關(guān)于微生物檢測(cè)技術(shù)及其在食品安全中的應(yīng)用研究

◎ 張思怡，聶曉臻，俞方璐

（中檢科（上海）測(cè)試技術(shù)有限公司，上海 201206）

近年來(lái)，在世界各國(guó)及各地區(qū)發(fā)生的微生物性食物中毒事件報(bào)告起數(shù)以及人數(shù)逐年增多，促使食品安全問(wèn)題成為現(xiàn)代化發(fā)展中的重要社會(huì)問(wèn)題。

因此為降低微生物性食品中毒事件，應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步強(qiáng)化安全意識(shí)，注重運(yùn)用先進(jìn)檢測(cè)技術(shù)控制食品質(zhì)量，最大限度的防范微生物污染食品，保證人們的身心健康，促進(jìn)食品市場(chǎng)穩(wěn)定運(yùn)行。

1 微生物檢測(cè)技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的重要性

微生物檢測(cè)是食品安全保障中的重要環(huán)節(jié)，同時(shí)也是判斷食品是否具備食用價(jià)值的根本性指標(biāo)依據(jù)。目前主要檢測(cè)對(duì)象包括蛋制品、奶制品、罐頭、淀粉制品以及食品調(diào)味品等。其大多是人們生活中經(jīng)常食用或使用的食品及配料，一旦其存在微生物污染，則會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生較大的不利影響[1]。因此在相關(guān)食品檢測(cè)中科學(xué)運(yùn)用微生物檢測(cè)技術(shù)是至關(guān)重要的，其有助于檢驗(yàn)食品微生物類(lèi)型與數(shù)量，篩查出不符合質(zhì)量安全標(biāo)準(zhǔn)的食品，對(duì)食品行業(yè)的健康、持續(xù)發(fā)展具有積極意義。

2 食品安全檢測(cè)中微生物檢測(cè)技術(shù)的操作步驟

2.1 樣本采集

采集罐頭食品樣本時(shí)，應(yīng)使用無(wú)菌器械開(kāi)展無(wú)菌操作。根據(jù)不同生產(chǎn)廠家、商標(biāo)、品種、來(lái)源以及生產(chǎn)日期等進(jìn)行分類(lèi)。如按照生產(chǎn)班次進(jìn)行檢測(cè)樣本采集，則需保障每個(gè)班次各品種的采樣基數(shù)需大于3罐。如按照殺菌鍋采樣，則每鍋可采集1罐，且每批每個(gè)品種應(yīng)不少于3罐。當(dāng)對(duì)成批罐頭實(shí)施微生物檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)有變形、膨脹、罐壁裂縫、破損等情況，可結(jié)合實(shí)際確定抽樣數(shù)量。為保障微生物檢測(cè)的有效性，需在采樣后3 h內(nèi)進(jìn)行檢驗(yàn)。

2.2 樣本送檢

送檢食品微生物檢測(cè)樣本時(shí)，應(yīng)當(dāng)合理保存樣本的完整性，不得在送檢過(guò)程中出現(xiàn)變質(zhì)、破碎等。送往實(shí)驗(yàn)室后由相關(guān)送檢人員規(guī)范填寫(xiě)單據(jù)，并交由專(zhuān)業(yè)檢測(cè)人員開(kāi)展實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)活動(dòng)。

2.3 樣本處理及檢驗(yàn)

當(dāng)樣本送到實(shí)驗(yàn)室后，需對(duì)罐頭樣本進(jìn)行一定的處理，從而便于開(kāi)展檢驗(yàn)檢測(cè)。即是針對(duì)新鮮的固體及液體罐頭樣本進(jìn)行搗碎、均勻后開(kāi)展檢驗(yàn)。如對(duì)樣本實(shí)施冷凍，需及時(shí)進(jìn)行解凍再采用對(duì)應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)。具體步驟則是取2管肉湯或溴甲酚紫葡萄糖肉湯、2管肝片肉湯或者剛經(jīng)煮沸并迅速冷卻的皰肉培養(yǎng)基等。開(kāi)展接種檢樣，通常情況下控制接種量在液體樣本的1～2 mL、固體樣本則在1～2 g即可。如固體與液體樣本同時(shí)存在，可各取一半。在實(shí)施接種后放置于37 ℃環(huán)境中，并進(jìn)行需氧菌培養(yǎng)檢查以及厭氧菌培養(yǎng)檢查。在將檢樣涂片以及革蘭氏染色后實(shí)施鏡檢[2]。

2.4 結(jié)果報(bào)告

完成微生物檢驗(yàn)后，如果所有需氧和厭氧培養(yǎng)基管內(nèi)未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)，則判斷無(wú)菌試驗(yàn)合格，無(wú)需開(kāi)展病原菌檢測(cè)，表明罐頭食品安全通過(guò)微生物檢測(cè)，無(wú)污染現(xiàn)象。如果需氧培養(yǎng)基存在有細(xì)菌生長(zhǎng)現(xiàn)象，并在涂片中觀察到細(xì)菌，應(yīng)針對(duì)檢樣開(kāi)展進(jìn)一步的致病性球菌檢驗(yàn)和腸道致病菌檢驗(yàn)。如果厭氧培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌生長(zhǎng)，涂片也存在細(xì)菌，則需對(duì)檢驗(yàn)進(jìn)行肉毒梭菌檢驗(yàn)、魏氏梭菌檢驗(yàn)等，準(zhǔn)確判斷樣本的微生物污染類(lèi)型。當(dāng)檢測(cè)結(jié)果出來(lái)后，由專(zhuān)門(mén)人員負(fù)責(zé)整理結(jié)果信息，規(guī)范填寫(xiě)檢測(cè)報(bào)告，經(jīng)審核后蓋章，移交到分析評(píng)定人員，以此完成對(duì)罐頭食品的微生物檢測(cè)，準(zhǔn)確評(píng)估食用價(jià)值。

3 微生物檢測(cè)技術(shù)在食品安全中的具體應(yīng)用

3.1 食源性病原菌免疫學(xué)快速檢測(cè)技術(shù)及其應(yīng)用

3.1.1 FAT技術(shù)

FAT技術(shù)是指熒光抗體檢測(cè)技術(shù)，其原理是依據(jù)抗原抗體反應(yīng)，通過(guò)利用熒光素對(duì)抗原或者抗體進(jìn)行標(biāo)記，然后在與待測(cè)樣本中含有的抗原抗體相結(jié)合，借助熒光顯微鏡進(jìn)行觀察判斷。該技術(shù)在實(shí)施過(guò)程中可分為直接法和間接法，直接法是指在待測(cè)樣本中直接添加已知的熒光素標(biāo)記的抗血清，通過(guò)洗滌后可在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。間接法即是在待測(cè)樣品中加入已知細(xì)菌的特異抗體，與待測(cè)樣品進(jìn)行反應(yīng)和洗滌，加入熒光標(biāo)記的第二和第三抗體，能夠比較準(zhǔn)確地獲取微生物檢測(cè)結(jié)果。該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)則是簡(jiǎn)單快捷，但樣品優(yōu)勢(shì)會(huì)受到非特異性熒光的干擾，導(dǎo)致結(jié)果準(zhǔn)確性受到影響[3]。

3.1.2 EIA技術(shù)

EIA技術(shù)是指免疫酶技術(shù)，其是利用酶標(biāo)記抗原抗體，以此檢測(cè)相應(yīng)抗原抗體的免疫技術(shù)。在當(dāng)前食品安全檢測(cè)中，常用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，其是將抗原抗體吸附在固相載體上，通過(guò)加入酶標(biāo)記的抗體和抗原后，再加入酶的底物，從而在固相載體上實(shí)現(xiàn)反應(yīng)。這一過(guò)程能夠生成有色產(chǎn)物，其產(chǎn)量與加入的抗原存在密切關(guān)系。因此根據(jù)產(chǎn)物的顏色深淺等可開(kāi)展定量測(cè)定，在實(shí)踐中具有檢測(cè)速度快、特異性較強(qiáng)、準(zhǔn)確性高等優(yōu)勢(shì)。

3.1.3 具體應(yīng)用

比如針對(duì)鮮牛奶、原料奶以及蝦仁、熟食制品等進(jìn)行微生物檢測(cè)時(shí)，先科學(xué)處理被檢抗原，可應(yīng)用食源性病原菌免疫學(xué)快速檢測(cè)技術(shù)。直接取選擇性增菌液SC或者M(jìn)肉湯1 mL，經(jīng)過(guò)離心收集沉淀后，開(kāi)展洗滌、懸浮、沸水浴20 min后，放置在4 ℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩Ｔ跈z測(cè)過(guò)程中，將處理的抗原取50 μL，加入酶標(biāo)板孔內(nèi)。調(diào)節(jié)溫度到50～60 ℃進(jìn)行烘干，再使用冷甲醇固定5～10 min，洗滌后添加適當(dāng)濃度的酶標(biāo)單抗混合液，每孔控制50 μL/孔，并在37 ℃水浴孵育2 h。對(duì)每塊備件樣本板設(shè)置陽(yáng)性、陰性和空白對(duì)照孔，有助于判斷沙門(mén)氏菌。

3.2 食源性病原菌分子生物學(xué)快速檢測(cè)技術(shù)及其應(yīng)用

3.2.1 基因探針技術(shù)

微生物檢測(cè)中的基因探針技術(shù)是一種利用同位素、生物素以及地高辛等開(kāi)展檢測(cè)標(biāo)記的方法，基于標(biāo)記一小段已知序列的寡聚核苷酸，在分子雜交與目的基因相結(jié)合，根據(jù)雜交信號(hào)尋找目的基因。按照探針標(biāo)記方式可分為同位素和非同位素兩種方法。其中同位素標(biāo)記探針具有較強(qiáng)的特異性，對(duì)病原微生物的檢測(cè)速度較快。不過(guò)該方式具有一定的放射性污染，而且核酸探針的半衰期相對(duì)較短，在檢測(cè)工作中需要做好安全防護(hù)。非同位素則能夠有效解決同位素檢測(cè)存在的不足，且對(duì)人體無(wú)危害，不受紫外線照射影響等，應(yīng)用效果較好[4]。

3.2.2 PCR技術(shù)

PCR技術(shù)是指多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)，其是指利用體外酶合成特異DNA片段，并經(jīng)歷高溫變性、低溫退火、適溫延伸等周期，促使DNA迅速擴(kuò)增。同時(shí)該技術(shù)能夠?qū)⒛康幕蚧駾NA片段在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增到百萬(wàn)倍，并可利用肉眼直接觀察，極大地縮短了檢測(cè)時(shí)間。在實(shí)踐運(yùn)用中具有較強(qiáng)的特異性、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。

3.2.3 生物芯片技術(shù)

生物芯片技術(shù)是指按照預(yù)定位置固定在固相載體上小面積內(nèi)的千萬(wàn)個(gè)核酸分子所組成的位點(diǎn)陣列。在操作中相關(guān)人員需要先標(biāo)記核酸片段，促使樣品中的互補(bǔ)核酸片段能夠與固相載體上的核酸分子進(jìn)行雜交。通過(guò)利用芯片閱讀儀，能夠比較準(zhǔn)確的檢測(cè)出相應(yīng)的雜交信號(hào)。該技術(shù)在本質(zhì)上是一種高度集成化的反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)，相比于傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)而言，具有自動(dòng)化程度高、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)目標(biāo)分子數(shù)量多、結(jié)果客觀性強(qiáng)等問(wèn)題。不過(guò)目前在食品微生物檢測(cè)中該技術(shù)尚未實(shí)現(xiàn)全面推廣，其是因?yàn)樾酒谱骷夹g(shù)難度大、開(kāi)展樣品制備以及標(biāo)記等較為復(fù)雜[5]。但在未來(lái)發(fā)展中仍有較好的應(yīng)用前景。

3.2.4 具體應(yīng)用

在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，利用核酸探針能快速檢測(cè)李斯特菌、大腸桿菌以及志賀菌等。其可從染色體序列以及質(zhì)粒中直接分離出檢測(cè)沙門(mén)氏菌的探針，但目前受限于技術(shù)以及檢測(cè)環(huán)境等因素，大多只能在實(shí)驗(yàn)室中開(kāi)展檢測(cè)。而多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)在食品安全中對(duì)微生物的檢測(cè)應(yīng)用，可有效檢驗(yàn)食品中存在的沙門(mén)氏菌、肉毒梭狀芽孢桿菌、單核細(xì)胞增多性李斯特桿菌等。該方法對(duì)大腸埃希氏菌的檢測(cè)無(wú)需富集培養(yǎng)，即能夠比較快速、準(zhǔn)確地獲得檢測(cè)結(jié)果。生物芯片技術(shù)在具體應(yīng)用過(guò)程中，能夠一次性檢測(cè)出多種潛在致病菌。而且檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較短，在幾小時(shí)內(nèi)即可完成全部操作步驟。比如通過(guò)引物擴(kuò)增與芯片上的探針雜交，能夠直接檢測(cè)出食品樣品中的致病菌，僅需6 h獲得檢測(cè)結(jié)果[6]。

3.3 食源性致病菌生物傳感器檢測(cè)技術(shù)及其應(yīng)用

對(duì)于食品安全中應(yīng)用微生物檢測(cè)技術(shù)，可采用生物傳感器技術(shù)，其是食源性致病菌檢測(cè)中的重要組成部分。利用含有固定化生物物質(zhì)與合適的換能器進(jìn)行緊密結(jié)合，形成一種分析工具或系統(tǒng)。其中固定化生物物質(zhì)主要包括酶、抗體、細(xì)胞、細(xì)胞器或復(fù)合體等，能夠?qū)⑸盘?hào)順利轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，同時(shí)促使其數(shù)量化。該技術(shù)在實(shí)踐應(yīng)用過(guò)程中，主要是利用致病微生物在呼吸時(shí)所產(chǎn)生的電子生物傳感器，根據(jù)產(chǎn)生的電流大小判斷微生物的濃度，進(jìn)而檢測(cè)出微生物致病菌的含量。該技術(shù)主要應(yīng)用在食品中大腸桿菌、李斯特菌以及沙門(mén)氏菌的檢測(cè)，可在幾分鐘內(nèi)完成檢測(cè)活動(dòng)，檢出限達(dá)到0.1～1.0 ng·mL-1，對(duì)于細(xì)菌毒素、真菌毒素等檢測(cè)具有較好的檢測(cè)效果。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，針對(duì)不同品種的食品選擇適當(dāng)?shù)奈⑸餀z測(cè)技術(shù)，如食源性病原菌免疫快速檢測(cè)技術(shù)、分子生物學(xué)快速檢測(cè)技術(shù)以及致病菌生物傳感器檢測(cè)技術(shù)等，側(cè)重多種技術(shù)的結(jié)合，形成高效的組合檢測(cè)形式，進(jìn)一步加快食品微生物檢測(cè)效率、保證檢測(cè)結(jié)果具有客觀性、可靠性，推動(dòng)食品安全向前發(fā)展，維護(hù)社會(huì)和諧穩(wěn)定。