井岡山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)泥炭蘚來(lái)源共生真菌多樣性和抗菌活性研究

熊鳳姣，劉文杰，丁 壯，唐佳慧，姜淑玲，郭文強(qiáng)

(1.井岡山大學(xué) 醫(yī)學(xué)部，江西 吉安 343009；2.聊城大學(xué) 生物制藥研究院，山東 聊城 252059)

0 引言

進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，耐藥菌尤其多重耐藥菌引起的感染性疾病己成為全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題和嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。具有復(fù)雜耐藥機(jī)制的金黃色葡萄球菌、鮑氏不動(dòng)桿菌等耐藥菌的出現(xiàn)給臨床創(chuàng)傷治療和細(xì)菌感染預(yù)防帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)，這使得耐藥性問(wèn)題成為了臨床上關(guān)注的焦點(diǎn)[1，2]。隨著國(guó)內(nèi)外抗生素的濫用和誤用使得耐藥細(xì)菌和耐藥基因的快速出現(xiàn)，這極大地降低了抗生素對(duì)人和動(dòng)物體內(nèi)多種病原體的治療潛力，嚴(yán)重地威脅著抗生素治療的有效性和人類(lèi)健康[3]。耐藥細(xì)菌所致深度感染已構(gòu)成新世紀(jì)抗感染治療的新挑戰(zhàn)，早在 2011 年世界衛(wèi)生組織就已提出“控制細(xì)菌耐藥的全球性策略”，將細(xì)菌耐藥問(wèn)題上升為全球性的危機(jī)[4]。細(xì)菌耐藥性的迅速上升和新抗生素的不斷減少形成了鮮明對(duì)比，大力研發(fā)以控制耐藥菌感染為主要目標(biāo)的新結(jié)構(gòu)、新靶點(diǎn)和新機(jī)制的新抗生素，是當(dāng)前醫(yī)藥界一個(gè)十分緊迫的任務(wù)[5,6]。然而，與耐藥現(xiàn)狀不相符的是新結(jié)構(gòu)、新機(jī)制的抗菌藥物研發(fā)卻明顯滯后，在后抗生素時(shí)代亟需挖掘新型抗生素類(lèi)藥物來(lái)應(yīng)對(duì)日益嚴(yán)峻的耐藥問(wèn)題。

天然產(chǎn)物因其廣泛的化學(xué)和生物學(xué)多樣性，作為新型分子骨架的重要源泉，已成為潛在的藥物先導(dǎo)化合物寶庫(kù)[7-9]。隨著微生物藥學(xué)研究的日益深入，普通生境來(lái)源微生物資源出新率越來(lái)越低，新生境資源的發(fā)現(xiàn)迫在眉睫?；诂F(xiàn)有的研究方法，從普通生境的微生物資源中已經(jīng)很難獲得突創(chuàng)性的天然產(chǎn)物，藥學(xué)研究的焦點(diǎn)逐漸轉(zhuǎn)向深海、高原、自然保護(hù)區(qū)等具有地域特色的特殊生態(tài)環(huán)境，其已成為新微生物物種和新抗生素類(lèi)先導(dǎo)化合物的資源庫(kù)[10,11]。井岡山國(guó)家自然保護(hù)區(qū)作為一個(gè)極具南方紅壤丘陵特色、又兼顧森林地貌的生態(tài)環(huán)境，其中孕育著豐富的生物群落[12]。井岡山地區(qū)屬于亞熱帶濕潤(rùn)山地氣候，由于常年降水量豐富，在巖壁上形成了大片極具地域特色的泥炭蘚群落。而且泥炭蘚細(xì)胞壁上有加厚螺紋和多孔結(jié)構(gòu)，又具有很強(qiáng)的吸水能力；同時(shí)泥炭蘚自身含有泥炭蘚酸、黃酮、甾醇等多種具有較好的抑菌作用代謝產(chǎn)物[13]。由于巖壁泥炭蘚所形成的特殊“微”生態(tài)環(huán)境，預(yù)示著其中共生的微生物可能具有獨(dú)特的生物合成代謝途徑，能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類(lèi)型新穎的藥物先導(dǎo)化合物。

本研究聚焦特殊生境真菌的獨(dú)特資源優(yōu)勢(shì)，對(duì)泥炭蘚來(lái)源共生真菌進(jìn)行了多樣性和抗菌活性研究，在初步構(gòu)建井岡山地區(qū)微生物資源庫(kù)的同時(shí)，也為尋找具有潛在抗菌活性的共生真菌提供研究策略的參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品。巖壁泥炭蘚樣品(Sphagnum palustre L.)于2018年3月份采集于江西井岡山地區(qū)(羅霄山脈中段，N 26°29′25′′，E 114°7′13′′)。

1.1.2 培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基(真菌2號(hào))：葡萄糖(10 g/L)，麥芽糖(20 g/L)，味精(10 g/L)，甘露糖醇(20 g/L)，KH2PO4(0.5 g/L)，玉米漿(1 g/L)，酵母浸粉(3 g/L)，MgSO4·7H2O(0.3 g/L)和蒸餾水1L，調(diào)節(jié)pH為6.5。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器。微生物操作采用超凈工作臺(tái)SW-CJ-2D(蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司)；無(wú)菌化處理采用高壓滅菌儀KXQ-LS(上海博訊有限公司)；微生物培養(yǎng)采用電熱恒溫培養(yǎng)箱DNP-9082P03Ⅳ(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；濃縮采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-2000A(鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、低溫冷卻液循環(huán)泵DLSK-5/20 (鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、循環(huán)水式多用真空泵SHK-Ⅲ(鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；微生物菌體破碎采用超聲波清洗器KQ-300E；菌種保藏采用超低溫冰箱U410；稱(chēng)量采用電子天平BSA-124SNMR。

1.2 方法

1.2.1 共生真菌分離純化。泥炭蘚樣品經(jīng)過(guò)75%酒精浸泡處理1 min后，充分研碎置于中馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)于28 ℃孵育3-5 D，利用擴(kuò)散板法進(jìn)行菌株的分離純化。從中分離出具有不同形態(tài)的真菌菌落，將其重新接種到新的PDA培養(yǎng)基，并在28 ℃下再孵育培養(yǎng)36 h。重復(fù)該劃線(xiàn)過(guò)程多次，直到獲得單菌落。根據(jù)菌落在PDA培養(yǎng)基上的外觀(顏色、質(zhì)地、邊界類(lèi)型和徑向生長(zhǎng)速率等)，將其分為不同的形態(tài)類(lèi)型，最終得到共生真菌純菌株。

1.2.2 共生真菌種屬鑒定。按照已報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法從該來(lái)源的共生真菌中提取DNA， PCR反應(yīng)采用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴(kuò)增內(nèi)部轉(zhuǎn)錄的間隔區(qū)(ITS)[14-16]。PCR產(chǎn)物由睿博生物科技有限公司(中國(guó)，北京)純化和測(cè)序。通過(guò)BLAST分析將鑒定出的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的其他序列進(jìn)行比較分析，并在ClustalW中進(jìn)行比對(duì)[17]。利用Godinho提出的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)分析驗(yàn)證GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST結(jié)果：對(duì)于查詢(xún)覆蓋率和序列同一性≥98%，該物種種屬可以被確定；對(duì)于覆蓋率和序列同一性在95%-97%之間的可以確定到種，而對(duì)于覆蓋率和序列同一性≤95%，則可以認(rèn)為是新菌[18]。系統(tǒng)進(jìn)化分析則是采用MEGA X進(jìn)行的，N-J法被用來(lái)估計(jì)種屬進(jìn)化距離，其自舉值是根據(jù)1000次重復(fù)計(jì)算而得出的結(jié)果[19-20]。

1.2.3 共生真菌發(fā)酵培養(yǎng)與處理。菌株在含有100 mL真菌2號(hào)液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中28 ℃靜置發(fā)酵培養(yǎng)30 D。發(fā)酵完成后將發(fā)酵混合物用等體積的乙酸乙酯超聲萃取2次。所得萃取液采用減壓蒸餾獲得粗提物后，甲醇重新溶解并用微孔濾膜過(guò)濾除去不溶固體雜質(zhì)。揮干溶劑后稱(chēng)重，并配成5 mg/mL的澄清甲醇溶液，低溫冷藏備用。

1.2.4 指紋圖譜分析。真菌粗提物在HPLC系統(tǒng)(Waters Co.)中分析，該系統(tǒng)包含996型二極管陣列紫外檢測(cè)器和ODS-C18色譜柱(YMC，4.6 mm×250 mm，5 μm)。40 min內(nèi)從5%-100%甲醇梯度洗脫，并在100%的甲醇條件下繼續(xù)洗脫10 min。

1.2.5 抗菌活性測(cè)試。以大腸桿菌、恥垢桿菌、金黃色葡萄球菌、草分支桿菌、枯草桿菌作為抗菌活性指示菌，利用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行共生真菌粗提物抗菌活性篩選與評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)33株真菌粗提物具有較好的抗菌活性。氯霉素(0.1 μg/μL)被用作抗菌活性測(cè)定的的陽(yáng)性對(duì)照。將紙片(直徑10 mm)充分吸收菌株甲醇粗提液后揮干，并放置在鑒定菌瓊脂表面上。于37 ℃下孵育24 h后，測(cè)量五種鑒定菌下紙片的生長(zhǎng)抑制區(qū)直徑。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 井岡山泥炭蘚來(lái)源共生真菌種屬分析

對(duì)該來(lái)源的123株共生真菌進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)，其中包含了子囊菌類(lèi)和接合菌類(lèi)兩大真菌類(lèi)群。依據(jù)Godinho的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的序列與相似菌株進(jìn)行覆蓋率和相似度的比對(duì)。從結(jié)果可知，大部分菌株與其最接近的種屬展示了較高的相似度，初步可以確定該來(lái)源共生真菌歸于16個(gè)屬，即：Aspergillus,Penicillium,Trichoderma,Umbelopsis,Mortierella,Sordariomycetes,Colletotrichum,Mucor,Backusella,Talaromyces,Mortierella,Fusarium,Ascomycota,Epicoccum,Alternaria,Cochliobolus；分屬46個(gè)目，即：onobense,pulvillorum,ochrochloron,simplicissimum,skrjabinii,glabrum,citrinum,aureoviride,odoratum,radulatum,lividum,herquei,oxalicum,rolfsii,isabelline,kananaskense,minutissima,gloeosporioides,circinelloides,abundans,tuberculispora,uredinicola,niger,tenuissimum,ramanniana,asperellum,purpureogenus,amestolkiae,chrysogenum,parasiticus,harzianum,versicolor,hamatum,halotolerans,vinacea,parvispora,tricinctum,sorghinum,perangustum,tenuissima,cladosporioides,spinulosum,gloeosporioides,isabelline以及kusanoi(表1)。

續(xù)表1 由ITS序列鑒定的共生真菌的化學(xué)特征

續(xù)表1 由ITS序列鑒定的共生真菌的化學(xué)特征

將所有共生菌株的ITS序列輸入MEGA X進(jìn)化分析，并通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)來(lái)對(duì)井岡山地區(qū)泥炭蘚共生真菌的親緣性進(jìn)行研究(圖1)。該序列分析涉及123個(gè)核苷酸序列，包括的密碼子位置是1st+2nd+3rd+Noncoding。最優(yōu)樹(shù)的分支長(zhǎng)度總和為4.14882389。分支旁邊顯示了在引導(dǎo)測(cè)試中關(guān)聯(lián)的分類(lèi)單元聚集在一起的復(fù)制樹(shù)的百分比(1000個(gè)重復(fù))[21]。該樹(shù)是按比例繪制，其分支長(zhǎng)度與用于推斷系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的進(jìn)化距離的單位相同。進(jìn)化距離使用Kimura2-parameter法計(jì)算而得來(lái)的，單位是每個(gè)位點(diǎn)的堿基取代數(shù)[20]。對(duì)于每個(gè)序列對(duì)，刪除所有歧義位置，最終數(shù)據(jù)集中共有754個(gè)位置。

2.2 井岡山泥炭蘚來(lái)源共生真菌抗菌活性

將所有菌株采用真菌2號(hào)培養(yǎng)基靜置發(fā)酵30 D后，獲得123個(gè)代謝粗提物。在對(duì)其進(jìn)行五種鑒定菌的抗菌活性篩選后發(fā)現(xiàn)33株共生真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出抗菌活性，其中PenicilliumonobenseJW-13-1、PenicilliumpulvillorumJW-13-16、PenicilliumskrjabiniiJW-13-22表現(xiàn)出廣譜的抗菌活性，同時(shí)PenicilliumoxalicumJW-13-91的代謝產(chǎn)物則針對(duì)金黃色葡萄球菌顯示出了獨(dú)特的抑制活性(表2)。

表2 井岡山地區(qū)泥炭蘚共生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物抗菌活性

R=13-18 mm為中等活性，R=10-13 mm為低/無(wú)活性；氯霉素作為抗菌活性篩選的陽(yáng)性對(duì)照藥。

2.3 活性菌株代謝產(chǎn)物分析與分離純化

通過(guò)對(duì)所有共生真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行HPLC-UV分析后發(fā)現(xiàn)，其有多個(gè)菌株的代謝產(chǎn)物具有特征的指紋圖譜(圖2)。其中菌株P(guān)enicilliumsp.JW-13-9、PenicilliumochrochloronJW-13-35、CladosporiumuredinicolaJW-13-61、PenicilliumspinulosumJW-13-80、PenicilliumchrysogenumJW-13-96、Penicilliumsp.JW-13-107的指紋圖譜中表現(xiàn)出了系列的紫外吸收，預(yù)示著這些共生真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物具有系列的天然產(chǎn)物。

圖2 部分菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的HPLC-UV指紋圖譜

3 結(jié)論

本研究聚焦井岡山自然保護(hù)區(qū)巖壁泥炭蘚自身所處的特殊生態(tài)微環(huán)境，深入挖掘其中共生的微生物的物種多樣性和抗菌活性。該來(lái)源共生真菌因生存環(huán)境的特殊性造就可能具有異于普通生境下真菌的生物合成代謝途徑，預(yù)示著其極具代謝潛能和研究?jī)r(jià)值。

通過(guò)對(duì)其中微生物進(jìn)行分離純化發(fā)現(xiàn)，泥炭蘚共生真菌的種屬覆蓋面較廣，但其中存在較多的仍為青霉屬真菌，占到總分離真菌的58.5%，其他類(lèi)種屬共生真菌占比較小。結(jié)合菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的抗菌活性篩選，我們發(fā)現(xiàn)泥炭蘚的共生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物具有較好的抗菌活性，活性率達(dá)到26.8%。并且發(fā)現(xiàn)3株共生真菌的代謝產(chǎn)物具有廣譜的抗菌活性，多株真菌具有較為獨(dú)特的抗菌譜，同時(shí)，HPLC-UV指紋圖譜分析也發(fā)現(xiàn)多株共生真菌具有特征的系列紫外吸收，這為后期活性天然產(chǎn)物的挖掘研究提供了菌株基礎(chǔ)。本研究的開(kāi)展對(duì)特殊地區(qū)抗耐藥菌抗生素類(lèi)先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)及我國(guó)創(chuàng)新藥物的研發(fā)具有重要的意義。