雷公藤紅素對胃癌細胞體外生長活力及增殖、凋亡基因表達的調節(jié)作用

李佳 楊曉丹 劉永葉

胃癌是我國發(fā)病率最高的消化道惡性腫瘤,由其引起的死亡率居所有惡性腫瘤的第四位。手術切除是目前胃癌的首選治療手段,聯(lián)合術后輔助化療雖然能夠延長患者的生存時間,但患者在術后發(fā)生腫瘤復發(fā)及轉移的幾率仍高達80%,5 年生存率也僅為30%～40%［1,2］。近年來,中藥在惡性腫瘤治療中的價值受到了越來越高的重視,多種中藥具有高效低毒的特點。雷公藤紅素(celastrol,Cel)是在中藥雷公藤中提取得到的天然活性物,屬于醌甲基三萜類化合物,具有廣泛的抗腫瘤活性［3］。已有研究報道,雷公藤紅素對卵巢癌細胞、結腸癌細胞的體外生長具有抑制作用［4,5］,但關于該藥物在胃癌治療中的應用價值尚不明確。為了明確雷公藤紅素用于胃癌治療的潛在價值,本研究具體分析了雷公藤紅素對胃癌細胞體外生長活力及增殖、凋亡基因表達的調節(jié)作用,具體如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 胃癌細胞株BGC823 購自ATCC 公司,DMEM 購自Gibco 公司,FBS 購自杭州四季青公司,MTS 細胞生長活力檢測試劑盒購自Promega 公司,mRNA 表達檢測試劑盒購自北京康為世紀公司。

1.2 實驗儀器 細胞培養(yǎng)箱及離心機購自Thermo 公司,酶標儀及PCR 儀均購自Bio-rad 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞分組及培養(yǎng) BGC823 細胞用含有10%FBS 的DMEM 進行常規(guī)培養(yǎng),每2 天更換1 次培養(yǎng)液,待細胞密度生長至80%左右時用胰蛋白酶進行消化、傳代；取傳代后的第6～10 代細胞進行分組,根據(jù)后期處理不同分為空白對照組(用不含F(xiàn)BS 的DMEM處理)和0.5 μmol/L Cel組(用含有0.5 μmol/L雷公藤紅素的DMEM 處理)、1.0 μmol/L Cel 組(用含有1.0 μmol/L雷公藤紅素的DMEM 處理)、1.5 μmol/L Cel 組(用含有1.5 μmol/L 雷公藤紅素的DMEM 處理)、2.0 μmol/L Cel 組(用含有2.0 μmol/L 雷公藤紅素的DMEM 處理),各6 株。

1.3.2 細胞生長活力的測定 分組的細胞接種在96 孔培養(yǎng)板內,用不同條件處理24 h 后在每個培養(yǎng)孔內加入20 μl MTS 試劑盒檢測液,在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h,取出培養(yǎng)板并震蕩,而后在酶標儀上讀取450 nm波長處的吸光值,以吸光值作為細胞生長活力值。

1.3.3 基因mRNA 表達水平的測定 分組的細胞接種在6 孔培養(yǎng)板內,用不同條件處理24 h 后棄去培養(yǎng)孔內的培養(yǎng)液,用超純RNA 提取試劑盒分離得到細胞內的RNA,用SuperRTcDNA 第一鏈合成試劑盒將細胞內的RNA 反轉錄為cDNA,用UltraSYBR Mixture試劑盒對基因cyclinD1、PI3K、mTOR、β-catenin、p16、PTEN、GSK-3β、Bax、FASL、FAS、Caspase-3、Bcl-2、Livin、Survivin 進行擴增,根據(jù)擴增曲線計算mRNA 相對表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理。計量資料以均數(shù)±標準差()表示,采用t 檢驗；計數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞生長活力比較 空白對照組及0.5、1.0、1.5、2.0 μmol/L Cel 組的細胞生長活力分別為(1.36±0.22)、(1.02±0.16)、(0.83±0.16)、(0.70±0.09)、(0.56±0.08),0.5、1.0、1.5、2.0 μmol/L Cel 組的細胞生長活力均明顯低于空白對照組,2.0 μmol/L Cel 組的細胞生長活力均明顯低于0.5、1.0、1.5 μmol/L Cel 組,差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.2 各組促增殖基因表達及增殖抑制基因表達水平比較 0.5、1.0、1.5、2.0 μmol/L Cel 組中cyclinD1、PI3K、mTOR、β-catenin 的mRNA 表達水平均明顯低于空白對照組,p16、PTEN、GSK-3β 的mRNA 表達水平均明顯高于空白對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；0.5、1.0、1.5、2.0 μmol/L Cel 組 中cyclinD1、PI3K、mTOR、β-catenin 的mRNA 表達水平均呈降低趨勢,p16、PTEN、GSK-3β 的mRNA 表達水平均呈升高趨勢,各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1,表2。

2.3 各組促凋亡基因表達及凋亡抑制基因表達水平比較 0.5、1.0、1.5、2.0 μmol/L Cel 組中Bax、FASL、FAS、Caspase-3 的mRNA 表達水平均明顯高于空白對照組,Bcl-2、Livin、Survivin 的mRNA 表達水平均明顯低于空白對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；0.5、1.0、1.5、2.0 μmol/L Cel 組中Bcl-2、Livin、Survivinn的mRNA 表達水平均呈降低趨勢,Bax、FASL、FAS、Caspase-3 的mRNA 表達水平均呈升高趨勢,各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表3,表4。

表1 各組促增殖基因表達水平比較()

表1 各組促增殖基因表達水平比較()

注：與空白對照組比較,aP＜0.05；與0.5 μmol/L Cel 組比較,bP＜0.05；與1.0 μmol/L Cel 組比較,cP＜0.05；與1.5 μmol/L Cel組比較,dP＜0.05

表2 各組增殖抑制基因表達水平比較()

表2 各組增殖抑制基因表達水平比較()

注：與空白對照組比較,aP＜0.05；與0.5 μmol/LCel 組比較,bP＜0.05；與1.0 μmol/L Cel 組比較,cP＜0.05；與1.5 μmol/L Cel組比較,dP＜0.05

表3 各組促凋亡基因表達水平比較()

表3 各組促凋亡基因表達水平比較()

注：與空白對照組比較,aP＜0.05；與0.5 μmol/LCel 組比較,bP＜0.05；與1.0 μmol/L Cel 組比較,cP＜0.05；與1.5 μmol/L Cel組比較,dP＜0.05

表4 各組凋亡抑制基因表達水平比較()

表4 各組凋亡抑制基因表達水平比較()

注：與空白對照組比較,aP＜0.05；與0.5 μmol/LCel 組比較,bP＜0.05；與1.0 μmol/L Cel 組比較,cP＜0.05；與1.5 μmol/L Cel組比較,dP＜0.05

3 討論

胃癌的發(fā)病率高,但預后不良,5 年生存率低,手術切除聯(lián)合術后輔助化療能夠使患者的生存時間延長,但整體療效仍有極大改進空間。近年來,中藥的抗腫瘤作用受到了越來越多的關注,雷公藤紅素是在中藥雷公藤中提取得到的抗腫瘤活性成分,已經在卵巢癌、結腸癌相關的細胞研究中被證實能夠抑制癌細胞的生長［4,5］。為了明確雷公藤紅素用于胃癌治療的價值,本研究離體培養(yǎng)了胃癌BGC823 細胞株,并用不同劑量的雷公藤紅素進行處理,分析雷公藤紅素處理后的細胞生長活力,提示：不同劑量雷公藤紅素處理后細胞的生長活力均明顯下降,且雷公藤紅素的劑量越大,生長活力受抑制越明顯。這一結果表明雷公藤紅素對胃癌細胞的生長具有顯著的抑制作用,進而提示雷公藤紅素具有治療胃癌的潛在價值。

癌細胞的生長過程與細胞增殖、凋亡等生物學行為密切相關,當增殖基因、凋亡基因表達發(fā)生改變時,細胞增殖和凋亡行為發(fā)生相應變化并對細胞的生長產生影響。胃癌病灶內與癌細胞生長相關的基因變化包括促增殖基因cyclinD1、PI3K、mTOR、β-catenin 及凋亡抑制基因Bcl-2、Livin、Survivin 的高表達［6-8］,增殖抑制基因p16、PTEN、GSK-3β 及促凋亡基因Bax、FASL、FAS、Caspase-3 的低表達［9,10］,上述基因已經被證實在胃癌病灶內發(fā)生了相應的變化。在明確雷公藤紅素對胃癌細胞生長的抑制作用后,本研究進一步分析了雷公藤紅素對胃癌細胞內增殖基因、凋亡基因的調節(jié)作用,旨在明確雷公藤紅素發(fā)揮生長抑制作用的分子機制。

促增殖基因和增殖抑制基因通過調節(jié)細胞增殖來影響細胞生長過程。促增殖基因cyclinD1 的編碼產物能夠與相應激酶結合并促進細胞周期發(fā)展,有利于增強細胞的生長活力；PI3K、mTOR、β-catenin 是cyclinD1 上游的調節(jié)基因,PI3K 活化后能夠使mTOR激活、Wnt 通路活化,則能使β-catenin 激活,mTOR和β-catenin 激活后能夠進入細胞核并啟動cyclinD1的表達。增殖抑制基因p16 能夠直接拮抗cyclinD1的活力并阻礙細胞周期,降低細胞生長活力；PTEN和GSK-3β 分別拮抗PI3K 及β-catenin,PTEN 能夠使PI3K 發(fā)生去磷酸化并阻礙由其介導的細胞生長,GSK-3β 能夠水解β-catenin 并阻礙由其介導的細胞生長。本研究對增殖基因的分析發(fā)現(xiàn)：不同劑量雷公藤紅素處理后細胞中cyclinD1、PI3K、mTOR、β-catenin的mRNA 表達水平降低,p16、PTEN、GSK-3β 的mRNA 表達水平均增加,且雷公藤紅素劑量越大,基因表達的趨勢越明顯。這一結果表明雷公藤紅素能夠使胃癌細胞中促增殖基因表達減少、增殖抑制基因表達增加,進而通過增殖抑制活性來起到生長抑制作用。

促凋亡基因和凋亡抑制基因通過調節(jié)細胞凋亡來影響細胞生長過程。Caspase-3 是細胞凋亡的執(zhí)行分子,上游線粒體途徑和死亡受體途徑能夠通過Caspase-7、Caspase-8 及Caspase-9 來使Caspase-3 發(fā)生活化,進而直接引起細胞凋亡；Bax是線粒體凋亡途徑的促進分子,FAS/FASL 則是死亡受體凋亡途徑的促進分子,通過介導促凋亡活性來抑制細胞生長。Bcl-2、Livin、Survivin是細胞凋亡的抑制分子,Bcl-2 通過拮抗Bax 來起到凋亡抑制作用,Livin、Survivin 則直接通過拮抗多種Caspase 的激活來抑制凋亡。本研究對凋亡基因的分析發(fā)現(xiàn)：不同劑量雷公藤紅素處理后細胞中Bax、FASL、FAS、Caspase-3 的mRNA 表達水平增加,Bcl-2、Livin、Survivin 的mRNA 表達水平均減少,且雷公藤紅素劑量越大,基因表達的趨勢越明顯。這一結果表明雷公藤紅素能夠使胃癌細胞中促凋亡基因表達增加、凋亡抑制基因表達減少,進而通過促凋亡活性來起到生長抑制作用。

綜上所述,雷公藤紅素對胃癌細胞體外生長活力具有抑制作用,調節(jié)增殖及凋亡基因表達是雷公藤紅素發(fā)揮生長抑制作用的分子機制。本研究的結論均來自細胞實驗,今后可進一步在荷瘤鼠模型中驗證雷公藤紅素對胃癌病灶生長的抑制作用。