番鴨細(xì)小病毒和鴨3型腺病毒的分離鑒定及其全基因組序列分析

張 瑞，陳長(zhǎng)福，劉榮昌，程龍飛，傅光華，施少華，陳紅梅，萬春和，傅秋玲，黃 瑜*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建福州 350013；2.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)，福建福州 350002；3.龍巖市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，福建龍巖 364000)

番鴨細(xì)小病毒病是由番鴨細(xì)小病毒(Muscovy duck parvovirus，MDPV)引起的一種傳染性疫病，由我國(guó)學(xué)者林世棠等[1]首次報(bào)道。MDPV主要侵害3周齡以內(nèi)的雛番鴨，患病鴨表現(xiàn)以呼吸困難、厭食、腹瀉等為特征的臨床癥狀[2]。但自2008年以來，在我國(guó)安徽、山東、河北、江蘇、湖南等多地的鴨場(chǎng)流行一種新型番鴨細(xì)小病毒(new genotype Muscovy duck parvovirus，NMDPV)，其宿主范圍更廣，涉及番鴨、半番鴨、中國(guó)臺(tái)灣白改鴨等多個(gè)品種。該病感染鴨后主要可以造成鴨喙萎縮變短和生長(zhǎng)不良，發(fā)病率介于10%～100%，致死率為2%～10%，殘?zhí)月士筛哌_(dá)80%，給我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。

禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAV)屬于禽腺病毒科(Adenoviridae)禽腺病毒屬(Aviadenovirus)，是一類侵害禽類的病毒群。根據(jù)其抗原結(jié)構(gòu)不同分為3個(gè)群，即Ⅰ群禽腺病毒(禽腺病毒屬，Aviadenovirus)、Ⅱ群禽腺病毒(唾液腺病毒屬，Siadenovirus)和Ⅲ群腺病毒(腺胸腺病毒屬，Atadenovirus)[5]。鴨3型腺病毒(Duck adenovirus 3，DAdV-3)屬于Ⅰ群腺病毒屬成員，感染鴨后主要以肝臟的腫大、出血和壞死為特征，是近年來鴨群中的新發(fā)疫病[6]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 廣東省湛江市某鴨場(chǎng)飼養(yǎng)的20日齡發(fā)病雛番鴨。

1.1.3 主要儀器 高速離心機(jī)，Gene公司產(chǎn)品；PCR儀、電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)(Versa Doc 2000)，Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離 無菌采集送診鴨的腦及肝臟組織，將肝臟和腦組織無菌接種于不同培養(yǎng)基平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h～48 h，觀察有無細(xì)菌生長(zhǎng)。

1.2.2 RT-PCR檢測(cè) 無菌采集病死鴨肝臟、脾臟、胰腺等組織，用于鴨常見病毒RT-PCR檢測(cè)，參照文獻(xiàn)[7-8]，對(duì)處理后臨床樣品進(jìn)行H9亞型禽流感病毒、新城疫病毒、鴨肝炎病毒、禽坦布蘇病毒、水禽細(xì)小病毒、鴨3型腺病毒、禽4型腺病毒等鴨常見病毒進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。

1.2.3 病毒分離鑒定 將采集的組織剪碎、勻漿，加入PBS制成1∶5組織懸液，反復(fù)凍融3次，6 000 r/min離心10 min，加雙抗作用30 min后，用0.22 μm濾器過濾，過濾后的勻漿液分2份，1份以0.2 mL/枚尿囊腔接種10日齡番鴨胚分離MDPV，連續(xù)觀察7 d，無菌收集死亡鴨胚尿囊液，盲傳4代，收集尿囊液，標(biāo)記為GD-1。另1份加入NMDPV高免血清后接種番鴨胚成纖維細(xì)胞，每日觀察1次，于72 h后收獲細(xì)胞，連續(xù)盲傳6代，標(biāo)記為GD-2；對(duì)收獲病毒液按照1.2.2方法，進(jìn)行鴨常見病原檢測(cè)。

1.2.4 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 3日齡番鴨42只，隨機(jī)分成3組，每組14只。第1組為GD-1感染組，每只腿部肌肉注射0.5 mL GD-1病毒液；第2組為GD-2感染組，每只腿部肌肉注射0.5 mL GD-2病毒液；對(duì)照組腿部肌肉注射0.5 mL無菌生理鹽水。相同飼養(yǎng)管理?xiàng)l件隔離飼養(yǎng)14 d，每日觀察，對(duì)病死鴨進(jìn)行剖檢，采集病死鴨病變組織，按1.2.2方法進(jìn)行鴨常見病原檢測(cè)。

1.2.5 病毒全基因組擴(kuò)增 按照Easy Pure Viral DNA/RNA提取試劑盒說明，提取樣品中病毒核酸。參照文獻(xiàn)說明，利用兩組特異性引物分別擴(kuò)增MDPV和DAdV-3的全基因組[9-10]。獲得的DNA樣品用Easy Script One-Step PCR Super Mix試劑盒按說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，2株病毒的PCR反應(yīng)均按50 μL體系進(jìn)行擴(kuò)增：2×EasyTaqPCR Super Mix 25μL，ddH2O 17.5 μL，上、下游引物各1.25 μL，DNA模板5 μL。MDPV PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 60 s，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。DAdV PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 90 s，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送福州鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序，利用SeqMan軟件組裝DAdV-3和MDPV分離株的基因組，獲得了2株病毒的全基因組序列，將DAdV-3分離株命名為GDZJ201901，MDPV分離株命名為GDZJ1901，將獲得的全基因組序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得的GenBank數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)分別為MN923205(GDZJ201901)和MN824419(GDZJ1901)。

1.2.6 遺傳進(jìn)化樹構(gòu)建和MDPV分離株重組分析 利用MegAlign軟件分別對(duì)GDZJ1901株和GDZJ201901株進(jìn)行同源性比對(duì)分析。采用MEGA5.05程序構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。重組分析軟件SimPlot version 3.5.1和RDP4 v.4.43用于檢測(cè)GDZJ1901株可能發(fā)生的重組事件。本研究所選取的參考毒株信息見表1和表2。

表1 本研究選取的腺病毒參考株

表2 本研究選取的細(xì)小病毒參考株

2 結(jié)果

2.1 發(fā)病情況、臨床癥狀和剖檢病變

2019年9月，廣東省湛江市某鴨場(chǎng)飼養(yǎng)的雛番鴨群于15日齡左右開始發(fā)病，發(fā)病鴨起初表現(xiàn)為精神沉郁，采食量下降，張口呼吸；感染后期可見腹瀉，拉黃白色稀便，部分鴨呈急性死亡。發(fā)病率約為50%，至20日齡，病死率高達(dá)40%，期間使用多種抗生素治療無效。對(duì)病鴨進(jìn)行剖檢主要可見：肝臟出血，部分鴨肝臟表面可見大量彌漫性白色壞死點(diǎn)，呈現(xiàn)肝黃化或者白化；脾臟腫大出血；肺淤血；腎臟腫大、出血；胰腺出血、表面可見白色針尖狀壞死點(diǎn)；膽囊腫大、膽汁充盈。

2.2 細(xì)菌分離結(jié)果

所接種平板均未見菌落生長(zhǎng)，因此可排除細(xì)菌感染。

2.3 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

對(duì)臨床樣品進(jìn)行H9亞型禽流感病毒、新城疫病毒、鴨肝炎病毒、禽坦布蘇病毒、水禽細(xì)小病毒、鴨3型腺病毒、禽4型腺病毒等鴨常見病原檢測(cè)，結(jié)果僅水禽細(xì)小病毒(圖1)和DAdV-3為陽性(圖2)，其余病原檢測(cè)均為陰性。初步判斷該病例為DAdV-3與MDPV共感染。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.番鴨細(xì)小病毒陽性對(duì)照；2～5.臨床樣品；6.陰性對(duì)照

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.鴨3型腺病毒陽性對(duì)照；2～5.臨床樣品；6.陰性對(duì)照

2.4 病毒分離結(jié)果

收集接種后死亡鴨胚尿囊液，對(duì)收集尿囊液和胚體進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果均為MDPV陽性；接種的細(xì)胞于第3天出現(xiàn)病變，RT-PCR檢測(cè)顯示其僅為DAdV-3陽性。

2.5 動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)上述分離病毒肌肉注射3日齡番鴨，結(jié)果顯示，GD-1感染組于攻毒后第3天開始出現(xiàn)癥狀，共死亡4只，死亡率為28.6%；GD-2感染組于攻毒后第4天開始出現(xiàn)癥狀，共死亡3只，死亡率為21.4%；對(duì)照組無異常現(xiàn)象。分別采集2個(gè)組病死鴨肝臟等組織進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果GD-1感染組為MDPV陽性，GD-2感染組為DAdV-3陽性。

2.6 全基因組序列分析

2.6.1 DAdV分離株全基因組序列分析 DAdV分離株全基因組長(zhǎng)度為43 860 bp，含27個(gè)開放閱讀框(ORF)，與其他腺病毒相似。同源性分析表明，GDZJ201901株與4株DAdV-3分離株(AHAQ13、GDMM10、CH-GD-12-2014、ZJJH07)有近100%(99.89%～99.91%)的核苷酸同源性，與上述4株DAdV-3分離株在Hexon、fiber1和fiber2基因分別有著99.3%～100%、98.9%～99.04%和99.93%的核苷酸同源性，然而與DAdV-2代表株GR株的Hexon基因的核苷酸同源性僅為77.12%。GDZJ201901株的hexon、fiber基因與GR株的序列同源性分析表明，新分離株與GR株的最大差異是新分離的DAdV含有fiber1和fiber2基因，而GR株只有1個(gè)fiber基因，這是區(qū)分DAdV-3和DAdV-2的重要依據(jù)。對(duì)分離到的DAdV繪制了全基因進(jìn)化樹(圖3)，分析表明其與4株DAdV-3屬同一進(jìn)化分支。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明了新分離的腺病毒是DAdV-3。

圖3 DAdV分離株全基因組遺傳進(jìn)化分析

2.6.2 MDPV分離株全基因組序列分析 MDPV分離株命名為GDZJ1901，全基因組長(zhǎng)度為5 067 bp，G+C含量為45.69%。GDZJ1901株末端重復(fù)倒置序列長(zhǎng)度為382 bp，序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)ITR區(qū)有個(gè)別堿基對(duì)的缺失，但均處在互補(bǔ)位置，不影響其他堿基互補(bǔ)配對(duì)形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。GDZJ1901包含2個(gè)大的開放閱讀框(ORF)，左側(cè)的ORF編碼NS1、NS2蛋白，包含627個(gè)氨基酸；右側(cè)的ORF編碼VP1、VP2、VP3蛋白，包含732個(gè)氨基酸，對(duì)表面蛋白潛在糖基化位點(diǎn)分析后發(fā)現(xiàn)，在NS1中有4個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，分別位于150-153 aa、225-228 aa、360-363 aa、433-463 aa，在VP1中也有4個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，分別位于219-222 aa、331-334 aa、582-585 aa、703-705 aa。將本分離株和GenBank登錄的MDPV和GPV代表株進(jìn)行核苷酸同源性比較，結(jié)果表明，GDZJ1901與數(shù)據(jù)庫中的MDPV分離株的同源性高達(dá)98.1%～99.51%，其中與福建的MDPV分離株M8株的核苷酸同源性最高，為99.51%，與鵝源GPV分離株的核苷酸同源性在84.3%～85.6%之間。將本分離株與MDPV和GPV代表株利用MEGA5.0繪制遺傳進(jìn)化樹(圖4)。結(jié)果顯示，GDZJ1901株與5株MDPV分離株處于同一進(jìn)化分支，其余番鴨源和鵝源細(xì)小病毒處于另一分支。綜合以上數(shù)據(jù)，可判斷新分離株GDZJ1901為MDPV。

圖4 MDPV分離株全基因組遺傳進(jìn)化分析

2.6.3 MDPV分離株重組分析 經(jīng)Simplot 3.5.1和RDP4軟件對(duì)GDZJ1901株基因組進(jìn)行重組分析，結(jié)果顯示在其基因組的2個(gè)位置檢測(cè)到明顯的重組信號(hào)(圖5)。GDZJ1901株以經(jīng)典MDPV YY株為骨架，第1個(gè)重組信號(hào)產(chǎn)生在P9啟動(dòng)子區(qū)(421-613)，由MDPV YY株與GPV鵝胚化活疫苗株SYG61v之間發(fā)生重組；第2個(gè)重組信號(hào)產(chǎn)生在VP3區(qū)域(3 119-4 249)，由MDPV YY株與經(jīng)典GPV毒株(包括SYG61v、匈牙利GPV強(qiáng)毒株B、國(guó)內(nèi)GPV強(qiáng)毒株LH)之間發(fā)生重組，以上結(jié)果表明GDZJ1901株是重組型MDPV。結(jié)構(gòu)蛋白基因的重組可以使重組毒株的抗原性發(fā)生改變，可能導(dǎo)致以經(jīng)典MDPV所制的弱毒苗難以產(chǎn)生有效的保護(hù)力。

圖5 MDPV分離株重組分析

3 討論

近年來，有關(guān)水禽細(xì)小病毒基因組間的自然重組和致病性改變的現(xiàn)象被陸續(xù)報(bào)道。最早有學(xué)者在美國(guó)的番鴨群中發(fā)現(xiàn)1株新型MDPV，經(jīng)遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，其雖屬于MDPV亞群，但又與傳統(tǒng)的MDPV毒株處于不同分支[11]。在國(guó)內(nèi)，黃瑜等[12]發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了在基因組和致病性上與經(jīng)典MDPV均有較大差異，可致患鴨發(fā)生“短喙侏儒”的MDPV毒株。Zhu Y等[13]從我國(guó)上海某發(fā)病雛番鴨群中首次分離鑒定了重組型MDPV，之后福建等地陸續(xù)報(bào)道了MDPV與GPV發(fā)生重組現(xiàn)象[14-15]。本研究對(duì)分離到的細(xì)小病毒株在全基因水平上進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)其屬于MDPV，且與新型番鴨細(xì)小病毒M8株有較高的同源性，重組分析發(fā)現(xiàn)，GDZJ1901株P(guān)9啟動(dòng)子和編碼結(jié)構(gòu)蛋白的VP3區(qū)域結(jié)合了GPV毒株的相應(yīng)序列，結(jié)合動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果，最終確定其本質(zhì)上是一種基因重組型的新型番鴨細(xì)小病毒。

家禽中DAdV的感染最早要追溯到1976年的荷蘭，其主要是引起蛋雞的產(chǎn)蛋下降綜合征(ESDV)。1977年，DAdV-2的代表株GR株由Bouquet J F等[16]于法國(guó)的患病番鴨群中分離到，但受限于當(dāng)時(shí)的科研條件，其全基因組直到2014年才通過高通量測(cè)序獲取。2014年，周鎮(zhèn)海[17]從廣東地區(qū)20日齡～30日齡番鴨表現(xiàn)為精神沉郁，剖檢肝臟黃化和出血的番鴨組織中分離鑒定1株病毒，經(jīng)血凝試驗(yàn)、理化試驗(yàn)、透射電鏡觀察及基因組序列測(cè)定及分析，確定該病病原為DAdV-3，命名為CH-GD-12-2014株。該研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，CH-GD-12-2014株與GR株同源性高達(dá)92.3%，但與GR株不同的是CH-GD-12-2014含有2個(gè)fiber基因，而GR株只有1個(gè)，這是DAdV-2和DAdV-3基因組結(jié)構(gòu)上最大的不同。本次分離到的DAdV與CH-GD-12-2014株相似，與GR株有較高的同源性(93.33%)，且含有2個(gè)fiber基因，結(jié)合遺傳進(jìn)化關(guān)系分析及動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果，確定分離株為DAdV-3。

本研究中動(dòng)物試驗(yàn)的病死率均低于此次的臨床病例，臨床上的高病死率是否與兩種疫病的共感染有關(guān)還需進(jìn)一步研究。隨著養(yǎng)禽業(yè)不斷發(fā)展，個(gè)體散養(yǎng)逐步轉(zhuǎn)變?yōu)榇笠?guī)模、集約化飼養(yǎng)，飼養(yǎng)密度也不斷上升，經(jīng)濟(jì)效益增長(zhǎng)的同時(shí)也加大了疫病流行的風(fēng)險(xiǎn)，且多種疾病共感染的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，給臨床診斷和防治帶來諸多困難。新型MDPV和DAdV-3感染均為近年來我國(guó)鴨群中的新發(fā)疫病，本文首次對(duì)兩者共感染病例的研究進(jìn)行系統(tǒng)報(bào)道，提示臨床上存在重組型的新型MDPV和DAdV-3共感染現(xiàn)象，相關(guān)從業(yè)者需重視對(duì)該病的診斷、防控和研究。