性，建議在使用SPR檢測前，先使用其他方法確定交互作用。另外，分析物與芯片可能發(fā)生非特異性結(jié)合，可通過降低分析物濃度來避免。

隨著SPR成本的不斷降低，該技術(shù)正迅速成為研究蛋白質(zhì)間相互作用、目標(biāo)蛋白質(zhì)-藥物相互作用以及小分子抑制劑的金標(biāo)準(zhǔn)。磷酸化是蛋白質(zhì)重要的翻譯后修飾，與細(xì)胞信號傳導(dǎo)和調(diào)控作用相關(guān)，Wu L等[5]利用SPR實(shí)時(shí)監(jiān)測幾種蛋白激酶對p53蛋白位點(diǎn)特異性磷酸化的作用，監(jiān)測其與MDM2蛋白的相互作用，又對Nutlin-3治療前后癌細(xì)胞中p53-MDM2復(fù)合物和caspase-3水平進(jìn)行監(jiān)測[6]，結(jié)果顯示，Nutlin-3處理后MCF-7和MDA-MB-231癌細(xì)胞的凋亡均分別遵循p53依賴性。表明SPR技術(shù)對于檢測蛋白質(zhì)的磷酸化、揭示蛋白質(zhì)翻譯后修飾機(jī)制和區(qū)分Nutlin-3介導(dǎo)的p53依賴性或p53依賴性凋亡途徑具有廣闊的應(yīng)用前景。研究表明，小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)血凝素(H)蛋白通過與細(xì)胞受體的結(jié)合介導(dǎo)病毒感染細(xì)胞的過程。2018年，Meng X等[7]通過使用SPR檢測出PPRV的血凝素H分別與融合蛋白F、HRA和HRB存在相互作用，與HRA相比，HRB在病毒融合過程中發(fā)揮更重要的作用。2019年，Meng X等再次通過SPR和Co-IP鑒定了與PRRV血凝素蛋白和細(xì)胞受體互作有關(guān)的氨基酸殘基[8]，這些發(fā)現(xiàn)增進(jìn)了人們對PPRV感染機(jī)制的進(jìn)一步了解。

2 免疫共沉淀

免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation，Co-IP)是以抗原和抗體之間的專一性作用為基礎(chǔ)，用于研究體內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法[9]。Co-IP在接近自然的生理?xiàng)l件下檢測蛋白質(zhì)間的相互作用，可檢測微弱或瞬時(shí)的蛋白質(zhì)互作?？贵w選擇靈活，可使用特異性或添加標(biāo)簽的抗體。該測定法的缺點(diǎn)包括不適合大規(guī)模蛋白質(zhì)互作篩選，不能證明兩個靶蛋白的交互是直接發(fā)生的，在結(jié)合過程中可能存在其他分子(蛋白質(zhì)、DNA或RNA)的參與。細(xì)胞裂解物的制備過程中，人為操作也可誘導(dǎo)產(chǎn)生生理上無關(guān)的蛋白質(zhì)相互作用。

作為細(xì)胞內(nèi)寄生物，病毒依賴宿主細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能完成其增殖等過程，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞翻譯機(jī)制來實(shí)現(xiàn)自身的有效復(fù)制。研究表明，核糖體生物發(fā)生因子(ribosome biogenesis factors，RBFs)和核糖體蛋白(ribosomal proteins，RPs)在病毒轉(zhuǎn)錄的選擇性翻譯中發(fā)揮多方面的調(diào)節(jié)作用。Chen Y等[10]利用免疫共沉淀與質(zhì)譜聯(lián)用的方法得出核糖體蛋白L4(ribosomal protein L4，RPL4)與傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)結(jié)構(gòu)蛋白VP3存在相互作用，抑制RPL4表達(dá)后，病毒的VP3蛋白表達(dá)量和病毒滴度均降低，推測RPL4參與IBDV的復(fù)制過程。Kim J等[11]利用Co-IP研究表明，人類免疫缺陷病毒1型(Human immunodeficiency virus type 1，HIV-1)Tat與核糖體蛋白S3(ribosomal protein S3，RPS3)發(fā)生相互作用，在有絲分裂期間通過互作作用，干擾RPS3定位來抑制細(xì)胞增殖。此外，RPS3在細(xì)胞周期的G2/M期與α-微管蛋白相互作用，RPS3的降低會損害微管的拆卸。口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)是口蹄疫的病原體，結(jié)構(gòu)蛋白VP1在FMDV感染期間發(fā)揮重要作用。宿主核糖體蛋白SA(ribosome protein SA，RPSA)是登革熱病毒和經(jīng)典豬瘟病毒感染的病毒受體。Zhu Z等[12]利用Co-IP確定FMDV的VP1與RPSA相互作用，RPSA在FMDV感染期間負(fù)調(diào)節(jié)MAPK途徑的激活，并顯示出抗病毒功能，F(xiàn)MDV VP1與RPSA相互作用，以消除RPSA介導(dǎo)的MAPK途徑激活中的抑制作用來促進(jìn)病毒復(fù)制。以上研究表明，病毒蛋白與細(xì)胞蛋白的相互作用對制定抑制病毒增殖的策略至關(guān)重要。

3 谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶沉淀試驗(yàn)

谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶沉淀試驗(yàn)(Glutathione S-transferase pull-down，GST pull-down)是一種直觀、快速、體外檢測PPI的方法，由“誘餌”(在大腸埃希氏菌或桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的GST標(biāo)簽融合蛋白)和“獵物”組成，獵物可能是已知的純化蛋白或粗提物中的未知蛋白[13]。可通過調(diào)節(jié)純化蛋白的濃度以提高GST pull-down試驗(yàn)的靈敏性，也可通過調(diào)節(jié)誘餌蛋白的濃度評估獵物蛋白的結(jié)合親和力[14]。純化的蛋白質(zhì)可通過在細(xì)菌、酵母和昆蟲細(xì)胞中表達(dá)獲得，避免了降解的風(fēng)險(xiǎn)。該方法的缺點(diǎn)包括獲得純化的蛋白質(zhì)，其克隆、表達(dá)的過程會花費(fèi)大量時(shí)間。GST標(biāo)簽與“誘餌”蛋白融合后，可能會影響蛋白質(zhì)整體的折疊和結(jié)合能力，可能形成包涵體，阻止活性蛋白的純化。誘餌和獵物蛋白的濃度可能與細(xì)胞中的濃度不一致，獵物蛋白與支撐物或GST標(biāo)簽本身發(fā)生非特異性結(jié)合，都可能增加假陽性風(fēng)險(xiǎn)[15]。GST pull-down與Co-IP相似，均使用親和配體捕獲相互作用的蛋白質(zhì)。區(qū)別在于，Co-IP使用固化抗體來捕獲蛋白質(zhì)復(fù)合物，GST pull-down則使用純化并標(biāo)記的蛋白質(zhì)作為“誘餌”結(jié)合相互作用的蛋白質(zhì)。

GST pull-down在病毒-宿主蛋白間的研究中發(fā)揮了重要作用。Song Z等[16]鑒定了豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)M蛋白與真核翻譯起始因子4-alpha(eukaryotic initiation factor 4A2，EIF4A2)之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)抑制EIF4A2表達(dá)會顯著降低病毒滴度并下調(diào)M蛋白的表達(dá)，表明EIF4A2在TGEV復(fù)制中發(fā)揮重要作用。 Yuan P等[17]鑒定了TGEV S1與UBXN1間的相互作用，TGEV感染后會引起IPEC-J2細(xì)胞感染后期UBXN1表達(dá)水平的增加，抑制細(xì)胞中UBXN1表達(dá)會顯著降低病毒滴度并下調(diào)S1的表達(dá)，UBXN1過表達(dá)則會顯著增加病毒拷貝數(shù)。兩者均利用GST pull-down技術(shù)研究TGEV M或S蛋白與腸道細(xì)胞之間相互作用的機(jī)制，為進(jìn)一步理解冠狀病毒的復(fù)制、開發(fā)防控TGEV感染的新型制劑提供了參考。

4 酵母雙雜交技術(shù)

1989年，Song和Fields首次提出酵母雙雜交(Yeast two hybrid，Y2H)技術(shù)，其利用重組轉(zhuǎn)錄因子GAL4報(bào)告基因的激活來檢測PPI[18]。GAL4由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(binding domain，BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain，AD)構(gòu)成，BD和AD分別是具有獨(dú)立功能的結(jié)構(gòu)域，BD可與上游激活序列UAS結(jié)合，AD能激活UAS下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄[19]。將誘餌蛋白(X)融合到BD載體上，獵物蛋白(Y)融合到AD載體上，當(dāng)誘餌蛋白與獵物蛋白發(fā)生互作時(shí)，BD和AD也會隨之牽引靠近，恢復(fù)它的功能，激活下游報(bào)告基因的表達(dá)，表達(dá)報(bào)告基因，通過重構(gòu)分裂轉(zhuǎn)錄因子活性的能力來檢測兩種蛋白質(zhì)的相互作用。

Y2H方法簡單、體系成熟、成本低，可有效檢測弱或瞬態(tài)的二元相互作用，但不能提供互作結(jié)構(gòu)域的精確信息[20]。該系統(tǒng)靈活性強(qiáng)，可用于大規(guī)模PPI篩選，也可用于特定小規(guī)模實(shí)驗(yàn)室PPI的研究[21]。其測定的PPI是在胞內(nèi)進(jìn)行的，避免了與細(xì)胞裂解有關(guān)的影響。但Y2H技術(shù)要求誘餌-BD和獵物-AD融合蛋白靶向酵母核，可能無法檢測到細(xì)胞核外的蛋白互作，目前開發(fā)了基于分離半泛素融合的膜系統(tǒng)酵母雙雜交解決了此問題[22-23]。也有研究表明，Y2H的假陽性、假陰性率偏高，建議通過其他方法輔助驗(yàn)證[24]。

Y2H技術(shù)對于多種不同蛋白質(zhì)具有很高的通用性，適合實(shí)驗(yàn)室的篩選研究。鄭博偉[25]利用Y2H篩選出了12種與腸道病毒HY12毒株結(jié)構(gòu)蛋白VP1互作的宿主蛋白，為研究VP1蛋白在病毒入侵機(jī)體過程中發(fā)揮的作用，最終為闡明腸道病毒感染機(jī)制奠定基礎(chǔ)。張?zhí)m橋等[26]研究了胞內(nèi)勞森菌(Lawsoniaintercellularis，LI)外膜蛋白LI0902與豬腸上皮細(xì)胞的相互作用，篩選出3種互作蛋白，為揭示增生性腸炎的發(fā)病機(jī)理提供了線索。產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)物β2毒素在仔豬腸炎中起關(guān)鍵作用，曾秀等[27]為研究該毒素侵入宿主細(xì)胞的作用機(jī)制，利用Y2H技術(shù)篩選鑒定了與β2毒素相互作用的豬腸上皮細(xì)胞蛋白半乳糖凝集素(galectin-1，LGALS1)，為研究β2毒素的致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。研究表明，真核延伸因子1A(eukaryotic translation elongation factor 1A，eEF1A)不僅參與翻譯過程，還可阻止細(xì)胞凋亡并促進(jìn)病毒復(fù)制，參與多種病毒的轉(zhuǎn)錄、翻譯、復(fù)制等過程[28]。利用Y2H系統(tǒng)，Zhang Z等[29]篩選出FMDV 2B與真核延伸因子1 eEF1G亞基的C末端區(qū)域的氨基酸208-437相互作用，此發(fā)現(xiàn)有助于闡明FMDV感染和復(fù)制的機(jī)制。Li S等[30]也利用該技術(shù)確認(rèn)宿主蛋白eEF1A與豬瘟病毒NS5A間的相互作用，eEF1A對該病毒的增殖發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。以上研究表明，eEF1A蛋白不僅可能在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，在病毒感染過程中也可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。

5 其他篩選蛋白互作方法的研究進(jìn)展

1985年，Smith G P首次提出噬菌體展示技術(shù)(phage display technology)[31]，該技術(shù)廣泛用于體外靶向特異性肽、蛋白質(zhì)、抗體等篩選[32]。與其他檢測技術(shù)相比，噬菌體富集提高了鑒定未知誘餌結(jié)合多肽的效率、準(zhǔn)確性和靈敏度?；诩?xì)菌開放閱讀框(open reading frame，ORF)的噬菌體展示技術(shù)的主要缺點(diǎn)是噬菌體表面展示的蛋白質(zhì)缺乏適當(dāng)?shù)姆g后修飾，糖基化依賴性蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用,可能無法通過ORF噬菌體展示技術(shù)鑒定。

共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)廣泛用于PPI研究。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)中的供體熒光團(tuán)處于激發(fā)態(tài)時(shí)可將其激發(fā)能非輻射地轉(zhuǎn)移到相鄰的受體熒光團(tuán)上，從而導(dǎo)致受體發(fā)射其特征熒光[33]。與生物化學(xué)方法相比，F(xiàn)RET以光學(xué)方式進(jìn)行，對活細(xì)胞幾乎無損傷。生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(bioluminescence resonance energy transfer，BRET)與FRET原理相同，均對1 nm～10 nm范圍內(nèi)的供體和受體偶極子高度敏感，可監(jiān)測分子間產(chǎn)生的各種生化活動，如蛋白質(zhì)間的相互作用、構(gòu)象變化、細(xì)胞內(nèi)的離子濃度和酶活性，可檢測到有關(guān)互作蛋白的親和力、活化能和動力學(xué)等數(shù)據(jù)。BRET使用生物發(fā)光技術(shù)，不需要供體使用激發(fā)光源及相應(yīng)系統(tǒng)，比FRET更具優(yōu)勢。熒光蛋白對局部環(huán)境(pH、離子濃度、氧化和溫度)的變化敏感。供體和受體偶極子之間的方向可能影響信號傳輸[34]，造成假陰性，熒光標(biāo)簽有時(shí)會影響亞細(xì)胞位置和蛋白質(zhì)構(gòu)象。此外，所需設(shè)備昂貴，不易在實(shí)驗(yàn)室普及。

鄰近連接技術(shù)(proximity ligation assay，PLA)可用于高度特異性、靈敏性地研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的互作，與僅顯示蛋白質(zhì)共定位的傳統(tǒng)免疫細(xì)胞化學(xué)方法不同，其使用熒光探針可視化PPI過程[35]。PLA使用兩種抗體識別同一蛋白的不同表位，增加蛋白特異性。試驗(yàn)材料簡單、成本低，僅需要兩種不同物種的靶標(biāo)特異性抗體(如鼠源和兔源)和特定寡核苷酸共價(jià)連接的一組二抗，即可檢測內(nèi)源性蛋白質(zhì)之間相互作用[36]。但抗體和探針結(jié)合其靶標(biāo)過程需要對細(xì)胞進(jìn)行透化處理，會破壞細(xì)胞樣品的活性。

6 展望

在病毒感染過程中，病原體和宿主蛋白都在不斷競爭結(jié)合伴侶。一方面，研究表明，檢測病毒與宿主之間的PPI，可鑒定出病毒感染所需的宿主因子，有助于建立對病毒感染機(jī)制的進(jìn)一步理解。另一方面，可鑒定出對病毒感染具有重要意義的宿主蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)更有效的潛在藥物靶標(biāo)去預(yù)防或治療病毒性疾病。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域研究的飛速發(fā)展，已開發(fā)出多種有效方法來檢測蛋白質(zhì)間的相互作用。生物物理方法隨著科學(xué)儀器的改進(jìn)而不斷更新，在研究PPI的流體動力學(xué)和熱力學(xué)方面顯示出良好的性能；生化方法(如Co-IP)常與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用，用于鑒定目標(biāo)蛋白的結(jié)合伴侶；基因組學(xué)幫助構(gòu)建了基因組規(guī)模的cDNA和ORF文庫，Y2H、噬菌體展示和蛋白質(zhì)微陣列等高通量遺傳方法，促進(jìn)了大規(guī)模的PPI研究。但所有研究方法都存在其自身的優(yōu)勢和局限性，可能導(dǎo)致在檢測過程中出現(xiàn)假陽性或假陰性，因此建議將多種方法聯(lián)合使用對PPI進(jìn)行驗(yàn)證，以產(chǎn)生可靠的結(jié)果，如通過遺傳方法篩選潛在PPI后，通過生物化學(xué)或生物物理方法進(jìn)一步分析驗(yàn)證。隨著科學(xué)研究水平的提高和科研能力的不斷提升，在不久的將來，可能不需要添加標(biāo)簽、標(biāo)記和固相等額外介質(zhì)，就能簡單、高效地獲得有關(guān)病毒-宿主蛋白相互作用的相關(guān)數(shù)據(jù)，進(jìn)一步加速病毒感染機(jī)制的研究。